CN109738639A - 一种检测猪瘟病毒e0蛋白抗体的elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，包括包被CSFV重组蛋白E0‑1的抗体检测板、以及含辣根过氧化物酶标记的重组蛋白E0‑2和重组蛋白E0‑3的酶标标记物，这些重组蛋白是根据GenBank中CSFV的基因序列合成CSFV E0基因，构建成pFastBac‑E0重组质粒后转染、培养、表达并纯化得到。本试剂盒用于猪瘟E0抗体的检测，从而与猪瘟E2亚单位疫苗抗体进行区分，实现野毒抗体的鉴别诊断。

Description

一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，可用于猪瘟病毒E0蛋白抗体检测及猪瘟病毒感染的诊断。

背景技术

猪瘟又称经典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)，是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的高致病性、接触性传染病，是严重危害全球养猪业的重要传染病。我国长期以来运用猪瘟兔化弱毒疫苗进行广泛免疫接种，控制了猪瘟在我国的大规模的流行爆发，但是猪瘟仍然呈地区性散发性流行，并且非典型猪瘟为主的持续性感染比较常见，该病仍然是危害养猪业的重要传染病。

血清学检测对监测猪群的抗体水平和评价疫苗免疫效果具有重要作用，其中酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前使用最为广泛的技术，但是现有的商品化检测试剂盒基本上被国外公司的产品所垄断，并且主要针对E2蛋白抗体进行检测。由于现在的疫苗与野毒均能产生E2蛋白抗体，所以难以区分。随着猪瘟E2亚单位疫苗的上市，猪瘟野毒抗体和疫苗抗体的鉴别诊断成为可能，而E0蛋白作为猪瘟病毒另外一个重要抗原，比较适合作为诊断抗原来建立鉴别野毒与猪瘟E2亚单位疫苗抗体的ELISA方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测猪瘟E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，用于猪瘟野毒抗体的检测，从而与猪瘟E2亚单位疫苗抗体进行区分，实现鉴别诊断。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒包括包被CSFV重组蛋白E0-1的抗体检测板、以及由酶标E0-2抗原和酶标E0-3抗原混合的酶标标记物，该酶标E0-2抗原和酶标E0-3抗原分别为酶标记的重组蛋白E0-2和酶标记的重组蛋白E0-3；其中，该CSFV重组蛋白E0-1、重组蛋白E0-2和重组蛋白E0-3的制备方法分别如下：

该CSFV重组蛋白E0-1是根据GenBank中CSFV的基因序列合成CSFV E0基因，并将其克隆至pFastBac 1载体，构建pFastBac-E0-1重组质粒，其表达的重组蛋白E0-1的基因序列如SEQ ID No:1所示；将pFastBac-E0-1重组质粒转化至感受态大肠杆菌内，生成重组杆粒；转染重组杆粒DNA至Sf9昆虫细胞系中，生成重组杆状病毒；再将重组杆状病毒继续接种Sf9细胞培养2代，将获得的重组病毒再接种到High Five细胞，表达并纯化得到；

该重组蛋白E0-2是根据GenBank中CSFV的基因序列合成CSFV E0基因，将能够与亲和素发生特异性结合的多肽基因插入至该E0基因5’端，并克隆至pFastBac 1载体，构建pFastBac-E0-2重组质粒，其表达的重组蛋白E0-2的基因序列如SEQ ID No:2所示；将pFastBac-E0-2重组质粒转化至感受态大肠杆菌内，生成重组杆粒；转染重组杆粒DNA至Sf9昆虫细胞系中，生成重组杆状病毒；将重组杆状病毒继续接种Sf9细胞培养2代，将获得的重组病毒再接种到High Five细胞，表达并纯化得到重组蛋白E0-2；

