CN109724965A - 一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括牛支原体P30蛋白单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠、带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原和镍螯合的供体磁珠。本发明采用基因工程技术制备了牛支原体P30外膜蛋白，采用PEG1500细胞融合技术制备了牛支原体P30蛋白单克隆抗体，将纯化后的重组P30蛋白作为抗原和制备的单克隆抗体间的相互作用，通过样品中抗体与单克隆抗体竞争性结合重组P30蛋白，建立竞争性牛支原体抗体AlphaLISA的检测方法。该检测方法检测时间短，特异性好，灵敏度高，不需洗涤，操作简便，检测成本低。

Description

一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测 方法

技术领域

本发明涉及兽医学、免疫学及生物制品学领域，特别的涉及一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis，Mb)是目前发现最小和最简单的能自主复制的原核可导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎等多种疾病，造成巨大经济损失，严重威胁着我国养牛业健康发展。目前，兽医实验室常用的牛支原体检测方法：生物学检测、分子生物学检测以及免疫学检测。生物学检测主要是通过传统的病原分离鉴定，由于支原体属于兼性厌氧生物、对营养要求极其严格、而且培养周期较长(传代培养需72小时以上才能继代)，分离特别耗时；分子生物学检测主要利用PCR技术，目前国外已根据有限的牛支原体基因序列建立了PCR、荧光PCR，但PCR和荧光PCR方法存在操作复杂、检测时间长、所需设备昂贵等缺点，故难以在基层推广；免疫学检测方法则是目前大批量诊断牛群的牛肺炎支原体，最为常用和适用的实验室诊断方法，但以全菌蛋白建立的ELISA特异性不好，与其它支原体有交叉反应，基于重组蛋白或单克隆抗体建立的ELISA灵敏性和特异性都较高，国外已开发成商品化试剂盒，但价格昂贵，检测成本较高，国内发明专利“牛肺炎支原体的诊断试剂及应用”(专利号ZL20131 0071532.X)制备牛肺炎支原体重组蛋白，并作为包被抗原，建立间接ELISA法检测牛肺炎支原体抗体，该方法检测灵敏度较高，但操作步骤较繁琐、需多次洗涤，容易产生非特异性反应。总之，这些方法虽然有各自的优点但都存在着一定的缺陷，很难在基层生产上推广。因此，发明一种快速、简便、高效的检测方法对于牛肺炎支原体疫病的诊断和治疗具有十分重要的意义。

光激化学发光免疫检测技术(AlphaLISA，amplified luminescent proximityhomogeneous assay linked immunosorbent assay)是一种基于微珠的化学发光的新型均相检测技术，与传统的ELISA技术相比具有更高的敏感性、精确性、均一性、背景低、广泛的动态检测范围，而且无需洗涤及样本需求量极少等特点，非常便于快速筛选和自动化。近年来该技术已在医学及分子生物学领域得到了广泛的应用。但针对牛支原体AlphaLISA检测国内外均未见报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，解决现有牛支原体检测方法存在操作繁琐和特异性差的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒，包括牛支原体P30蛋白单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠、带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原和镍螯合的供体磁珠；所述受体微珠具有发光功能，所述供体磁珠具有感光功能；所述牛支原体P30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述编码所述牛支原体P30蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

应用上述牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：

1)将山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠和镍螯合的供体磁珠分别用1×AlphaLISA稀释剂将其浓度稀释至100μg/ml；

2)在反应板上分别设置阴性对照组和待检测样品组，向所述待检测样品组中每个孔加入5μL带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原、5μL牛支原体P30蛋白单克隆抗体和5μL待测样品；向所述阴性对照组中每个孔加入5μL带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原、5μL牛支原体P30蛋白单克隆抗体和5μL去离子水；然后将所述反应板置于微量震荡器上震荡30～60s，混匀后置于23℃培养箱，孵育1h；

3)向步骤2)反应板中阴性对照组和待检测样品组的每个孔中分别加入5μL步骤1)制备的山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠和镍螯合的供体磁珠，然后将所述反应板置于微量震荡器上震荡30～60s，混匀后置于23℃培养箱，避光孵育1h；

