CN107831319A - 一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒 - Google Patents

一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细粒棘球绦虫重组抗原Eg95蛋白预包被酶标板、血清稀释液、酶标记结合物稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标记结合物、洗涤液、底物显色液和终止液；细粒棘球绦虫重组抗原制备过程中在Eg95基因的前后分别连接了His标签序列和Myc标签序列，然后采用EcoR I和Xho I同时酶切PCR产物和真核表达载体pPIC9K，胶回收目的片段和载体后进行连接，构建重组质粒pPIC9K‑(His‑Eg95‑Myc)，再将重组质粒转化到毕赤酵母GS115菌，经甲醇诱导表达，经Ni‑NTA纯化。本发明采用双标签序列和真核表达载体系统获得的羊棘球蚴病抗体检测试剂盒抗体，具有特异性强、敏感性高、重复性好、易于操作的优点。

Description

一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程技术和诊断试剂技术领域，尤其涉及一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒。
背景技术
棘球蚴是由棘球属绦虫(Echinococcus)的幼虫寄生于人畜的肝、肺等脏器而引起严重危害人体健康和畜牧业发展的人兽共患的寄生虫病。棘球蚴病呈世界性分布，不仅能感染牛、羊、猪、马、骆驼等家畜以及多种野生动物，而且也能感染人体，其已成为世界范围一个重要的影响公共卫生和经济的问题，因而受到人们的广泛关注。我国是该病发病最高的国家之一，以我国西部的新疆、青海、甘肃、宁夏、西川北部等地最为严重，调查显示，棘球蚴病流行区面积占全国总面积的44％以上，严重影响西部农牧民的身体健康，是造成西部农牧区因病致贫、因病返贫的重要原因之一。
细粒棘球蚴是棘球蚴的一种，细粒棘球蚴对动物机体的危害主要是对脏器的机械性压迫作用和毒素作用导致的脏器萎缩和机能障碍。动物的临床症状随寄生部位和感染数量的不同差异明显，轻度感染或初期症状均不明显。由于棘球蚴包囊在宿主体内不断生长，不仅压迫周围组织使之萎缩和功能障碍，还易造成继发感染，如果包囊破裂，可引起过敏反应，往往造成宿主严重的病症，甚至死亡。
在棘球蚴病防治中，关键环节在于控制动物棘蚴病传染源、切断生活史循环链。一方面，要对流行区的犬等终末宿主进行定期全面的驱虫管理；另一方面，需要对流行区牛、羊进行免疫预防。
Lightowler等人研制了抗细粒棘球绦虫虫卵感染的Eg95疫苗，Eg95重组蛋白疫苗是目前控制棘球蚴病唯一的疫苗，且临床试验证实其能够用于动物的免疫预防，但多采用原核表达系统对其免疫效果进行检测，其特异性和灵敏性较差，目前尚无报道在Eg95基因的前后分别连接标签序列，通过双标签及真核表达系统来评价Eg95疫苗免疫效果的特异性、敏感性检测试剂盒，因而研究开发易于操作的、特异性强的Eg95疫苗免疫学检测试剂盒，对于促进Eg95重组蛋白疫苗的推广应用具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，能够用于羊棘球蚴病抗体的定性检测，具有特异性强、敏感性高、重复性好、易于操作的优点。
本发明是这样实现的，一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括细粒棘球绦虫重组抗原Eg95蛋白预包被酶标板、血清稀释液、酶标记结合物稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标记结合物、洗涤液、底物显色液和终止液；所述细粒棘球绦虫重组抗原是通过以下方法制备的：首先PCR扩增Eg95基因片段，并在Eg95基因的前后分别连接His标签序列和Myc标签序列，然后采用EcoRI和XhoI同时酶切PCR产物和真核表达载体pPIC9K，胶回收目的片段和载体后进行连接，构建重组质粒pPIC9K-(His-Eg95-Myc)，再将重组质粒转化到毕赤酵母GS115菌，经甲醇诱导表达，经Ni-NTA纯化。
进一步，所述细粒棘球绦虫重组抗原的包被的方法为：将纯化的重组蛋白Eg95用包被缓冲液稀释至5μg/mL，包被酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，用洗涤液洗涤3次，每次2min；然后加入含质量分数5％脱脂奶粉的PBS封闭液，每孔加200μL，37℃孵育2h，随后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次2min，真空包装后置于4℃保存备用。
