CN103499689A - 猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法，其包括供体微珠、受体微珠、猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体及带His标签的Cap蛋白抗原。本发明通过优化供体微珠、受体微珠、单克隆抗体、抗原以及血清等试验反应条件，建立了检测PCV抗体的竞争AlphaLISA检测方法。利用本发明的试剂盒进行PCV抗体的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，不需洗涤，不受溶血影响，检测成本低，检测时间短。

Description

猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及猪圆环病毒2型抗体的免疫学检测，具体涉及一种猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及检测方法。
背景技术
猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，为无囊膜的单股负链DNA病毒，是已知的最小的动物病毒之一，主要分为2个基因型，即PCV1和PCV2。PCV1无致病性，广泛存在于猪群中。PCV2感染可引起多种疾病综合征，如断奶仔猪多系统衰竭综合征、怀孕母猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪呼吸道疾病、猪皮炎和肾炎综合征、幼龄仔猪A 2型先天性震颤等疾病。PCV2是20世纪90年代初首先从出现断奶仔猪多系统衰竭综合征的病猪体内分离出的一种病原，如今已成为严重危害养猪业健康发展的主要病原之一，引起了国内外学者的广泛关注。我国自2000年报道首例猪圆环病毒感染以来，该病已普遍发生，表现为流行范围广，阳性率高，混合感染严重，种猪感染率高，在临床上表现为不同的临床综合征，已严重影响了养猪业的发展。
针对该病现有的检测方法主要有病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶技术，原位杂交（ISH），免疫胶体金技术，免疫荧光试验，免疫组化技术，抗原捕获ELISA，PCR和real time PCR等，各有优缺，且特异性差异较大。同时，方法对样品和人员的要求较高。由于猪感染猪圆环病毒2型或免疫猪圆环病毒疫苗均能产生相应的抗体，且抗体能较好的反应其免疫或感染病毒的情况，因此，可以通过检测PCV 的抗体来反应其免疫感染病毒情况。
AlphaLISA技术主要依赖于Alpha供体微珠和受体微珠的相互作用。当生物反应使供体微珠和受体微珠相互接近时, 激光激发级联反应，从而产生极大放大的信号。具体来说，在680nm 的激光照射下, 供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递到铕，发射波长为615nm。在生物分子不存在特异的互相作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生。AlphaLISA技术凭借一种专有的基于微珠的技术，将传统的ELISA 转化为均相的“无需洗涤”的检测。
AlphaLISA技术所使用的稀土元素铕（Eu），发射波长非常尖锐，为615nm，从而大大减少了检测样品中杂质的干扰，可直接检测复杂样品（血清和体液）中的生物分子。在临床上，这非常适合测定人和动物的血清和体液样本。而此技术的高通量、高灵敏度、操作简便，能更准确、更省时的测定细胞因子等生物标志物。目前，已广泛用于药物筛选、细胞因子、病变基因、血清抗体等的检测。
中国发明专利申请（申请号为：201210031802.X，201210047016.9）分别公开了采用AlphaLISA技术检测肠道病毒71型衣壳蛋白（Anti-EV71 VP1 IgM）和甲型肝炎病 IgM 的方法。但是，目前尚无利用AlphaLISA技术检测猪圆环病毒2型抗体的试剂盒及检测方法的报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒，及编码试剂盒中抗原的基因，以及扩增该基因所使用的引物；本发明的第二目的是提供一种用于食品安全检测的猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测方法。
为实现第一目的本发明采用的技术方案是：猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒包括供体微珠、受体微珠、猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体及带His标签的Cap蛋白抗原。
其中，所述供体微珠为螯合镍的供体微珠，PE,AS101D（即Nickel chelate Donor beads(PE,AS101D)）；所述受体微珠为抗鼠IgG受体微珠，PE,AL105C（即Anti-mouse IgG Acceptor beads(PE,AL105C)）；所述猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有与猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。