4)将步骤3)反应后的反应板置于AlphaScreen/Lisa检测仪上检测信号值；当阴性对照组的检测值大于待检测样品组检测值的2倍时，即待检测样品中含有牛支原体抗体。

其中，带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原、牛支原体P30蛋白单克隆抗体及待检样品的稀释用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4，0.01M PBS)。

进一步，所述带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原的工作浓度为0.5～20μg/ml；所述牛支原体P30蛋白单克隆抗体的工作浓度为0.5～25μg/ml。

进一步，所述AlphaScreen/Lisa检测仪检测时激发光波长为680nm，发射光检测波长为615nm。

本发明的检测原理：

本发明采用竞争法，达到检测血清中牛支原体抗体的目的。首先牛支原体P30蛋白单克隆抗体和带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原加入反应板中，会发生特异性的抗原抗体结合反应，充分反应后，再加入山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠和镍螯合的供体磁珠，每个磁珠表面，都可以与数以千计的生物分子进行结合，试验中山羊抗小鼠IgG偶联在受体磁珠上，使牛支原体P30蛋白单克隆抗体与受体磁珠结合，带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原与镍螯合的供体磁珠结合，由于带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原与牛支原体P30蛋白单克隆抗体发生结合反应，因此使供体磁珠与受体微珠距离缩短至200nm以内。在680nm激发光作用下，具有感光功能的供体磁珠表面的光敏剂，能将周围环境中的氧分子转化成传播直径约为200nm单线态氧分子，传递至具有发光功能的受体磁珠后，产生能量转移的级联反应，于615nm发射可供检测的信号峰。反之，则不会在615nm处发射检测信号。当样品为阳性时，样品中抗体与单克隆抗体竞争性结合带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原，从而使发射信号减弱，导致检测值的降低。通过AlphaScreen/Lisa检测仪的检测系统对产生光信号的强度检测，以此来判断待检测样品是否为阳性样品。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明采用基因工程技术制备了牛支原体P30外膜蛋白，采用PEG1500细胞融合技术制备了牛支原体P30蛋白单克隆抗体，将纯化后的重组P30蛋白作为抗原和制备的单克隆抗体间的相互作用，通过样品中抗体与单克隆抗体竞争性结合重组P30蛋白，建立竞争性牛支原体抗体AlphaLISA的检测方法。该方法操作简单、特异性高，从而解决现有牛支原体检测方法存在操作繁琐和特异性差的问题。

2、本发明的试剂盒对牛支原体抗体进行检测时，采用长波长激发，短波长发射，不会有来自荧光的背景。其检测模式为时间分辨荧光，进一步降低了背景，确保结果的真实性。本发明背景低，抗淬灭能力强，样品用量少，检测时间短，无交叉反应，特异性好，灵敏度高，不需洗涤，操作简便，检测成本低。

附图说明

图1为重组质粒pET28a(+)-P30的酶切鉴定图；

1为pET28a(+)-P30双酶切产物；2为DL-10000Marker；

图2为不同诱导温度条件下的P30蛋白表达；

M为预染蛋白质分子量标准(10-180kD)；1-2为未经IPTG诱导的pET28a(+)-P30超声破碎后沉淀；3、5和7分别为20℃、30℃和37℃条件下重组菌pET28a(+)-P30/BL21(DE3)经裂解液破碎后的上清；4、6和8分别是20℃、30℃和37℃条件下重组菌pET28a(+)-P30/BL21(DE3)经裂解液破碎后的沉淀；

图3为不同IPTG诱导浓度和不同诱导时间条件下的P30蛋白表达；

M为预染蛋白质分子量标准(10-180kD)；1为未经IPTG诱导的pET28a(+)-P30超声破碎后上清；2为pET28a(+)空载体；3、4和5为37℃条件下，IPTG浓度分别为0.1mmol·L^-1、0.5mmol·L^-1和1mmol·L^-1，诱导6h后重组菌pET28a(+)-P30/BL21(DE3)经裂解液破碎后的上清；6、7、8和9为37℃条件下，IPTG浓度为0.1mmol/L时分别诱导4h、6h、8h和10h后重组菌pET28a(+)-P30/BL21(DE3)经裂解液破碎后的上清；