该重组蛋白E0-3是根据GenBank中CSFV的基因序列合成CSFV E0基因，且在该E0基因3’端加入两个赖氨酸的密码子，并克隆至pFastBac 1载体，构建pFastBac-E0-3重组质粒，其表达的重组蛋白E0-3基因序列如SEQ ID No:3所示；将pFastBac-E0-3重组质粒转化至感受态大肠杆菌内，生成重组杆粒；转染重组杆粒DNA至Sf9昆虫细胞系中，生成重组杆状病毒；将重组杆状病毒继续接种Sf9细胞培养2代，将获得的重组病毒再接种到High Five细胞，表达并纯化得到重组蛋白E0-3。

上述试剂盒还包括洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液以及猪瘟抗体阴、阳性对照血清。

上述CSFV重组蛋白E0-1的最佳包被浓度为1.5μg/ml。

上述酶标标记物中酶标记的重组蛋白E0-2和酶标记的重组蛋白E0-3等体积混合，其中，重组蛋白E0-2和重组蛋白E0-3的摩尔浓度均为1.4×10^-7mol/L。

上述酶标记的重组蛋白E0-2是由其含有的多肽基因与辣根过氧化物酶标记的亲和素因亲和作用相结合而得到；上述酶标记的重组蛋白E0-3是将重组蛋白E0-3按化学偶联法偶联辣根过氧化物酶得到。本申请中仅用辣根过氧化物酶进行说明，但本领域内能用于标记抗原的酶皆适用于本申请。

本发明与传统的间接ELISA的主要不同之处在于，用酶标抗原代替酶标抗抗体，酶标抗原不会与非特异性吸附的抗体结合，同时检测标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感性和特异性更高。并且，本发明中酶标抗原与待检血清可同时加入到检测孔中，使反应一步完成，大大的节省了孵育和操作时间。

附图说明

图1是本发明纯化的E0重组蛋白电泳图。

其中，M：蛋白分子量标准；1:重组蛋白E0-1表达上清；2:重组蛋白E0-2表达上清；3:重组蛋白E0-3表达上清；4：纯化的重组蛋白E0-1；5：纯化的重组蛋白E0-2；6：纯化的重组蛋白E0-3。

图2是pFastBac-E0-2重组质粒表达的重组蛋白E0-2的基因序列。

图3是pFastBac-E0-3重组质粒表达的重组蛋白E0-3的基因序列。

具体实施方式

实施例1 CSFV重组蛋白E0-1的制备

1)重组表达质粒的构建：根据GenBank中CSFV的基因序列，人工合成CSFV E0基因，并将其克隆至pFastBac 1载体，构建pFastBac-E0-1重组质粒。pFastBac-E0-1重组质粒表达的重组蛋白E0-1的基因序列如SEQ ID No:1所示。

2)重组杆粒的构建：将pFastBac-E0-1重组质粒转化至大肠杆菌MAX DH10Bac^TM感受态大肠杆菌内，生成重组杆粒。

3)重组杆状病毒的构建：转染重组杆粒DNA至Sf9昆虫细胞系中，生成重组杆状病毒。

4)重组蛋白的表达和纯化：参照Bac-to-杆状病毒表达系统操作手册，将重组杆状病毒继续接种Sf9细胞培养2代，每代次3-5天，将获得的重组病毒再接种到HighFive细胞表达E0-1重组蛋白，将重组蛋白E0-1用Ni²⁺亲和层析法纯化，结合参见图1。

实施例2 酶标E0-2抗原和酶标E0-3抗原的制备

1)重组质粒的构建：根据GenBank中CSFV的基因序列，人工合成CSFV E0基因，将能够与亲和素发生特异性结合的多肽基因(其序列参见图2中下划线所示)插入至E0基因5’端，并克隆至pFastBac 1载体，构建pFastBac-E0-2重组质粒，pFastBac-E0-2重组质粒表达的重组蛋白E0-2的基因序列如SEQ ID No:2所示；将含有伯胺基团的两个连续的赖氨酸基因(其序列参见图3中下划线所示)插入至E0基因3’端与终止子之间，构建pFastBac-E0-3重组质粒，pFastBac-E0-3重组质粒表达的重组蛋白E0-3的基因序列如SEQ ID No:3所示。

