CN112014556A - 一种牛棘球蚴eg95蛋白抗体间接elisa检测试剂盒 - Google Patents

一种牛棘球蚴eg95蛋白抗体间接elisa检测试剂盒 Download PDF

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李文静
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Abstract

本发明公开了一种牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，包括细粒棘球绦虫重组抗原EG95蛋白预包被酶标板、血清稀释液、酶标记结合物稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标记结合物、洗涤液、底物显色液和终止液；细粒棘球绦虫重组抗原制备过程中在EG95基因采用Xho I和EcoRⅠ同时酶切PCR产物和真核表达载体pGAPZαA，胶回收目的片段和载体后进行连接，构建重组质粒pGAPZαA‑Eg95，再将重组质粒转化到毕赤酵母SMD1168菌，连续经含100μg/mL和200μg/mL Zeocin的YPD培养基筛选，然后经甘油诱导表达。本发明采用真核表达系统获得的重组蛋白EG95用于创制牛棘球蚴病抗体检测试剂盒，具有特异性强、敏感性高、重复性好、易于操作优点。

Description

一种牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程技术和诊断试剂技术领域，尤其涉及一种牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒。
背景技术
棘球蚴病(echinococcosis)，俗称包虫病，是由棘球属绦虫的幼虫——棘球蚴寄生于动物(包括人)的肝、肺等组织而引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病，是全球性重要公共卫生问题之一。棘球蚴病被世界动物卫生组织(OIE)归为全球通报的传染性疫病，被世界卫生组织(WHO)列为17种被忽视的热带病(Neglected tropical diseases,NTDs)之一。棘球蚴病不仅影响着发展中国家和地区的贫困人群，而且对一些国家或地区动物及动物产品国际贸易构成了障碍。
在棘球蚴病防治中，关键环节在于控制动物棘蚴病传染源、切断生活史循环链。一方面，需要管控棘球蚴病变牛、羊内脏饲喂犬等食肉动物，同时，对流行区牛、羊进行免疫预防。另一方面，要按照“犬犬驱虫、月月投药”的方案对流行区犬等终末宿主进行全面的驱虫管理。
Lightowlers等人研制了抗细粒棘球绦虫虫卵感染的EG95基因工程亚单位重组抗原疫苗，是目前控制棘球蚴病的有效疫苗，且临床试验证实其能够用于动物的免疫预防，但多采用原核表达系统表达的重组蛋白构建的试剂盒对其免疫效果进行检测，其特异性和灵敏性较差，非特异性反应明显。目前尚无报道针对牛棘球蚴病疫苗免疫抗体评价的试剂盒。基于用真核表达系统(如毕赤酵母表达系统)表达的EG95蛋白建立的检测方法和试剂盒目前未见报道。因而研发易于操作的、特异性强、敏感性高的牛棘球蚴病疫苗免疫抗体检测试剂盒，对评价和推广牛棘球蚴病疫苗，以控制棘球蚴病的流行具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，能够用于牛棘球蚴病疫苗免疫抗体的定性检测，具有特异性强、敏感性高、重复性好、易于操作的优点。
本发明的技术方案：一种牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括细粒棘球绦虫重组抗原EG95蛋白预包被酶标板、血清稀释液、酶标记结合物稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标记结合物、洗涤液、底物显色液和终止液；细粒棘球绦虫重组抗原EG95是通过以下方法制备的：首先PCR扩增EG95基因片段(碱基序列为：
CAGGAATACAAGGGTATGGGTGTTGAGACTCGTACGACTGAGACTCCTTTGAGGAAACACTTTAACCTGACCCCAGTTGGATCGCAAGGTATCAGACTTTCATGGGAAGTGCAACATCTGTCTGATTTGAAAGGTACCGACATCTCCCTGAAAGCTGTCAATCCTTCCGATCCCTTGGTTTACAAGAGACAAACAGCAAAGTTTAGCGACGGTCAGCTAACAATTGGAGAGTTAAAACCATCTACTTTGTATAAGATGACCGTTGAAGCTGTGAAGGCTAAAAAGACAATTCTTGGCTTCACTGTGGATATTGAGACTCCAAGAGCCGGAAAAAAGGAAAGTACTGTAATGACATAA)，并引入Xho I和EcoRⅠ酶切位点，然后采用EcoRⅠ和Xho I同时酶切PCR产物和真核表达载体pGAPZαA，胶回收目的片段和载体，然后进行连接，构建重组质粒pGAPZαA-EG95，再将重组质粒转化到毕赤酵母SMD1168菌株感受态细胞中，经含Zeocin的YPD培养基筛选，然后经甘油诱导表达，并经蛋白层析技术纯化。