图4为纯化后的P30蛋白的SDS-PAGE电泳图；

M为预染蛋白质分子量标准(10-180kD)；1为未经IPTG诱导的pET28a(+)-P30超声破碎后沉淀；2为重组菌pET28a(+)-P30/BL21(DE3)经裂解液破碎后的上清；3为P30穿透液；4～7为P30纯化蛋白；

图5为P30重组蛋白的Western blot结果图；

1为未经IPTG诱导的重组菌pET28a(+)-P30/BL21(DE3)原菌液；2为经IPTG诱导后尿素溶解的包涵体沉淀；3～4为纯化后的重组P30蛋白；

图6为抗体纯化SDS-PAGE电泳图；

M为预染蛋白质分子量标准(10-180kD)；1～2为纯化后的抗体；

图7为P30蛋白单抗的Western blot检测结果图；

1为P30蛋白；2为pET28a(+)/BL21(DE3)原菌液。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例

1、抗原的筛选

牛支原体细胞膜表面蛋白在致病与感染过程中起到重要作用，通过对牛支原体细胞膜表面蛋白进行预测信号肽和抗原表位分析等筛选出P30基因，进一步对P30基因及其编码蛋白进行生物信息学和免疫学分析，证明P30为牛支原体的表面膜蛋白，是牛支原体的一种特异性抗原，免疫原性好，序列保守，稳定性强。因此P30蛋白可以作为牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒中的抗原。

2、牛支原体膜蛋白P30蛋白的原核表达与检测

2.1pET28a(+)-P30重组载体的构建

根据GenBank已公布的牛支原体P30基因序列(GenBank登录号：AIA33998.1)，在不改变P30蛋白氨基酸序列的情况下，根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列，通过化学方法合成优化后的P30基因如SEQ ID NO.2所示，由上海生工进行合成并测序，其中在P30基因的5’段和3’段分别设计酶切位点NdeI和HindIII。

将合成的p30基因进行NdeI和HindIII双酶切，酶切产物回收后，插入到同样经过NdeI和HindIII双酶切回收的pET28a(+)载体中，将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，筛选出阳性克隆，并对阳性克隆用NdeI和HindIII进行双酶切鉴定，如图1所示，由图1可以看出重组质粒pET28a(+)-P30通过NdeI和HindIII双酶切鉴定，得到的目的片段与预期结果一致。将酶切鉴定正确的重组质粒送至上海生工进行测序，即得到序列正确的pET28a(+)-P30重组载体。

2.2P30重组蛋白的诱导表达条件筛选

将重组质粒pET28a(+)-P30转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值在0.6～0.8之间，然后向各培养瓶中加入IPTG，使培养瓶中IPTG的终浓度为0.5mmol·L^-1，分别于16℃、30℃和37℃诱导6h后取样，再将样品进行SDS-PAGE电泳分析确定最佳温度，结果如图2所示，SDS-PAGE电泳结果表明诱导温度为37℃时诱导条件最佳。

将重组质粒pET28a(+)-P30转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值在0.6～0.8之间，然后向各培养瓶中加入不同量的IPTG，使培养瓶中IPTG的终浓度分别为0.1mmol·L^-1、0.5mmol·L^-1和1mmol·L^-1，37℃诱导6h后取样，再将样品进行SDS-PAGE电泳分析确定最佳诱导IPTG的浓度，结果如图3所示，SDS-PAGE电泳结果表明IPTG的终浓度为0.1mmol·L^-1时诱导条件最佳。

将重组质粒pET28a(+)-P30转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀nm值在0.6～0.8之间，然后向各培养瓶中加入IPTG，使培养瓶中IPTG的终浓度为0.1mmol·L^-1，37℃分别诱导4h、6h、8h、和10h后取样，再将样品进行SDS-PAGE电泳分析确定最佳诱导时间，结果如图3所示，SDS-PAGE电泳结果表明诱导时间为4h时诱导条件最佳。

