CN106336451A - 可溶性猪流行性腹泻病毒n蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白及其应用，该蛋白核苷酸序列如SEQ ID No.1，蛋白序列如SEQ ID No.2，其用于猪流行性腹泻病毒抗体检测，具体采用间接ELISA的方法。本发明的猪流行性腹泻病毒N蛋白为可溶性形式，有利于蛋白的纯化，而且能够更好地保证蛋白的生物学活性；本发明提供的检测方法，检测结果稳定，具有良好的重复性，有进一步开发应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）可引起猪流行性腹泻（PED），PED是一种高度接触传染性的病毒性肠道传染病，危害严重。
PEDV属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus），略呈球形，有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突。其基因组为单股正链RNA，全长约28 kb，包括7个ORFs，从5′到3′端依次编码：复制酶（1a、1b）、纤突蛋白（S）、ORF3 蛋白、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。S、E、M和N蛋白为结构蛋白，其中N蛋白与基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA合成过程中发挥重要作用，促进病毒组装和RNA复制体的合成。N蛋白保守性强，可以作为PED早期诊断的重要靶蛋白。
可溶性表达N蛋白的表达明显简化了蛋白的制备与纯化步骤，能够很好地保持蛋白的抗原活性，可以为快速诊断方法的建立、特异性多克隆或单克隆抗体的制备提供必要的实验材料，是本领域研究的热点，具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种猪流行性腹泻病毒N蛋白，其具有可溶性，同时提供该蛋白在猪流行性腹泻病毒抗体检测中的应用，提高猪流行性腹泻的检测效率。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，蛋白序列如SEQID No.2。
进一步的，该可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白由步骤包括：应用TRIzol方法提取PEDV基因组RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板用引物U2 – L2进行PCR，其中U2如SEQ IDNo.3：5’-AATGACCGTGGTGGAATG-3’，L2序列如SEQ ID No.4：5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAG-3’。
本发明同时提供该可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其用于猪流行性腹泻病毒抗体检测。
进一步的，该应用采用间接ELISA方法进行抗体检测，具体过程为：
（1）抗原包被板的制备：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将纯化的重组N蛋白稀释成1.0 μg/mL，加入96孔酶标反应板，每孔100 μL，置37℃孵育1 h后，置4℃过夜；弃去孔中液体，用含质量分数为0.05% Tween-20的PBS洗涤（PBST），洗涤优选采用每孔280 μl，洗涤3次，每次3min，洗涤后甩去孔中液体，最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板；
（2）封闭：加入含质量分数为5%马血清的PBST，100 μL/孔，置37℃下孵育2 h，弃去孔中液体，在吸水材料上用力扣板；
（3）加被检血清及对照血清：取被检血清样品20 μL加入到血清稀释板的各孔内，再将稀释液0.78 mL依次加入各孔内，作1:40倍稀释；混匀后分别取100 μL依次加入抗原包被反应孔中，每份血清加两个孔。每块反应板设阴性血清和阳性血清对照（不稀释）各两孔，每孔100 μL；盖好酶标板置室温反应1h，洗涤同步骤（1）的洗涤方式；
（4）加酶标记抗体：加入PBST稀释的酶标记抗体，100 μL/孔，室温下作用1 h，洗涤同（1）；优选为1:500稀释，抗体选用HRP-羊抗猪IgG；
（5）加底物缓冲液：每孔加新配制的TMB底物溶液100 μL ，室温避光显色15 min；
（6）终止反应 见阳性对照血清孔呈蓝色，阴性对照血清孔无色或基本无色，加入2mol/L 硫酸溶液50 μL/孔，终止反应；
（7）酶标仪测定OD值：在波长450nm读数，15 min内完成；
（8）结果判定：当被检血清的OD值≥0.3 时，判定为阳性；当OD值≤0.3时，判定为阴性。
本发明的猪流行性腹泻病毒N蛋白为可溶性形式，氨基酸序列较短，能够利用有限的长度表达出该可溶性N蛋白，具有结构的高效性。可溶性表达不仅有利于蛋白的纯化，而且能够更好地保证蛋白的生物学活性。该蛋白能够与猪抗PEDV特异性抗体特异性结合，说明重组tN蛋白具有反应原性。纯化的tN蛋白能够诱导小鼠产生针对PEDV的特异性抗体，该抗体能够分别与包被于ELISA板上的PEDV及Vero细胞内的PEDV发生特异性结合，证明重组tN蛋白具有良好的抗原活性，可以作为诊断抗原、免疫原及制备单克隆抗体的基础材料。
该可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白应用于猪流行性腹泻病毒的检测，可以大大提高检测的高效性和灵敏度；本发明筛选出的检测条件，为最佳条件，相互配合能够大大提高检测的P/N值。以重组蛋白代替病毒作为包被抗原不仅节约成本，而且对操作人员安全，无散毒潜在威胁。相同和不同批次蛋白均具有良好的稳定性，检测结果稳定，说明建立的ELISA方法具有良好的重复性，有进一步开发应用价值。
附图说明