进一步，上述试剂盒包括供体微珠80μg/mL、受体微珠80μg/mL、猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体180nM/L及带His标签的Cap蛋白抗原100nM/L。使用时，以总体系20μL计，每孔添加量为：80μg/mL受体微珠3μL、80μg/mL供体微珠5μL、180nM/L带His标签的Cap蛋白抗原 5μL、100nM/L猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体 5μL及待测样本2μL。
具体地，编码所述猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原的基因为PCV Cap基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.2。PCV Cap基因是通过PCR扩增获得的，进行PCR扩增所用的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
为实现第二目的本发明的猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测方法，包括如下步骤：
1）反应板的待测孔中每孔加入2μL待测样本，对照孔加入2μL 1×稀释缓冲液。
2）每孔加入5μL 180nM/L带His标签的Cap蛋白抗原和5μL 100nM/L猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育1h。 
3）每孔加入80μg/mL受体微珠3 μL 、80μg/mL供体微珠5μL，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育30 min。
4）结果读取：将反应板置Enspire（PE）AlphaLISA检测系统中读值。
采用上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
利用本发明的试剂盒进行猪圆环病毒2型抗体的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，不需洗涤，不受溶血影响。
本发明的优点是（1）、操作简单，不需要洗涤；（2）、高特异性：抗原与抗体的特异性结合，均相的反应，所需样本体积小，仅需2 ??L；（3）、检测时间短：检测时间比传统的ELISA时间短，仅需1.5 h即可完成检测；（4）、灵敏度高：最低检测极限比普通ELISA高5～10倍；样本检测的检出率达到96.3%；（5）、背景低，抗淬灭能力强：采用长波长激发，短波长发射，不会有来自荧光的背景；且利用时间分辨荧光的检测模式，进一步降低了背景，确保结果的真实性，615nm的发射波长，非常尖锐，基本没有来自样品的淬灭干扰，是进行血清、血浆、体液等复杂样品检测的理想选择；（6）、用途：可用于血清及其相关样本中猪圆环病毒2型抗体的快速检测。
附图说明
图1为PCV Cap全长的核酸扩增电泳图；图中第1泳道为PCV Cap基因扩增产物，第2泳道为阴性对照，第M泳道为DL 2000 DNA marker；
图2 为重组表达质粒pET-PCV-Cap经XhoΙ、KpnΙ双酶切后电泳图；图中第1泳道为ET-PCV-Cap酶切后，第2泳道为空载体，第3泳道为ET-PCV-Cap酶切前，第M泳道为15000 DL marker；
图3为PCV Cap蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果；第M泳道为预染蛋白分子量标准，从上至下分子量依次为97.2KD、66.4KD、44.3 KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD；第1泳道为未诱导的对照；第2和3泳道为PCV Cap全长1-702，分子量大小约为42KD，与预期结果一致；
图4为His-标签PCV Cap全长蛋白的Western blot鉴定结果；第1、2泳道为PCV Cap全长1-702，分子量大小约为42 KD；第M泳道为Western blot蛋白分子标准，从上至下分子量依次为170KD、95KD、72 KD、55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、10KD。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施中使用的猪圆环病毒2型（HVRIPCV0002株）购自中国CVCC，由重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心保存。
实施例
一、PCV Cap重组蛋白原核表达质粒的构建及鉴定
1、目的片段扩增
1.1、PCR扩增
以毒株PCV2（以参考序列GenBank No.：NC_005148.1设计引物）的基因组为模板，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增所需目的片段PCV Cap基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
上下游引物分别引入Kpn I和Xho I酶切位点，引物设计采用Primer Preier5(一种引物设计软件)，引物由宝生物（大连）公司合成，引物序列见表1。
表1 引物序列
                                                