2)重组杆粒的构建：将pFastBac-E0-2、pFastBac-E0-3重组质粒转化至大肠杆菌MAX DH10Bac^TM感受态大肠杆菌内，生成重组杆粒。

3)重组杆状病毒的构建：转染重组杆粒DNA至Sf9昆虫细胞系中，生成重组杆状病毒。

4)重组蛋白E0-2和E0-3的纯化：参照Bac-to-杆状病毒表达系统操作手册，将以上两个重组杆状病毒分别继续接种Sf9细胞培养2代，每代次3-5天，将获得的重组病毒再分别接种到High Five细胞表达重组蛋白E0-2和E0-3，将重组蛋白E0-2和E0-3用Ni²⁺亲和层析法纯化，结合参见图1。

5)重组蛋白的酶标记：

将重组蛋白E0-2的浓度调整为2.8×10^-7mol/L，该E0-2蛋白中含有能够与HRP标记的亲和素发生特异性结合的多肽，通过与辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素以4:1的摩尔比例混合，使HRP标记的亲和素与重组蛋白E0-2于4℃作用48小时，两者因亲和作用发生结合，所得产物即为酶标E0-2抗原。

将重组蛋白E0-3的浓度调整为2.8×10^-7mol/L，按化学偶联法偶联辣根过氧化物酶(HRP)。具体过程为：于1mg/ml HRP溶液中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，对1mM醋酸钠缓冲液(PH4.4)4℃透析过夜，加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入2ml待标记的重组蛋白E0-3至1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄液，混匀，4℃放置2小时，对0.15M PBS(pH7.4)4℃透析过夜，在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置1小时后3000rpm/min离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M的PBS(pH7.4)中，对0.15M的PBS(pH7.4)缓冲盐水透析，去除铵离子后，10000rpm/min离心30分钟去除沉淀，取上清用超滤管(购自Millipore公司，滤芯10KDa，产品编号：U650886)将其浓缩至2ml，获得酶标E0-3抗原。

实施例3 检测猪瘟E0抗体的ELISA试剂盒的制备

1)抗原板：用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释纯化的CSFV重组蛋白E0-1，用方阵法确定最佳包被浓度为1.5μg/ml，取可拆96孔酶标板，每孔加入100μl，4℃包被24小时后用含0.05％吐温-20(体积比)的PBS(pH7.4)洗涤液(PBST)洗涤2次，用5％脱脂奶粉(质量体积比)37℃封闭1小时，用PBST充分洗涤，室温风干，制备抗体检测板。

2)阴、阳性对照血清：阴性血清为未免疫猪瘟疫苗的猪血清，阳性血清为免疫猪瘟弱毒疫苗后采集的猪血清。

3)稀释液：即1％BSA，是取1g牛血清白蛋白BSA，加PBST溶解，并定容至100mL得到。4)酶标记物(100×)：将以上酶标E0-2抗原和酶标E0-3抗原等体积混合后，测定其ELISA效价，并用上述配置的稀释液稀释至100倍使用浓度保存，临用前再用上述配置的稀释液稀释100倍使用。

5)洗涤液：取NaCl 80g、KCl 2g、KH₂PO₄ 2g、Na₂HPO₄·12H₂O 29g及吐温-20 5mL，加蒸馏水定容至1L，调pH值到7.4制成10倍(10×)浓度的洗涤液，用时加蒸馏水稀释10倍到直接使用浓度。

6)底物显色液：称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用100ml无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000mL，配置显色液A；称取9.33g柠檬酸、14.6g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)及6.4ml 0.75％过氧化氢尿素，调pH值到5.0-5.4，加双蒸水定容至1000ml，配制显色液B。显色液A、B等体积混合，即为底物显色液。