图1为ELISA方法的特异性检测结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的附图和具体实施方式，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的表达
（1） tN蛋白基因的扩增 应用TRIzol方法提取PEDV基因组RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板用引物U2 – L2，其中U2：5’-AATGACCGTGGTGGAATG-3’，L2：5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAG-3’，进行PCR，扩增体系为50 µL。扩增条件为：94℃ 3 min；94℃ 45s；58.6℃ 45 s；72℃ 45 s，32个循环；72℃ 10 min，扩增片段大小为705 bp。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，用离心柱型DNA凝胶纯化回收试剂盒回收目的基因。
（2）重组质粒pET32a-PEDV-tN的构建与鉴定 将胶回收的PCR产物及原核表达载体pET32a(+)分别用限制性核酸内切酶BamH I和Xho I消化，纯化回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接PCR产物与pET32a(+)；8~10 h后，将连接产物（pET32a-PEDV-tN）转化DH5α感受态细胞，于37 ℃震摇1 h后，将其涂布于Amp+/LB平板上，37℃培养18~24 h；挑取菌落做PCR鉴定，提取质粒用BamH I和Xho I酶切鉴定；将鉴定为阳性的菌落进行序列测定。
（3） PEDV tN蛋白的表达 取重组质粒pET32a-PEDV-tN转化E.coli BL21感受态细胞，挑取阳性菌落接种到Amp+的2×YT 培养基中，37℃ 230 r/min 振摇培养至对数生长期(OD600 nm= 0.6~ 0.8)时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，于28℃温度下诱导表达5 h。同时设立BL21、转化pET32a(+)空质粒的BL21对照。收集诱导后菌液1 mL，5000 r/min离心5min，取菌体沉淀，用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，检测蛋白的表达。
获得的可溶性PEDV N蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2。
实施例2 猪流行性腹泻病毒抗体检测ELISA方法的建立
（1） 菌液培养 表达抗原蛋白的菌种为BL21-tN，由PEDV tN基因原核表达质粒pET32a-tN转化大肠杆菌BL21（DE3）获得，方法如实施例1。取BL21-tN种子液按培养基体积1%量接种于含氨苄霉素的LB液体培养基中，200 rpm/min，37℃摇床振荡培养1.5～2 h，菌液浓度OD600nm值达到1时，加入1.0 mmol/mL的 IPTG，37℃振荡培养5 h。
（2） 重组蛋白的表达及纯化
将上述收集的细菌样品4℃ 7500 rpm离心15 min收集菌体，按照商品化的重组蛋白纯化系统Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，得重组N蛋白。紫外分光光度计测蛋白浓度，分装，-80℃保存备用。
（3）抗原包被板的制备：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将重组N蛋白稀释成1.0 μg/mL，加入96孔酶标反应板，每孔100 μL，置37℃孵育1 h后，置4℃过夜；弃去孔中液体，用含0.05% Tween-20的PBS洗涤（PBST），每孔280 μl，洗涤3次，每次3 min，洗涤后甩去孔中液体，最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板。
（4）封闭：加入含5%马血清的PBST，100 μL/孔，置37℃下孵育2 h，弃去孔中液体，在吸水材料上用力扣板。
（5）加被检血清及对照血清：取被检血清样品20 μL加入到血清稀释板的各孔内，再将稀释液0.78 mL依次加入各孔内，作1:40倍稀释。混匀后分别取100 μL依次加入抗原包被反应孔中，每份血清加两个孔。每块反应板设阴性血清和阳性血清对照（不稀释）各两孔，每孔100 μL。盖好酶标板置室温反应1h，洗涤同（3）。
（6）加酶标记抗体：加入PBST稀释(1:500)的酶标记抗体（HRP-羊抗猪IgG），100 μL/孔，室温下作用1 h，洗涤同（3）。
（7）加底物缓冲液：每孔加新配制的TMB底物溶液100 μL ，室温避光显色15 min。
（8）终止反应 见阳性对照血清孔呈蓝色，阴性对照血清孔无色或基本无色，加入2mol/L 硫酸溶液50 μL/孔，终止反应。
（9）酶标仪测定OD值：在波长450nm读数，尽量15 min内完成。
（10）结果判定：当被检血清的OD值≥0.3 时，就判定为阳性；当OD值≤0.3时判为阴性。
对比例 间接ELISA最佳工作浓度与工作条件
（1） 最适抗原包被浓度与封闭液 以不同浓度的重组N蛋白包被酶标板，然后分别用7种封闭液封闭。通过方针滴定，筛选最佳抗原包被浓度和封闭液。结果如表1所示，当抗原包被浓度为1μg/mL，以含5%马血清的PBST为封闭液和抗体稀释液检测抗PEDV N抗体时，已知阳性血清的OD450nm值接近于1.0，同时P/N值最高。
*, +指抗PEDV抗体阳性血清；-指抗PEDV抗体阴性血清。
（2）最适包被条件与封闭条件 如表2和表3所示，当将重组N蛋白包被好的酶标板置于37℃下作用1 h后，再转到4℃孵育过夜，按照300 μL/孔的量于37℃下封闭1 h后进行ELISA时，P/N比值最大。该结果表明，37℃下作用1 h、4℃孵育过夜，37℃下封闭2 h为本ELISA的最适包被条件和封闭条件。