抗原包被的方法：将纯化的重组蛋白EG95用包被缓冲液稀释至10μg/mL，包被酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，用洗涤液洗涤3次，每次2min；然后加入含质量分数5％脱脂奶粉的PBS封闭液，每孔加200μL，37℃孵育2h，随后用洗涤液洗涤3次，每次2min，真空包装后置于4℃保存备用。
优选的：所述血清稀释液为含BSA和0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液，血清稀释度为1:100，血清反应条件为37℃60min。
所述阴性对照液为健康未免疫棘球蚴EG95疫苗的牛血清，所述阳性对照液为含有EG95抗体的牛血清。
所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG酶标抗体，所述酶标记结合物稀释度为1:10000，反应时间为37℃30min。
所述洗涤液为含质量分数0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液。
优选的：所述底物显色液的配方为：每500mL去离子水加乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50mL、TMB粉末0.15g。底物显色液反应条件为37℃、时间10-15min。
优选的：所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明以重组蛋白EG95为抗原来检测牛棘球蚴疫苗免疫抗体，通过Xho I和EcoR Ⅰ同时酶切PCR产物和真核表达载体PGAPZαA，构建重组质粒PGAPZαA-EG95，用毕赤酵母表达系统所表达的重组蛋白作为包被抗原制备的抗体检测试剂盒，其特异性强、敏感性高、稳定性好，可用于牛棘球蚴病疫苗免疫抗体的定性检测等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的未纯化的细粒棘球绦虫重组EG95蛋白SDS-PAGE电泳图；图中，M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)；1-3：1-3：重组酵母工程菌在甘油诱导后48h、72h和96h时的上清液，箭头所指为EG95重组蛋白。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.实验试剂及仪器
试剂：血清；血清稀释液，血清稀释液优选含BSA和0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液；兔抗牛或鼠抗牛IgG-辣根过氧化物酶结合物；包被缓冲液；洗涤液，洗涤液优选含质量分数0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液；封闭缓冲液；抗免疫球蛋白-酶结合物稀释液；底物显色液，优选每500mL加乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50mL和TMB粉末0.15g；终止液优选为2mol/L的硫酸溶液。
仪器：酶联免疫检测仪、单道移液器、8道或12道移液器、加样器、洗板机等。
耗材：ELISA微量反应板，选用96孔聚苯乙烯微量酶标板；血清稀释板、移液器吸头等。
2.牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒的制备
2.1细粒棘球绦虫EG95重组蛋白的表达与纯化
首先用PCR扩增EG95基因片段，并引入Xho I和EcoRⅠ酶切位点，然后采用Xho I和EcoRⅠ同时酶切PCR产物和真核表达载体PGAPZαA，胶回收目的片段和载体后进行连接，构建重组质粒PGAPZαA-EG95，再将重组质粒线性化后转化到毕赤酵母SMD1168菌株，经甘油诱导表达，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示，在约15kDa处出现特异性条带，与预期一致，电泳分析结果提示目的蛋白主要以分泌性形式表达。
2.2抗原最佳包被浓度的确定
将包被抗原细粒棘球绦虫重组抗原EG95蛋白用包被缓冲液倍比稀释成40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.25μg/mL，酶标板每个孔加入100μL，即每个孔最终抗原总量依次为4μg/孔、2μg/孔、1μg/孔、0.5μg/孔、0.25μg/孔和0.125μg/孔。
用包被缓冲液稀释后包被96孔酶标板，置37℃水浴孵育2h后转至4℃包被过夜。用洗涤液洗涤3次拍干，加入封闭液于37℃封闭2h。将2份阴性血清和6份阳性血清分别以1:100进行系列稀释后，每孔加入100μL，每份血清在同一抗原包被浓度条件下加样两次，即复孔加样；然后反应1h，洗涤3次拍干，每孔加入100μL酶标二抗(稀释倍数1:10000)反应1小时；洗涤3次拍干。加入TMB底物显色液100μL/孔，避光反应15min，然后以50μL/孔的量加入2mol/L H2SO4终止反应，置酶标检测仪测定OD450 nm值，测定结果如下表1所示：
表1抗原包被浓度筛选结果
Figure BDA0002616674050000041
通过表1中测定的实验数据，计算免疫牛抗血清相对OD450nm值与阴性对照血清相对OD450nm值，即P/N值，选择P/N值相对较大的抗原包被浓度10μg/mL(1μg/孔)为最佳包被浓度。
2.3抗原包被最佳条件的确定