Figure 2013104740373100002DEST_PATH_IMAGE001
PCR反应体系如表2所示（总体积25μL)
表2 PCR反应体系
反应体系 体积(μL)
Premix Ex Taq 12.5
上游引物(20μM) 1.0
上游引物(20μM) 1.0
模板DNA（或阳性质控DNA） 3
Rnase Free dH2O 7.5
反应条件为： 94℃ 30sec，58℃ 30sec,72℃ 1min；30个循环；72℃延伸10min。
扩增的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在紫外线透射仪中切下含有目的基因片段的琼脂糖凝胶块，将其放进1.5mL的离心管中，用核酸凝胶回收试剂盒回收纯化。
1.2 T-A克隆
将回收的PCR扩增产物分别与（克隆载体）pMD19-T-vector连接构成重组质粒pMD19-PCV-Cap，连接反应体系如下（总体积10μL，4℃连接过夜）。
表3 T载体连接体系
反应体系 体积（μL）
pMD19-T 1
回收DNA片段 4
SolutionⅠ 5
合计 10
1.3 双酶切反应
采用限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ对构建的阳性克隆质粒pMD19-PCV-Cap和表达载体pET-32-a(+)进行双酶切，总体积30??L，37℃水浴酶切3h。
表4 双酶切反应体系
反应体系 体积（μL）
阳性克隆质粒 8
10×M缓冲液 3
Kpn I 1
Xho I 1
ddH2O 17
将酶切产物加入10×DNA上样缓冲液在1.2%的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳。待目的产物与pET-32-a(+)载体相分离后，切下目的片段并回收。
2、Cap全长1-702的表达载体的构建
将带有双酶切位点的目的基因片段与经相同酶切的组氨酸（His）标签融合蛋白表达载体PET-32-a(+)进行连接，反应体系如下（总体积20μL，连接2h）。
表5 连接反应体系
反应体系 体积（μL）
10×T4 DNA连接缓冲液 2
T4 DNA连接酶 2
pET-32a（双酶切后） 3
目的基因片段 13
将与pET-32-a(+)原核载体连接的连接产物转化入BL21（DE3）感受态细胞中，采用常规转化方法，取200μL涂于固体LB琼脂培养板上（含50μg/mL Amp），37℃温箱倒置培养12 h ～16h。挑取单个细菌菌落，置于5mL含100μg/mL Amp的液体LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养过夜，提取质粒DNA，并将质粒DNA送宝生物（大连）有限公司测序。
3、酶切鉴定
将构建好的pET-32a-PCV Cap (1-702)质粒用Kpn I、Xho I双酶切，全长1-702共702bp，送宝生物（大连）有限公司测序确认。Marker从上到下依次为10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp、250bp（图2）。
4、PCV Cap全长重组蛋白的小量表达鉴定
分别将测序鉴定正确的单克隆菌液以1:1000（v/v）的比例接种到含有Amp的5 mL LB液体培养基，放入摇床37℃，170 rpm震荡培养过夜，再以1:100（v/v）的比例转接至含有Amp的5 mL LB液体培养基中，37℃，170 rpm震荡培养1.5～2h至菌液光密度值600（OD600）达到0.6～0.8，然后加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），其中另一管作为未诱导的对照不加入IPTG，37℃，170rpm继续培养3～4h。将每管各吸出1000 μL菌液至1.5 mL离心管，12000 rpm离心1 min，收集菌液，再用25μL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬起沉淀，然后加入25μL 2×蛋白上样缓冲液充分混匀后100℃煮沸10 min，再12000 rpm离心1 min。取15μL上样，常规进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色，根据诱导前与诱导后对比分析蛋白电泳结果，观察是否有蛋白表达，选取阳性菌种保存于-80℃备用。
5、PCV Cap全长重组蛋白的纯化
5.1 试剂准备
(1)变性液：6M盐酸胍，20mM磷酸氢钠，500mM氯化钠，Ph7.8；
(2)缓冲液A：20mM Tris-HCl(pH8.5)，500mM KCl ，20mM imidazole ，5mM β-ME，10%(v/v)甘油，8M Urea；
(3)缓冲液B：20mM Tris-HCl(pH8.5)，1M KCl，5mM β-ME，10%(v/v)甘油，8M Urea；
(4)缓冲液C：20mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM KCl，200mM imidazole ，5mM β-ME，10%(v/v)甘油，8M Urea；
(5)透析缓冲液：8M Urea溶于1×PBS缓冲液中；
(6)0.2mM Ni2SO4；