7)终止液：为2M H₂SO₄(缓慢滴加浓硫酸111mL到889mL的超纯水中，并不断搅拌混匀而成)。

本发明试剂盒的组成：

a.抗体检测板条：每个试剂盒包含2块ELISA板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA板条，规格为8孔×12条。

b.洗涤液：10倍浓缩的含0.5％吐温-20的1M PBS(pH7.4)75mL。

c.稀释液：60mL。

d.酶标标记物：0.3mL。

e.底物显色液：15mL。

f.终止液：15mL。

g.猪瘟抗体阴、阳性对照血清：各0.2mL。

实施例4 CSFV E0抗体检测试剂盒的使用

a.将浓缩的酶标抗原用酶标稀释液稀释100倍至使用浓度，加入到ELISA板的反应孔内，每孔加入90μl，然后每孔加入血清10μl，震荡混匀，封板，置37℃孵育1小时。

b.每孔加入250-300μl洗涤液洗板5次，吸干孔内残留液体后每孔加入100μl底物TMB，37℃避光显色15分钟。

c.加入终止液，每孔50μl，终止显色。

d.用酶标仪在450nm波长下读数，并计算样品的S/P值，S/P值＝(样品OD₄₅₀值－阴性对照平均OD₄₅₀值)/(阳性对照平均OD₄₅₀值－阴性对照平均OD₄₅₀值)。根据判定标准确定待检样品的阴、阳性结果。

CSFV E0抗体检测试剂盒判定标准的确定：用CSFV E0抗体检测试剂盒检测40份阴性血清，计算其平均S/P值(X)和标准差(SD)，根据统计学原理，确定阴、阳性结果的临界值＝X+3SD，将系统进行调试，使得临界值≈0.3，即当S/P≥0.3，样品为抗CSFV E0抗体阳性，当S/P＜0.3，样品为抗CSFV E0抗体阴性。

实施例5 应用本试剂盒对血清样品进行E0抗体检测

用该试剂盒对224份血清样品进行E0抗体检测，其中30份病毒感染猪血清，检测结果全部阳性；104份为长期免疫猪瘟弱毒疫苗的母猪血清，结果87份阳性；10份SPF阴性猪血清，检测结果全部阴性；80份免疫猪瘟E2亚单位疫苗的肥猪血清(整个猪场免疫E2疫苗一年以上，且无猪瘟感染)，结果2份阳性。检测结果说明该试剂盒对于野毒感染产生的抗体和弱毒疫苗免疫产生的抗体都有较好的检测敏感性，尤其是对野毒感染抗体检测敏感性更高；而对猪瘟阴性猪的检测结果说明该试剂盒具有较高的检测特异性。根据检测结果计算得总的敏感性和特异性分别为87.31％和97.78％。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种检测猪瘟E0蛋白抗体的ELISA 试剂盒