进一步，所述血清稀释液为含BSA和0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液，血清稀释度为1:100，血清反应条件为37℃2h。
进一步，所述阴性对照液为健康未免疫棘球蚴Eg95疫苗的羊血清，所述阳性对照液为含有Eg95抗体的羊血清。
进一步，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG酶标抗体，所述酶标记结合物稀释度为1:7500，反应条件为37℃下反应30min。
进一步，所述洗涤液为含质量分数0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液。
进一步，所述底物显色液的配方为：每500mL加乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50mL和TMB粉末0.15g。
进一步，所述底物显色液反应条件为37℃下反应10-15min。
进一步，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明以重组蛋白Eg95为抗原来检测羊棘球蚴病抗体，在Eg95基因的前后分别连接His标签序列和Myc标签序列，通过EcoRI和XhoI同时酶切PCR产物和真核表达载体pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-(His-Eg95-Myc)，所得抗体检测试剂盒特异性强、敏感性高、稳定性好，可用于羊棘球蚴病抗体的定性检测。
附图说明
图1是本发明实施例提供的未纯化的带双标签(pPIC9K-His-Eg95-myc)细粒棘球绦虫重组Eg95蛋白SDS-PAGE电泳图；图中，M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)；1：诱导表达前上清液；2-6：重组Eg95蛋白，箭头所指为重组蛋白。
图2是本发明实施例提供的纯化的带双标签(pPIC9K-His-Eg95-myc)细粒棘球绦虫重组Eg95蛋白SDS-PAGE电泳图；图中，M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)；1：洗脱蛋白；2：未结合蛋白。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1、实验试剂及仪器
试剂：血清；血清稀释液，血清稀释液优选含BSA和0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液；兔抗羊和鼠抗羊IgG-辣根过氧化物酶结合物；包被缓冲液；洗涤液，洗涤液优选含质量分数0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液；封闭缓冲液；抗免疫球蛋白-酶结合物稀释液；底物显色液，优选每500mL加乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50mL和TMB粉末0.15g；终止液优选为2mol/L的硫酸溶液。
仪器：酶联免疫检测仪、单道移液器、8道或12道移液器、加样器、洗板机等。
耗材：ELISA微量反应板，选用96孔聚苯乙烯微量酶标板；血清稀释板、移液器吸头等。
2、羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒的制备
2.1细粒棘球绦虫Eg95重组蛋白的表达与纯化
首先PCR扩增Eg95基因片段，并在Eg95基因的前后分别连接His标签序列和Myc标签序列，然后采用EcoRI和XhoI同时酶切PCR产物和真核表达载体pPIC9K，胶回收目的片段和载体后进行连接，构建重组质粒pPIC9K-(His-Eg95-Myc)，再将重组质粒转化到毕赤酵母GS115菌，经甲醇诱导表达，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示，在约15kDa处出现特异性条带，与预期一致，电泳分析结果提示目的蛋白主要以可溶性形式表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化后，纯度达90％以上，如图2所示。
2.2抗原最佳包被浓度的确定