综上，pET28a(+)-p30/BL21(DE3)重组菌株在诱导条件为37℃，IPTG浓度为0.1mmol/L诱导4h时，重组P30蛋白表达最高。

1.3P30蛋白的大量表达及纯化

按优化得到的最佳条件大规模进行诱导表达重组P30目的蛋白，采用His-tag镍柱对P30目的蛋白进行纯化。样品上柱前，先用亲和平衡液平衡层析柱，然后将所得样品过柱，收集少量穿透液。用亲和平衡液过柱，除去样品中的杂蛋白。再用不同浓度梯度咪唑的亲和洗脱液洗脱镍柱，收集得到纯化的P30重组蛋白。经12％SDS-PAGE分析纯化结果，如图4所示，表明纯化后带His标签的P30蛋白纯度达到了90％以上。

2.4重组蛋白的免疫印迹(Western blot)分析

将表达的重组P30蛋白进行SDS-PAGE电泳，蛋白条带采用电转移法转移至PVDF膜，用50g/L脱脂奶粉封闭2h，弃封闭液，TBST洗3次，每次5min；以His-tag组氨酸单抗为一抗(1：10000)，4℃孵育过夜，弃一抗孵育液，TBST洗3次；以山羊抗小鼠IgG-HRP为二抗(1：4000)37℃孵育2h，弃二抗孵育液，用TBST洗3次，每次5min，加适量的化学发光液孵育5min，最后用红外光扫描仪成像。纯化后的P30蛋白经Western blot鉴定，结果如图5，在36KD处出现特异性条带，与预期的目的蛋白的大小相符合。

3牛支原体P30蛋白的单克隆抗体的制备及检测

3.1牛支原体P30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将上述纯化的P30蛋白免疫BALB/c小鼠，取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,第一次融合率为85.2％，第二次融合率为90.7％。建立间接ELISA，用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体。初检阳性率分别为15.2％和18.2％。选择阳性值较高的29个孔亚克隆，经过2次亚克隆，不断反复筛选得到了2株较稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为2H8、4D4。细胞融合的筛选结果如表1所示。将获得的2株配对的杂交瘤细胞2H8、4D4分别腹腔注射BALB/C小鼠，收集小鼠腹水，先采用辛酸-硫酸铵法进行初步纯化，再采用Protein G柱进一步分离纯化，纯化后的抗体进行SDS-PAGE电泳鉴定，如图6所示，得到鼠抗牛支原体P30蛋白单克隆抗体。

表1

3.2阳性杂交瘤细胞稳定性试验

将2H8和4D4细胞株继代培养6个月以上，其培养上清ELISA效价仍保持在1:1280～2560，将上述上清分别冻存2，4，6，8个月后复苏，其诱生小鼠腹水的抗体效价仍保持在1：128000～256000之间，说明本发明的阳性杂交瘤细胞具有良好的稳定性。

3.3单克隆抗体的特异性分析

将上述P30蛋白作为抗原样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入纯化后的抗体，进行Western blot鉴定。如图7所示，结果显示：单克隆抗体组在36KD处有一特异性条带，而空载体质粒转化的样品在对应位置无任何条带，这表明所得抗体的特异性较好。

3.4单克隆抗体的亚型鉴定

使用单抗亚型鉴定试剂盒(Sigma公司，货号ISO2-1KT)对2H8和4D4抗体进行亚型鉴定，结果显示两株抗体均为IgG1、λ型，如表2所示。

表2

4、牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒

4.1牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒的检测方法

1)将山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠和镍螯合的供体磁珠用1×AlphaLISA稀释剂将其浓度稀释至100μg/ml；

2)在反应板上分别设置阴性对照组和待检测样品组，向所述待检测样品组中每个孔加入5μL带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原、5μL牛支原体P30蛋白单克隆抗体和5μL待测样品；向所述阴性对照组中每个孔加入5μL带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原、5μL牛支原体P30蛋白单克隆抗体和5μL去离子水；然后将所述反应板置于微量震荡器上震荡30～60s，混匀后置于23℃培养箱，孵育1h；

3)向步骤2)反应板中阴性对照组和待检测样品组的每个孔中加入5μL抗鼠IgG包被标记的受体微珠和5μL镍螯合的供体磁珠，然后将所述反应板置于微量震荡器上震荡30～60s，混匀后置于23℃培养箱，避光孵育1h；

4)将步骤3)反应后的反应板置于AlphaScreen/Lisa检测仪上检测信号值；当阴性对照组的检测值大于待检测样品组检测值的2倍时，即待检测样品中含有牛支原体抗体。