(7)2%（w/v）NaHCO3和1mM EDTA，pH8.0；
(8)1Mm EDTA，pH8.0。
5.2 试验步骤
5.2.1 蛋白诱导表达
(1)阳性表达菌种以1:1000（v/v）的比例加入5 mL含50??g/mL Amp的液体LB培养基中，37℃，150 rpm震荡培养过夜；
(2)将培养物按1:100（v/v）的比例加入100 mL含有Amp的液体 LB培养基中，37℃，150 rpm震荡培养2～3h至菌液的OD600达到0.6～0.8；
(3)加入终浓度为0.5mmol/L 的IPTG后，150 rpm，37℃诱导表达3 h；
(4)收集培养液，10000 rpm离心10 min，弃上清，收集沉淀（称取收集离心管前后离心瓶的重量，以计算出沉淀湿菌重量）；
(5)用20 mL预冷PBS重悬菌体沉淀，4℃ 10000 rpm离心10 min，此步重复两次；
(6)每1g湿菌加入250 μL Cocktail II和250 μL Triton-100(一种去污剂)，于冰浴中超声破碎细菌，每超声5 sec，间歇10 sec，共超声20 min，超声功率为300W。超声后4℃以10000 rpm 离心10 min；
(7)上清先存放于4℃冰箱，1g沉淀应加入7 mL变性液，重悬沉淀，室温轻摇变性1 h～2 h，4℃以10000 rpm离心10 min；
(8)取上清与处理好的镍柱结合，常温结合2h。
5.2.2 蛋白纯化（离心均为3000 rpm离心3 min）
 (1) 缓冲液A洗6次（10倍柱体积）；每次4℃，3 min。
（2）缓冲液B洗6次（10倍柱体积）；每次4℃，3 min。
（3）缓冲液A洗2次（10倍柱体积）；每次4℃，3 min。
（4）缓冲液C洗脱。至少洗10次。每次1～2 min。
5.1.3 蛋白透析
 根据蛋白溶液的体积，选取适当截留量及长度的透析袋，用无菌蒸馏水清洗后，先用透析袋夹封住一端，将含有蛋白溶液装入透析袋后再封闭另一端。在4℃条件下，先用含8 mol/L 尿素的PBS（pH8.0）透析4h，再用PBS(pH8.0)逐步稀释，使尿素的浓度以每4h递减2 mol/L的速度直至最终浓度为0 mol/L，其中在4 mol/L时透析过夜。在4℃以10000rpm离心10 min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
6、PCV Cap全长重组蛋白的Western Blot 鉴定
6.1 操作方法：
 （1）样品加样前处理：取纯化后的PCV  Cap蛋白100μL加入等体积的1×SDS蛋白上样缓冲液，混匀，100℃变性5min；
 （2）SDS-PAGE凝胶的制备：配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。在浓缩胶80V，分离胶110V电压条件下电泳，直至指示剂溴酚蓝迁移至胶底部；
（3）蛋白的电转移：将凝胶放入电转缓冲液中平衡10 min，依凝胶大小，剪裁出相同大小聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），将其先在甲醇溶液中浸润5min活化后，再置电转缓冲液中平衡10min；同时，准备同样大小的3层滤纸，置电转缓冲液平衡10min，在电转仪的正极极板上依次放置3层滤纸、PVDF膜、凝胶和3层滤纸，赶走各层间气泡，压上负极极板，以1.5mA/cm2稳流进行电转90 min；
（4）PVDF膜的封闭，一抗作用：转移完毕，PVDF膜用10mL含5%脱脂乳的封闭液，4℃封闭过夜；
（5）一抗孵育： 弃封闭液，1×TBST室温漂洗3次，每次5min。加入5mL稀释后的Anti-PCV Cap单克隆抗体，用Western blot一抗稀释液1:1000稀释Anti-PCV Cap单克隆抗体。37℃在摇床上缓慢摇动，孵育1 h。
（6）二抗孵育：取出PVDF膜，1×TBST室温漂洗3次，每次5min。将PVDF膜放入杂交袋中，加入稀释后（1:2500）的辣根过氧化氢酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG(二抗)，用Western blot二抗稀释液1：2500倍稀释羊抗鼠IgG-HRP，37℃摇动孵育1h；
(7) 显色：取出PVDF膜，1×TBST洗液洗3次，每次5 min。加入新鲜配制的显色液(显色液A液200uL，C液20uL，混匀)。将PVDF膜置于显色液中，室温避光显色。10min后观察，至蛋白条带显出后，用双蒸水终止反应。显色后拍照打印存档。
6.2 结果
将洗脱的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，一方面用考马斯亮蓝染色，蛋白分子量大小与预期相似。考马斯亮蓝结果见图3，Western Blot鉴定结果见图4。
二、Anti-PCV Cap IgG  AlphaLISA反应条件的摸索
1、试验原理