根据2.2选择的包被浓度进行细粒棘球绦虫重组抗原EG95蛋白包被，将包被板分别置于以下3中条件下包被：(1)37℃2h后4℃过夜；(2)37℃2h；(3)4℃过夜。阳性血清为EG95疫苗免疫牛血清，阴性血清为未用EG95疫苗免疫牛血清，按2.2所述包被方法及最佳包被浓度分别对采用上述包被条件的3份EG95阴性血清(记作N1、N2和N3)和4份阳性血清(记作P1、P2、P3和P4)进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450 nm值，测定结果如下表2所示：
表2抗原包被最佳条件
Figure BDA0002616674050000051
计算P/N值，由表2可知，在4℃条件下封闭过夜测出的P/N值最大，故选择4℃过夜封闭为抗原包被最佳条件。
2.3封闭液的选择确定
(1)封闭液的选择：选用含质量分数分别为5％牛血清白蛋白(BSA)和5％脱脂奶粉的PBS封闭液以及从某公司购买的封闭液进行封闭，按照2.3确定的最佳封闭条件进行封闭，按1:100的血清稀释倍数对3份EG95阴性血清(记作N1、N2和N3)和4份阳性血清(记作P1、P2、P3和P4)稀释，每个样品重复2次，其他ELISA测定方法同2.2，测定各孔OD450 nm值，测定结果如表3所示：
表3最佳封闭液筛选结果
Figure BDA0002616674050000052
Figure BDA0002616674050000061
计算P/N值，结果见表3。由结果可知购买的商品化封闭液封闭的ELISA板的P/N值最大，为10.789，其次是含质量分数5％的脱脂奶粉的PBS封闭液封闭的ELISA板，其P/N值为9.132，综合考虑来源和经济因素，确定使用含质量分数5％脱脂奶粉的PBS封闭液。
2.4最佳封闭时间的确定
以最适抗原浓度包被酶标板，用选定的最佳封闭液进行封闭，封闭时间分别为1h、2h和3h，阴、阳性血清按照1:100的稀释倍数稀释，每个样品重复2次，其他ELISA测定方法同2.2。测定各孔OD450nm值，测定结果如表4所示：
表4最佳封闭时间筛选结果
Figure BDA0002616674050000062
比较各组阴性血清和阳性血清的OD450nm值，计算P/N值，由表4可知在37℃的温度下封闭2h测出的P/N值最大，故选择37℃2h为最佳封闭条件。
2.5血清最佳稀释度的确定
用血清稀释液分别以稀释度1:25、1:50、1:100、1:200稀释2份阳性血清(P1和P2)以及2份阴性血清(N1和N2)为一抗。按照2.2的方法进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表5所示：
表5最佳血清稀释度的选择
Figure BDA0002616674050000063
Figure BDA0002616674050000071
计算P/N值，由表3可知，选定阳性血清平均OD450nm值较大，而P/N值较大时的反应孔的血清稀释度作为最佳工作条件，在此基础上确定血清最佳稀释度为1:100。
2.6血清样品最佳反应时间的确定
在以上测定的最佳试验条件的基础上，对血清样品的最佳反应时间进行筛选，加入血清之后，分别在37℃反应15min、30min、60min、90min，按2.2的方法对3份EG95阴性血清(N1、N2和N3)和4份阳性血清(P1、P2、P3和P4)进行ELISA试验，每个样品重复3次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表6所示：
表6血清样品最佳反应时间筛选
Figure BDA0002616674050000072
计算P/N值，由表6可知，血清反应30min所测定的P/N值最高，因此确定37℃条件下血清反应最佳时间为30min。
2.7酶标记结合物最佳稀释度及反应时间的确定
(1)在以上测定的最佳试验条件的基础上，对酶标记的最佳稀释度和反应时间进行筛选，将酶标抗体按稀释倍数分别为1:5000、1:7500、1:10000、1:20000稀释，然后于37℃分别温育30min，其他操作步骤按2.2的方法对3份阴性血清4份阳性血清进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表7所示：
表7酶标记结合物最佳稀释度筛选
Figure BDA0002616674050000081
计算P/N值和平均P/N值，表7表明酶标记结合物在1:10000稀释倍时，P/N值达到最大，所以1:10000为酶标记结合物最佳稀释度。
(2)按照2.7(1)中筛选好的酶结合物最佳稀释度稀释后，于37℃分别温育15min、30min、60min、90min，按2.2的方法对3份阴性血清(N1、N2和N3)和4份阳性血清(P1、P2、P3和P4)进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表8所示：
表8酶标记结合物最佳反应时间的筛选
Figure BDA0002616674050000082
计算阴性平均值、阳性平均值和平均P/N值，由表8可知酶标结合物作用30min时P/N值达到最大，因此，选择30min为最佳酶标抗体作用时间。
2.8底物的最佳反应时间
酶标抗体按前述优化好的时间作用、洗涤、加入底物显色液后于37℃分别反应5min、10min、15min及30min，按2.2的方法对6份阴性血清和6份阳性血清进行ELISA试验，每个样品重复2次，测定各孔OD450nm值，测定结果如表9所示：