将包被抗原细粒棘球绦虫重组抗原Eg95蛋白用包被缓冲液倍比稀释成40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.25μg/mL，酶标板每个孔加入100μL，即每个孔最终抗原总量依次为4μg/孔、2μg/孔、1μg/孔、0.5μg/孔、0.25μg/孔和0.125μg/孔。
用包被缓冲液稀释后包被96孔酶标板，置37℃水浴孵育2h后转至4℃包被过夜。用洗涤液洗涤3次拍干，加入封闭液于37℃封闭2h。将2份阴性血清和6份阳性血清分别以1:100进行系列稀释后，每孔加入100μL，每份血清在同一抗原包被浓度条件下加样两次，即复孔加样；然后反应1h，洗涤3次拍干，每孔加入100μL酶标二抗(稀释倍数1:10000)反应1h；洗涤3次拍干。加入TMB底物显色液100μL/孔，避光反应15min，然后以50μL/孔的量加入2mol/LH2SO4终止反应，置酶标检测仪测定OD450nm值，测定结果如下表1所示：
表1抗原包被浓度筛选结果
通过表1中测定的实验数据，计算免疫羊抗血清相对OD450nm值与阴性对照血清相对OD450nm值，即P/N值，选择P/N值相对较大的抗原包被浓度5μg/mL(0.5μg/孔)为最佳包被浓度。
2.3抗原包被最佳条件的确定
根据2.2选择的包被浓度进行细粒棘球绦虫重组抗原Eg95蛋白包被，将包被板分别置于以下3中条件下包被：(1)37℃2h；(2)4℃过夜；(3)37℃2h后4℃过夜。阳性血清为Eg95疫苗免疫羊血清，阴性血清为未用Eg95疫苗免疫羊血清，按2.2所述包被方法及最佳包被浓度分别对采用上述包被条件的3份Eg95阴性血清(记作N1、N2和N3)和3份阳性血清(记作P1、P2和P3)进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450nm值，测定结果如下表2所示：
表2抗原包被最佳条件
计算P/N值，由表2可知，在4℃条件下封闭过夜测出的P/N值最大，故选择4℃过夜封闭为抗原包被最佳条件。
2.4血清最佳稀释度的确定
用血清稀释液分别以稀释度1：25、1：50、1：100、1：200稀释2份阳性血清(P1和P2)以及2份阴性血清(N1和N2)为一抗。按照2.2的方法进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表3所示：
表3最佳血清稀释度的选择
计算P/N值，由表3可知，选定阳性血清平均OD450nm值较大，而P/N值较大时的反应孔的血清稀释度作为最佳工作条件，在此基础上确定血清最佳稀释度为1：100。
2.5封闭液及封闭条件的选择
(1)封闭液的选择：选用含质量分数分别为5％脱脂奶粉、10％脱脂奶粉、5％BSA、10％牛血清白蛋白的PBS封闭液以及从某公司购买的封闭液(Casein)进行封闭，按照2.3确定的最佳封闭条件进行封闭，按2.4确定的血清最佳稀释倍数对3份Eg95阴性血清(记作N1、N2和N3)和3份阳性血清(记作P1、P2和P3)稀释，每个样品重复2次，其他ELISA测定方法同2.2，测定各孔OD450nm值，测定结果如表4所示：
表4最佳封闭液筛选结果
计算P/N值，结果见表4，可知含质量分数5％的脱脂奶粉的PBS封闭液封闭的ELISA板的P/N值最大，其次是从某公司购买的封闭液(Casein)，综合考虑来源和经济因素，确定含质量分数5％脱脂奶粉的PBS封闭液为最佳封闭液。
(2)最佳封闭时间的选择：以最适抗原浓度包被酶标板，用选定的最佳封闭液进行封闭，封闭时间分别为1h、2h和3h，然后阳性血清按2.4确定的血清最佳稀释倍数稀释，每个样品重复2次，其他ELISA测定方法同2.2。测定各孔OD450nm值，测定结果如表5所示：
表5最佳封闭时间筛选结果
比较各组阴性血清和阳性血清的OD450nm值，计算P/N值，有表5可知在37℃的温度下封闭2h测出的P/N值最大，故选择37℃2h为最佳封闭条件。
2.6血清样品最佳反应时间的确定
在以上测定的最佳试验条件的基础上，对血清样品的最佳反应时间进行筛选，加入血清之后，分别在37℃反应15min、30min、60min、90min，按2.2的方法对3份Eg95阴性血清(N1、N2和N3)和3份阳性血清(P1、P2和P3)进行ELISA试验，每个样品重复3次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表6所示：
表6血清样品最佳反应时间筛选
计算P/N值，由表6可知，血清反应30min所测定的P/N值最高，因此确定37℃条件下血清反应最佳时间为30min。
2.7酶标记结合物最佳稀释度及反应时间的确定