4.2带有His标签的牛支原体P30蛋白与牛支原体P30蛋白单克隆抗体最佳反应浓度的测定

具体操作步骤同4.1，其中带有His标签的牛支原体P30蛋白用0.01M，pH7.4的PBS稀释成20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、1μg/ml和0.5μg/ml不同的浓度，牛支原体P30蛋白单克隆抗体用0.01M，pH7.4的PBS稀释成25μg/ml、12.5μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、1μg/ml和0.5μg/ml不同的浓度。然后按方正滴定法确定最佳抗原、抗体反应浓度，结果如表3所示。

表3

从表3可以看出，抗原最佳反应浓度为2.5μg/ml；实验所制备单克隆抗体的最佳反应浓度为5μg/ml。

4.3灵敏度试验

将牛支原体阳性血清进行稀释，稀释梯度分别为：1:10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640，然后按照4.1的具体操作方法，进行AlphaLISA检测，以最大稀释度稀释后，检测结果仍为阳性的样品浓度，作为此检测方法的灵敏度。检测结果如表4。

表4

当阳性血清进行320倍稀释时，Ensprire多功能酶标仪读数值仍小于阴性对照值的1/2，在阳性血清经640倍稀释后，其读数值大于阴性对照值的1/2，判定结果为阴性，结果表明本方法具有较高的检测灵敏度。

4.4特异性试验

分别以牛支原体标准阳性血清为阳性对照，以牛布氏杆菌、大肠杆菌O157、牛巴氏杆菌、牛衣原体的阳性血清的作为待检测样品，按照4.1的具体操作方法进行AlphaLISA方法检测，论证方法的特异性。结果如表5所示。

表5

结果表明该方法与牛布氏杆菌、大肠杆菌O157、牛巴氏杆菌、牛衣原体不发生交叉反应，仅对牛支原体抗体有特异性反应，说明该方法有较好的特异性。

4.5重复性试验

用建立的牛支原体抗体AlphaLISA检测方法对5份待测样品进行独立的检测，其中样品1为阴性样品。重复5次，统计检测结果，计算标准差和变异系数，变异系数计算公式：变异系数C·V＝(标准偏差(SD)/平均值(Mean))×100％，结果如表6所示。

表6

试验结果显示重复试验的变异系数介于1.3～2.3％之间，表明该方法具有良好的重复性。

4.6AlphaLISA检测方法的评价

取经国外Biovet公司牛支原体抗体EILSA试剂盒检测的样品116份，，已确定其中阳性样品47份，阴性样品69份。经自制的牛支原体AlphaLISA试剂检测，检测阳性率、阴性率与标准试剂盒进行比较，对建立的竞争AlphaLISA检测法进行质量评价。结果如表7所示。

表7

结果显示：经本方法牛支原体AlphaLISA试剂检测，发现检测的灵敏度为95.7％，特异性97.1％，表明所建立的AlphaLISA检测方法具有较高的灵敏度和特异性，能满足高通量，快速检测的要求，具有潜在推广应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆理工大学重庆市动物疫病预防控制中心；

<120> 一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasmabovis)

<400> 1

Met Lys His Lys Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Val Leu Thr Ala Thr