表9底物的最佳反应时间筛选
Figure BDA0002616674050000091
计算P/N值，结果见表9，底物反应10min时平均P/N值最高，达9.951，底物反应15min的平均P/N值次之，为9.792。因此选定底物反应10min为最佳反应时间，但考虑到实际操作中，如果一次检测样品较多时，将底物反应时间控制在10～15min即可选择底物最佳反应时间。
2.9临界值的确定
取24份阴性牛血清按稀释倍数为1:100稀释，在筛选的最佳条件下进行间接ELISA测定，统计所检阴性血清的OD450nm和相应的S/P值的平均值(X)和标准差(SD)，根据统计学原理确定临界值。确定
Figure BDA0002616674050000092
表10临界值确定统计表
Figure BDA0002616674050000093
Figure BDA0002616674050000101
根据表10检测结果，计算24份血清检测结果(S/P)的平均值
Figure BDA0002616674050000102
为0.098917，标准差(SD)为0.0356098，
Figure BDA0002616674050000103
为便于结果统计，将临界值确定为0.2，因此若S/P值≥0.2，血清应判定为牛棘球蚴病疫苗免疫抗体阳性；若S/P值＜0.2，血清应判定为牛棘球蚴病疫苗免疫抗体阴性。
3.牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒的检测方法
(1)包被板室温平衡并稀释待检血清：取抗原包被板，打开真空包装后至室温30min；同时将待检血清分别稀释100倍；将稀释好的待检血清和对照各取100μL加入到抗原包被板孔中，待检样品设1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，每孔100μL；置37℃孵育30min；
(2)甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液250～300μL，静置2min后倒掉，再在吸水纸上拍干，共洗涤3次；
(3)每孔加兔抗牛酶标二抗100μL，置37℃温育30min；
(4)洗涤3次，洗涤过程同(2)；
(5)每孔先加底物显色液100μL，室温避光显色15min；
(6)每孔加终止液50μL，10～15min测定结果；
(7)利用酶标仪在OD450nm测定光吸收(OD)值；
结果判定：试验成立的条件是阳性对照孔平均OD450nm值≥0.3，阴性对照孔平均OD450nm值必须＜0.3；样品OD450nm值≥0.3，判为阳性；样品OD450nm值＜0.3。
4.牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测结果评价
(1)敏感性试验
取2份阳性血清和2份阴性血清，分别从1:100倍开始倍比稀释，按照优化好的条件进行间接ELISA试验，测定每孔OD450nm值，测定结果如表11所示：
表11敏感性试验结
Figure BDA0002616674050000104
Figure BDA0002616674050000111
统计P/N值，结果见表11，当血清稀释倍数为1:102400时，结果仍为阳性，证明所建立的方法具有较好的敏感性，最高稀释度为1:102400。
(2)特异性试验
分别取细粒棘球蚴病牛血清1份、细粒棘球绦虫抗原B(AgB)免疫牛血清、3份细粒棘球绦虫抗原EG95阴性血清和4份阳性血清，按照已筛选好的稀释度(即1:100)稀释，用已优化的间接ELISA条件检测观察各血清与系统是否有交叉反应，试验结果如表11所示：
表12特异性试验结果
Figure BDA0002616674050000112
由表12可知，以EG95蛋白包被酶标板，阳性对照平均值OD450nm值为1.539，阴性对照平均OD450nm值为0.186，与细粒棘球蚴病牛血清、细粒棘球绦虫抗原B(AgB)免疫牛血清反应的OD450nm值分别为0.183和0.158，均与阴性对照相似，空白对照平均OD450nm值为0.064。说明该试剂盒具有良好的特异性。
(3)重复性试验
批内重复性试验：
取3份阴性血清(记作N1～N3)和4份阳性血清(记作P1～P4)在选择好的条件下进行间接ELISA测定，每份血清样品平行做10个重复，按以下公式计算变异系数(coefficientof variance，CV)：CV＝[样本S/P值标准差(S)/样本S/P值平均数]×100％，试验结果如表13所示：
表13批内重复性试验结果
Figure BDA0002616674050000121
从表13可知，用同一批制备的EG95蛋白包被ELISA板，对7个样品进行检测，每个样品重复10孔，批内重复试验的变异系数均值为1.221％～9.554％，低于10％，表明该ELISA检测方法具有良好的批内重复性。
批间重复性试验
取3份不同批次的EG95蛋白包被酶标板，在选择最佳的条件下对3份阴性血清(记作N1～N3)和4份阳性血清(记作P1～P4)进行间接ELISA测定。每份样品重复3次，取平均值，同批内重复性试验的方法计算其CV值，试验结果如表14所示：
表14批间重复性试验结果
Figure BDA0002616674050000122
从表14可知，3个批次的蛋白包被的ELISA检测板之间最大的变异系数为9.792％，低于15％，说明该ELISA检测方法具有良好的批间重复性。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)