(1)在以上测定的最佳试验条件的基础上，对酶标记的最佳稀释度和反应时间进行筛选，将酶标抗体按稀释倍数分别为1：5000、1：7500、1：10000稀释，然后于37℃分别温育30min，其他操作步骤按2.2的方法对3份阴性血清3份阳性血清进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表7所示：
表7酶标记结合物最佳稀释度筛选
计算P/N值和平均P/N值，表7表明酶标记结合物在1:7500稀释倍时，P/N值达到最大，所以1:7500为酶标记结合物最佳稀释度。
(2)按照2.7(1)中筛选好的酶结合物最佳稀释度稀释后，于37℃分别温育15min、30min、60min、90min，按2.2的方法对3份阴性血清(N1、N2和N3)和3份阳性血清(P1、P2和P3)进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表8所示：
表8酶标记结合物最佳反应时间的筛选
计算阴性平均值、阳性平均值和平均P/N值，由表8可知酶标结合物作用30min时P/N值达到最大，因此，选择30min为最佳酶标抗体作用时间。
2.8底物的最佳反应时间
酶标抗体按前述优化好的时间作用、洗涤、加入底物显色液后于37℃分别反应5min、10min、15min及30min，按2.2的方法对6份阴性血清和6份阳性血清进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表9所示：
表9底物的最佳反应时间筛选
计算P/N值，结果见表9，底物反应10min时平均P/N值最高，达9.72，底物反应15min的平均P/N值次之，为9.41。因此选定底物反应10min为最佳反应时间，但考虑到实际操作中，如果一次检测样品较多时，将底物反应时间控制在10min～15min即可选择底物最佳反应时间。
2.9临界值的确定
取24份阴性羊血清按稀释倍数为1：100稀释，在筛选的最佳条件下进行间接ELISA测定，对检测结果进行统计学分析，得到OD450平均值(X)和标准差(SD)。将时，判为阳性；时，判为阴性。
3、羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒的检测方法
(1)包被板室温平衡并稀释待检血清：取抗原包被板，打开真空包装后至室温30min；同时将待检血清分别稀释50倍；将稀释好的待检血清和对照各取100μL加入到抗原包被板孔中，待检样品设1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，每孔100μL；置37℃孵育30min；
(2)甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液250-300μL，静置2min后倒掉，再在吸水纸上拍干，共洗涤3次；
(3)每孔加兔抗羊酶标二抗100μL，置37℃温育30min；
(4)洗涤3次，洗涤过程同(2)；
(5)每孔先加底物显色液100μL，室温避光显色15min；
(6)每孔加终止液50μL，10min内测定结果；
(7)利用酶标仪在OD450nm测定光吸收(OD)值；
结果判定：试验成立的条件是阳性对照孔平均OD450nm值≥0.3，阴性对照孔平均OD450nm值必须＜0.3；样品OD450nm值≥0.3，判为阳性；样品OD450nm值＜0.3。
4、羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测结果评价
(1)敏感性试验
取1份阳性血清和1份阴性血清，分别从1：200倍开始倍比稀释，按照优化好的条件进行间接ELISA试验，测定每孔OD450nm值，测定结果如表10所示：
表10敏感性试验结果
统计P/N值，结果见表10，当血清稀释倍数为6400时，结果仍为阳性，证明所建立的方法具有较好的敏感性。当P/N值大于等于2.0时对应的血清稀释倍数为最高稀释度，最高稀释度为1：6400。
(2)特异性试验
分别取细粒棘球绦虫抗原B(AgB)免疫羊血清、多头带绦虫TM18蛋白免疫羊血清、3份细粒棘球绦虫抗原Eg95阴性血清和3份阳性血清，按照已筛选好的稀释度(即1:100)稀释，用已优化的间接ELISA条件检测，每份血清平行做2个重复，观察各血清与系统是否有交叉反应，试验结果如表11所示：
表11特异性试验结果
由表11可知，以Eg95蛋白包被酶标板，阳性对照平均值OD450nm值为1.495，阴性对照平均OD450nm值为0.160，与细粒棘球绦虫抗原B(AgB)免疫羊血清、多头带绦虫TM18蛋白免疫羊血清反应，OD450nm值分别为0.153和0.138，均与阴性对照相似，空白对照平均OD450nm值为0.062。说明该试剂盒具有良好的特异性。
(3)重复性试验