1 5 10 15

Phe Ser Phe Pro Leu Ile Ala Ala Lys Cys Asp Gly Asn Asp Lys Lys

20 25 30

Glu Glu Lys Lys Lys Val Glu Glu Pro Ala Lys Gln Ala Glu Gly Ala

35 40 45

Gly Thr Gly Asp Lys Thr Thr Ser Ala Ser Gly Thr Ala Asn Ser Asn

50 55 60

Gly Ala Ser Ser Asn Ser Thr Asn Ala Gln Lys Thr Asp Glu Lys Glu

65 70 75 80

Ile Lys Glu Thr Ser Asp Ser Pro Lys Lys Asp Gly Glu Lys Val Ser

85 90 95

Asp Lys His Lys Val Ala Tyr Lys Asp Ile Asp Phe Asp Phe Ser Lys

100 105 110

Ile Lys Ile Val Ile Ser Lys Lys Asp Ile Lys Asp Glu Asp Leu Ile

115 120 125

Pro Pro Lys Thr Gly Asn Asn Lys Gln Val Phe Phe Asp Thr Arg Asp

130 135 140

Gly Asp Thr Lys Leu Ser Gly Lys Phe Lys Gly Lys Leu Pro Trp Lys

145 150 155 160

Gly Val Glu Ile Gly Thr Val Thr Gly Leu Pro Asp Gly Tyr Ser Ile

165 170 175

Ala Ser Val Glu Asn Pro Ile His Lys Asn Arg Lys Gly Lys Ile Lys

180 185 190

Ala Ser Gly Phe Val Asn Val Glu Lys Glu Gly Asp Lys Leu Lys Ile

195 200 205

Lys Phe Arg Phe Phe Lys Tyr Asn Lys Gly Ala Ser Pro Thr Val Ser

210 215 220

Thr Lys Val Tyr Glu Ala Ile Ile Ser

225 230

<210> 2

<211> 702

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasmabovis)

<400> 2

atgaaacaca aactattatt aagtttagga actgtattaa ctgctacttt ttcttttcct 60

ttaattgctg ctaaatgtga tggcaatgac aagaaggaag aaaagaaaaa agttgaagaa 120

cctgcaaaac aagctgaagg agctggaaca ggtgataaaa caacctctgc aagtggaact 180

gctaattcta atggcgcaag ttctaatagt actaatgcac aaaaaacaga tgaaaaagaa 240

ataaaagaaa cttccgattc acctaaaaaa gatggagaaa aggtttcaga taaacataaa 300

gtagcttaca aggatattga ttttgatttt tctaagatta aaatcgtaat tagtaaaaaa 360

gacatcaagg atgaagactt aattccgcct aaaacaggca ataataagca agttttcttt 420

gatactcgtg atggagatac aaagttaagc ggaaagttca agggaaaatt accttgaaaa 480

ggtgttgaaa ttggaactgt tactggtcta ccagacggat attcaattgc tagtgttgag 540

aatccaatcc acaaaaacag aaaaggcaaa attaaagcta gtggatttgt caatgttgaa 600

aaagaaggag acaaactaaa aattaagttt agattcttta agtacaacaa aggagcaagc 660

ccaacagttt caacaaaggt ttacgaagca attatttctt ag 702

Claims (6)

1.一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括牛支原体P30蛋白单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠、带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原和镍螯合的供体磁珠；所述受体微珠具有发光功能，所述供体磁珠具有感光功能；所述牛支原体P30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述编码所述牛支原体P30蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种应用权利要求1～2任一项所述牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)将山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠和镍螯合的供体磁珠分别用1×AlphaLISA稀释剂将其浓度稀释至100μg/ml；

2)在反应板上分别设置阴性对照组和待检测样品组，向所述待检测样品组中每个孔加入5μL带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原、5μL牛支原体P30蛋白单克隆抗体和5μL待测样品；向所述阴性对照组中每个孔加入5μL带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原、5μL牛支原体P30蛋白单克隆抗体和5μL去离子水；然后将所述反应板置于微量震荡器上震荡30～60s，混匀后置于23℃培养箱，孵育1h；

3)向步骤2)反应板中阴性对照组和待检测样品组的每个孔中分别加入5μL步骤1)制备的山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠和镍螯合的供体磁珠，然后将所述反应板置于微量震荡器上震荡30～60s，混匀后置于23℃培养箱，避光孵育1h；

4)将步骤3)反应后的反应板置于AlphaScreen/Lisa检测仪上检测信号值；当阴性对照组的检测值大于待检测样品组检测值的2倍时，即待检测样品中含有牛支原体抗体。

4.根据权利要求3所述牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原的工作浓度为0.5～20μg/ml；所述牛支原体P30蛋白单克隆抗体的工作浓度为0.5～25μg/ml。

5.根据权利要求4所述牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原工作浓度为2.5μg/ml；所述牛支原体P30蛋白单克隆抗体的工作浓度为5μg/ml。

6.根据权利要求3所述牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述AlphaScreen/Lisa检测仪检测时激发光波长为680nm，发射光检测波长为615nm。