（3） 待检血清与酶标抗体的最适稀释倍数及其反应条件 1:40、1:80、1:160、1:320、1:640倍稀释的阴、阳性血清分别与1:500、1:800、1:1000、1:2000倍稀释的HRP-羊抗猪IgG组成方阵，进行ELISA，反应结果如表4所示，当阳性血清1:40倍稀释，酶标抗体1:500稀释时，P/N最大（8.170）。
*：+，阳性血清；-，阴性血清。
取包被有重组N蛋白的酶标板，在其他反应条件不变的情况下，分别改变血清和酶标抗体的反应条件，根据ELISA的OD值和P/N比值，筛选最佳血清和酶标抗体反应条件。结果如表5和表6所示，加入血清和酶标抗体后，在室温下反应60 min时的P/N比值最高，分别为7.867和9.461。
（4）显色时间 加入显色液于室温避光显色10、15、20、25、30 min后，终止反应，测定OD450 nm值，计算P/N值。结果表7所示，室温避光显色10~15 min时，3次ELISA试验的平均P/N值最高。
（5） 结果判定标准 30份阴性血清的OD值如表8所示。其OD平均值X= 0.175，SD=0.050，阴阳性临界值为0.326（≈0.33）。所以，当待检血清的OD值 ≥ 0.33 时，判为阳性，当 OD值 ≤ 0.28 时判为阴性，介于两者之间判为可疑。
效果例
（1） 特异性 用建立的间接ELISA方法检测PRRSV、CSFV、PCV2及PRV抗体阳性血清时的OD值均＜0.25，如图1所示，表明建立的ELISA方法与其他病毒血清抗体没有交叉反应，具有良好的特异性。
（2）敏感性 用建立的ELISA检测1﹕80 ~ 1﹕1024倍比稀释的PEDV抗体阳性猪血清，结果当PEDV抗体阳性时血清的最高稀释倍数为1﹕640倍，此时的平均OD值为0.393，血清蛋白总量为0.194 mg/mL。因此，本方法的检出的血清蛋白最低浓度为19.4 µg。
（3）重复性 当用同一批次或不同批次的重组N蛋白作为包被抗原检测同一份血清时，ELISA检测结果如表9和表10所示。同一批次蛋白的变异系数平均值为3.47%（1.36% ~5.50%），不同批次蛋白的变异系数为8.08%（3.40% ~ 12.95%））。该结果表明建立的ELISA方法具有良好的重复性。
（4） 临床应用 用建立的ELISA方法检测来自不同地区的144份血清抗体，结果发现PEDV抗体检出范围为40.6% ~ 100%，除了一个地区的抗体阳性率较低为40.6%外，其余的均很高，甚至高达100%（表11）。另对3个猪场的哺乳仔猪和保育猪的血清抗体检测结果显示，保育猪的血清抗体阳性率明显高于哺乳仔猪的抗体阳性率（表12）。
Claims (10)
1.一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，蛋白序列如SEQID No.2。
2.一种权利要求1所述的可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，其用于猪流行性腹泻病毒抗体检测。
3.根据权利要求2所述的一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，采用间接ELISA方法进行抗体检测，具体过程为：
（1）抗原包被板的制备：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将该可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白稀释后加入酶标反应板，孵育过夜；弃去孔中液体，用含0.05% Tween-20的PBS洗涤（PBST），洗涤后甩去孔中液体；
（2）封闭：加入含5%马血清的PBST，孵育，弃去孔中液体；
（3）加被检血清及对照血清：用血清稀释液稀释被检血清样品，加到抗原包被板反应孔中；同时设立阴性血清和阳性血清对照；盖好酶标板置室温反应1h，洗涤；
（4）加酶标记抗体：加入血清稀释液稀释的酶标抗体，室温下作用1 h，洗涤；
（5）加底物缓冲液：每孔加新配制的TMB底物溶液，室温避光显色；
（6）终止反应：观察阳性对照血清孔呈蓝色且阴性对照血清孔无色，终止反应；
（7）酶标仪测定OD值：在波长450nm读数；
（8）结果判定：当被检血清的OD值≥0.3 时，判定为阳性；当OD值≤0.3时，判定为阴性。
4.根据权利要求3所述的一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，步骤（1）中，碳酸盐缓冲液将N蛋白稀释至抗原包被浓度为1μg/mL。
5.根据权利要求3所述的一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，步骤（1）中，孵育过夜采用37℃下作用1 h，4℃过夜。
6.根据权利要求3所述的一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，步骤（2）中孵育采用37℃下封闭2 h。
7.根据权利要求3所述的一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，步骤（3）中，阳性血清为1:40倍稀释。
8.根据权利要求3所述的一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，步骤（4）中，酶标抗体为1:500稀释。
9.根据权利要求3所述的一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，步骤（3）中，改好酶标板置室温反应1h；步骤（4）中，加入酶标抗体后室温下作用1h。
10.根据权利要求3所述的一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，步骤（5）中室温避光显色时间为10~15min。
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