在该方法中，带His标签的PCV Cap蛋白抗原可与猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体反应，与anti-mouse IgG Acceptor beads和Nickel chelate Donor beads相互作用，通过680nm的激光照射，供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧，单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递到铕，通过615nm的发射波长测定吸光度值。如果样品中存在PCV 抗体，则可以与猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体体竞争PCV Cap抗原，则检测值降低（与受体微珠和供体微珠的对照孔相比较，值降低2倍以上），如果样品中不存在PRRSV抗体，则检测值较高（与受体微珠和供体微珠的对照孔相比较，差异不明显）。如果生物分子不存在特异的相互作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号产生。
本试验分析物为PCV Cap抗体阳性对照（来自ELISA试剂盒）。选择了经ELISA方法证明PCV Cap抗体阳性的血清样本和阴性的血清样本各10份进行体系的摸索。
2、操作方法
1）待测孔中每孔加入2μL待测样本，对照孔加入2μL 1×稀释缓冲液；
2）每孔加入5μL 180nM/L带His标签的Cap蛋白抗原和5μL 100nM/L猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育1h； 
3）每孔加入80μg/mL受体微珠3 μL 、80μg/mL供体微珠5μL，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育30 min；
 4、置于Enspire读板机进行检测
  在总体系为20μL的条件下，得到一个比较稳定的检测体系。即受体微珠的终浓度为12 μg/mL，每孔3μL；供体微珠的终浓度为20μg/mL，每孔5μL；180nM/L带His标签的Cap蛋白抗原每孔5μL；100nM/L的猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体5μL；待测样本2μL；总体系为20μL。
三、Anti-PCV Ab AlphaLISA检测方法的初步应用
1、用ELISA法初筛部分阳性血清
为了有效的评价已建立的Anti-PCV Ab  AlphaLISA检测方法的有效性。本发明使用商业化的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒对40份猪血清样本进行初步筛选。
1.1 检测原理
本试剂盒采用间接酶联免疫吸附试验原理。微孔条上预包被重组的PCV抗原，被检测样品在包被孔中孵育时，如果存在特异性的PCV抗体，则PCV的特异性抗体可与包被的抗原形成抗原抗体复合物，洗去未结合的成分；加入辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗猪抗体，可与孔中的猪抗体结合，当样品中存在PCV抗体时，则形成“包被抗原-抗PCV抗体-酶标抗体”复合物，洗去未结合的成分；加入显色剂TMB，复合物上连接的HRPO催化显色剂反应，生产蓝色产物，加入终止液，终止反应，颜色不变。
1.2 操作方法
(1)洗液的配制：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水10倍稀释；
(2)样品编号：将样品对应微孔板按序编号，每板设阴性对照2孔，阳性对照2孔和空白对照1孔；
(3)样品的稀释：每孔加入样品稀释液195μL，样品5μL，对照孔和空白孔除外；
(4)加样：分别在相应孔中加入已稀释好的待测样品或未稀释的阴、阳性对照100μL，空白对照加入100μL样品稀释液，轻轻震荡混匀。用封板膜封板后，室温孵育30min±2min；
(5)洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
(6) 加二抗：每孔加入辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗猪IgG抗体100μL，轻轻震荡混匀，室温孵育30min.±2min；
(7)洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干；
(8)显色：每孔加入TMB底物显色液100μL，轻轻震荡混匀，室温避光显色15min；
(9)终止：每孔加终止液100μL，轻轻震荡混匀，10min内测定结果。
(10)测定：设定酶标仪波长于630nm处，测定各孔A（630）值。
1.3 结果
  经检测PCV IgG阳性样本16例，主要为疫苗免疫的猪和有临床发病症状的猪。同时，使用30份未免疫疫苗且无临床症状的猪血清作为对照，结果显示30份样本全部为阴性。
2、竞争AlphaLISA检测方法的初步应用
  将上述ELISA方法建立的16例PCV样本的IgG阳性样本和30份健康猪的血清（IgG阴性）作为AlphaLISA检测方法的初步评价。检测样本为2μL血清，按照之前优化过的试验条件建立的20μL检测体系进行样本的检测。
  检测结果发现，16例PCV IgG阳性的样本，AlphaLISA检测方法检测的结果也为阳性，30份健康猪的血清通过AlphaLISA检测方法检测结果也显示为阴性，符合率达到100%。为进一步了解AlphaLISA检测的敏感性，试验将经过核酸检测阳性，而IgG检测结果阴性的PCV的血清，进行了AlphaLISA检测，结果检测出1份阳性样本（表6）。
表6 样本结果比较
 