批内重复性试验：
取5份阳性血清(记作P1～P5)在选择好的条件下进行间接ELISA测定，每份血清样品平行做10个重复，按以下公式计算变异系数(coefficient of variance，CV)：CV＝[样本OD450值标准差(S)/样本OD450值平均数]×100％，试验结果如表12所示：
表12批内重复性试验结果
试验结果如表12所示，用同一批制备的Eg95蛋白包被ELISA板，对5种样品进行检测，每种样品重复10孔，批内重复试验的变异系数均值为2.566％～4.883％，低于10％，表明该ELISA检测方法具有良好的批内重复性。
批间重复性试验
取3份不同批次的Eg95蛋白包被，在选择最佳的条件下对5种血清进行间接ELISA测定。每种样品重复3次，取平均值，同批内重复性试验的方法观察其CV值，试验结果如表13所示：
表13批间重复性试验结果
试验结果见表13，用3个不同批次的蛋白包被板对5种样品进行检测，每种血清重复三次，5种血清在3批次ELISA板测定的OD450nm值变异系数为2.378％～4.222％，低于10％，表明该ELISA检测方法具有良好的批间重复性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细粒棘球绦虫重组抗原Eg95蛋白预包被酶标板、血清稀释液、酶标记结合物稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标记结合物、洗涤液、底物显色液和终止液；所述细粒棘球绦虫重组抗原是通过以下方法制备的：首先PCR扩增Eg95基因片段，并在Eg95基因的前后分别连接His标签序列和Myc标签序列，然后采用EcoR I和Xho I同时酶切PCR产物和真核表达载体pPIC9K，胶回收目的片段和载体后进行连接，构建重组质粒pPIC9K-(His-Eg95-Myc)，再将重组质粒转化到毕赤酵母GS115菌，经甲醇诱导表达，经Ni-NTA纯化。
2.如权利要求1所述的羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述细粒棘球绦虫重组抗原的包被方法为：将纯化的重组蛋白Eg95用包被缓冲液稀释至5μg/mL，包被酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，用洗涤液洗涤3次，每次2min；然后加入含质量分数5％脱脂奶粉的PBS封闭液，每孔加200μL，37℃孵育2h，随后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次2min，真空包装后置于4℃保存备用。
3.如权利要求1所述的羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液为含BSA和0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液，血清稀释度为1:100，血清反应条件为37℃下反应2h。
4.如权利要求1所述的羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照液为健康未免疫棘球蚴Eg95疫苗的羊血清，所述阳性对照液为含有Eg95抗体的羊血清。
5.如权利要求1所述的羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG酶标抗体，所述酶标记结合物稀释度为1:7500，反应条件为37℃下反应30min。
6.如权利要求1所述的羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含质量分数0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液。
7.如权利要求1所述的羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色液的配方为：每500mL加乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50mL和TMB粉末0.15g。
8.如权利要求1或7所述的羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色液反应条件为37℃下反应10-15min。
9.如权利要求1所述的羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
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