<400> 1
caggaataca agggtatggg tgttgagact cgtacgactg agactccttt gaggaaacac 60
tttaacctga ccccagttgg atcgcaaggt atcagacttt catgggaagt gcaacatctg 120
tctgatttga aaggtaccga catctccctg aaagctgtca atccttccga tcccttggtt 180
tacaagagac aaacagcaaa gtttagcgac ggtcagctaa caattggaga gttaaaacca 240
tctactttgt ataagatgac cgttgaagct gtgaaggcta aaaagacaat tcttggcttc 300
actgtggata ttgagactcc aagagccgga aaaaaggaaa gtactgtaat gacataa 357
<210> 2
<211> 357
<212> DNA
<213> 重组质粒基因片段(pGAPZαA-EG95)
<400> 2
caggaataca agggtatggg tgttgagact cgtacgactg agactccttt gaggaaacac 60
tttaacctga ccccagttgg atcgcaaggt atcagacttt catgggaagt gcaacatctg 120
tctgatttga aaggtaccga catctccctg aaagctgtca atccttccga tcccttggtt 180
tacaagagac aaacagcaaa gtttagcgac ggtcagctaa caattggaga gttaaaacca 240
tctactttgt ataagatgac cgttgaagct gtgaaggcta aaaagacaat tcttggcttc 300
actgtggata ttgagactcc aagagccgga aaaaaggaaa gtactgtaat gacataa 357

Claims (8)

1.一种牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括细粒棘球绦虫重组抗原EG95蛋白预包被酶标板、血清稀释液、酶标记结合物稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标记结合物、洗涤液、底物显色液和终止液；细粒棘球绦虫重组抗原EG95是通过以下方法制备的：首先PCR扩增EG95基因片段，并引入Xho I和EcoR Ⅰ酶切位点，然后采用EcoR Ⅰ和Xho I同时酶切PCR产物和真核表达载体pGAPZαA，胶回收目的片段和载体，然后进行连接，构建重组质粒pGAPZαA-EG95，再将重组质粒转化到毕赤酵母SMD1168菌株感受态细胞中，经含Zeocin的YPD培养基筛选，然后经甘油诱导表达，并经蛋白层析技术纯化。
2.如权利要求1所述的牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：抗原包被的方法：将纯化的重组蛋白EG95用包被缓冲液稀释至10μg/mL，包被酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，用洗涤液洗涤3次，每次2min；然后加入含质量分数5％脱脂奶粉的PBS封闭液，每孔加200μL，37℃孵育2h，随后用洗涤液洗涤3次，每次2min，真空包装后置于4℃保存备用。
3.如权利要求1所述的牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述血清稀释液为含BSA和0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液，血清稀释度为1:100。
4.如权利要求1所述的牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照液为健康未免疫棘球蚴EG95疫苗的牛血清，所述阳性对照液为含有EG95抗体的牛血清。
5.如权利要求1所述的牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG酶标抗体，所述酶标记结合物稀释度为1:10000。
6.如权利要求1所述的牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为含质量分数0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液。
7.如权利要求1所述的牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液的配方为：每500mL去离子水加乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50mL、TMB粉末0.15g。
8.如权利要求1所述的牛棘球蚴EG95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
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