Figure 2013104740373100002DEST_PATH_IMAGE002
四、Anti-PCV Cap  IgG  AlphaLISA方法的评价
1、样本检测
 为了评价所建的Anti- PCV Cap  IgG  AlphaLISA方法，我们将PCV核酸和ELISA检测结果同时阳性的样本确定为IgG阳性样本。通过此方法筛选出20份阳性样本。同时，以60份健康的进口种猪的样本为阴性样本建立80份样本的PCV IgG 评价样本库（表7）
表7  PCV IgG 样本库组成
样本组成 样本数量（份） 核酸检测 ELISA（IgM ） AlphaLISA(IgM)
阳性样本 35 35（+） 20（+） 19（+）
健康样本 60 60（-） 无 2（+）
2、Anti- PCV Cap IgG  AlphaLISA方法的评价
  使用上述样本对建立的Anti- PCV Cap IgG AlphaLISA方法进行评价。检测样本为2μL血清，按照已优化好的试验条件建立20μL检测体系进行检测。检测结果显示：20例PCV IgG阳性的样本，AlphaLISA方法的检测结果有19份为阳性。60份健康猪的血清通过Anti- PCV Cap IgG AlphaLISA检测方法检测结果58份显示为阴性，2份为阳性（表8）。
表8  Anti- PCV Cap IgG AlphaLISA方法评价
 
Figure 2013104740373100002DEST_PATH_IMAGE003
检测结果显示：建立的 Anti-PCV Cap IgG AlphaLISA方法，其灵敏度=95.0%、特异性=96.70%、假阳性率=5.0%、假阴性率=3.4%、阳性预测值=90.5%、阴性预测值=96.7%、准确度=96.3%。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>  猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及检测方法
<160>  4   
 
<210>  1
<211>  233
<212>  PRT
<213>  猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原
 
 
<400> SEQ ID NO.1
 
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1                         6                         11                       16
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
                     21                       26                       31
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Ala Arg
               36                        41                       46
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Ser Thr
          51                        56                       61
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Leu Tyr Phe Asn Leu Asp Asp Phe Val
     66                      71                        76
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
81                       86                       91                      96
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
                    101                      106                     111
Gln Gly Asp Tyr Gly Val Gly Ser Ser Ala Ile Ile Leu Asp Asp Asn
                116                     121                     126
Phe Val Ile Lys Ala Thr Ala Gln Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
          131                    136                      141
Ser Ser Tyr His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
    146                    151                       156
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
161                      166                      171                    176
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn
                      181                      186                      191
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp
               196                       201                      206
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
           211                     216                      221
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro
     226                      231
 
<210>  2
<211>  702
<212>  DNA
<213>  猪圆环病毒2型Cap基因
 
 
<400>  SEQ ID NO.2
atgacttacc ctcgtcgtcg ttatcgtcgc cgtcgtcatc gtccacgttc tcatctgggt     60
caaatcctgc gtcgtcgtcc gtggctggtt cacccgcgtc accgctaccg ttggcgccgc     120
aaaaatggta tcttcaacgc gcgtctgtct cgcactttcg gttacacggt taaagcaacc     180
accgtaagca ccccgtcctg ggctgtcgac atgctgcgtt tcaacctgga tgactttgta     240
ccgccgggtg gtggcaccaa caaaatctcc atcccgttcg agtactaccg tatccgcaaa     300
gttaaagtgg aattctggcc atgctccccg atcactcaag gcgatcgcgg cgtgggctct     360
tctgctatta ttctggacga caacttcgtc attaaggcca ctgcacagac ctacgatccg     420
tatgtgaact attcttcccg tcacacgatc ccgcagccgt ttagctacca ctcccgttac     480
ttcaccccga agccggttct ggatagcacc atcgattatt ttcagcctaa caacaaacgt     540
aaccagctgt ggatgcgcct gcagacttct cgcaatgtag atcacgtggg tctgggcacc     600
gcgttcgaaa acagcaaata tgaccaggac tacaacattc gtgttaccat gtacgttcag     660
ttccgcgaat ttaacctgaa agacccaccg ctgaaaccgt aa                        702
        
 
<210>  3
<211>  49
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<400>  SEQ ID NO.3
cgcggtaccg acgacgacga caagatgact taccctcgtc gtcgttatc                 49
 
 
<210>  4
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<400>  SEQ ID NO.4
cgcctcgagt tacgcagacg gagacgcagt aac                                  33

Claims (5)

1. 猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于：包括供体微珠、受体微珠、猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体及带His标签的Cap蛋白抗原；
其中，所述供体微珠为螯合镍的供体微珠，PE,AS101D；所述受体微珠为抗鼠IgG受体微珠，PE,AL105C；
所述猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有与猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于：所述供体微珠80μg/mL、受体微珠80μg/mL、猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体100nM/L及带His标签的Cap蛋白抗原180nM/L；
使用时，以总体系20μL计，每孔添加量为：80μg/mL供体微珠5μL、80μg/mL受体微珠3μL、180nM/L带His标签的Cap蛋白抗原 5μL、100nM/L猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体 5μL及待测样本2μL。
3.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于：编码所述猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原的基因为PCV Cap基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.2。
4.根据权利要求3所述猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于：所述PCV Cap基因是通过PCR扩增获得的，进行PCR扩增所用的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
5.利用权利要求1所述试剂盒进行猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测的非疾病诊断目的的检测方法，包括如下步骤：
1）反应板的待测孔中每孔加入2μL待测样本，对照孔加入2μL 1×稀释缓冲液；
2）每孔加入5μL 180nM/L带His标签的Cap蛋白抗原和5μL 100nM/L猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育1h； 
3）每孔加入80μg/mL受体微珠3 μL 、80μg/mL供体微珠5μL，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育30 min；
4）结果读取：将反应板置Enspire（PE）AlphaLISA检测系统中读值。
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