<130> PHW19041

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 621

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 1

gaaaacatta ctcagtggaa cttgtcggat aacggaactt cgggtattca acaggtcatg 60

tacttgcgtg gtgtcaaccg ctcattgcac ggtatctggc cagagaagat ttgcaaaggc 120

gtgccgactc atttggcaac agacacggag ctgatcgaaa ttcgcggaat gatggatgcg 180

tctgagcgta caaactacac gtgctgtagg ctccagagac acgaatggaa caagcatggt 240

tggtgtaact ggtacaacat cgacccttgg attcagctga tgaacaggac ccaagctaac 300

ctcactgagg gccctcccga caaggaatgc gccgtcacat gtcgttacga caaaaacaca 360

gatgttaacg tggtcacgca ggctcgcaac cgtcctacca ctttgaccgg ttgcaagaaa 420

ggcaagaact tctccttcgc cggaactgtc atcgagggtc cctgcaactt caacgtttcc 480

gtggaggaca ttctgtacgg cgatcacgaa tgtggaagcc tcttccaaga caccgcattg 540

tacctgctcg atggtatgac caacactatc gaaaaggcaa ggcagggagc ggcgagagcg 600

catcatcatc atcatcacta a 621

<210> 2

<211> 648

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 2

gacgttgaag cttggttagg tgctcgtgaa aacattactc agtggaactt gtcggataac 60

ggaacttcgg gtattcaaca ggtcatgtac ttgcgtggtg tcaaccgctc attgcacggt 120

atctggccag agaagatttg caaaggcgtg ccgactcatt tggcaacaga cacggagctg 180

atcgaaattc gcggaatgat ggatgcgtct gagcgtacaa actacacgtg ctgtaggctc 240

cagagacacg aatggaacaa gcatggttgg tgtaactggt acaacatcga cccttggatt 300

cagctgatga acaggaccca agctaacctc actgagggcc ctcccgacaa ggaatgcgcc 360

gtcacatgtc gttacgacaa aaacacagat gttaacgtgg tcacgcaggc tcgcaaccgt 420

cctaccactt tgaccggttg caagaaaggc aagaacttct ccttcgccgg aactgtcatc 480

gagggtccct gcaacttcaa cgtttccgtg gaggacattc tgtacggcga tcacgaatgt 540

ggaagcctct tccaagacac cgcattgtac ctgctcgatg gtatgaccaa cactatcgaa 600

aaggcaaggc agggagcggc gagagcgcat catcatcatc atcactaa 648

<210> 3

<211> 627

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 3

gaaaacatta ctcagtggaa cttgtcggat aacggaactt cgggtattca acaggtcatg 60

tacttgcgtg gtgtcaaccg ctcattgcac ggtatctggc cagagaagat ttgcaaaggc 120

gtgccgactc atttggcaac agacacggag ctgatcgaaa ttcgcggaat gatggatgcg 180

tctgagcgta caaactacac gtgctgtagg ctccagagac acgaatggaa caagcatggt 240

tggtgtaact ggtacaacat cgacccttgg attcagctga tgaacaggac ccaagctaac 300

ctcactgagg gccctcccga caaggaatgc gccgtcacat gtcgttacga caaaaacaca 360

gatgttaacg tggtcacgca ggctcgcaac cgtcctacca ctttgaccgg ttgcaagaaa 420

ggcaagaact tctccttcgc cggaactgtc atcgagggtc cctgcaactt caacgtttcc 480

gtggaggaca ttctgtacgg cgatcacgaa tgtggaagcc tcttccaaga caccgcattg 540

tacctgctcg atggtatgac caacactatc gaaaaggcaa ggcagggagc ggcgagagcg 600

catcatcatc atcatcacaa gaagtaa 627

Claims (6)

1.一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括包被CSFV重组蛋白E0-1的抗体检测板、以及由酶标记的重组蛋白E0-2和酶标记的重组蛋白E0-3混合的酶标标记物；

其中，该CSFV重组蛋白E0-1是根据GenBank中CSFV的基因序列合成CSFV E0基因，并将其克隆至pFastBac1载体，构建pFastBac-E0-1重组质粒，pFastBac-E0-1重组质粒表达的重组蛋白E0-1的基因序列如SEQ ID No:1所示；将pFastBac-E0-1重组质粒转化至感受态大肠杆菌内，生成重组杆粒；转染重组杆粒DNA至Sf9昆虫细胞系中，生成重组杆状病毒；再将重组杆状病毒继续接种Sf9细胞培养2代，将获得的重组病毒再接种到High Five细胞，表达并纯化得到；

该重组蛋白E0-2和重组蛋白E0-3是根据GenBank中CSFV的基因序列合成CSFV E0基因，将能够与亲和素发生特异性结合的多肽基因及两个连续的赖氨酸基因分别插入CSFV E0基因5’端和3’端并克隆至pFastBac1载体，构建pFastBac-E0-2重组质粒和pFastBac-E0-3重组质粒，分别表达对应基因序列如SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的重组E0-2蛋白和重组E0-3蛋白；将pFastBac-E0-2重组质粒和pFastBac-E0-3重组质粒分别转化至感受态大肠杆菌内，生成重组杆粒；转染重组杆粒DNA至Sf9昆虫细胞系中，生成重组杆状病毒；将两个重组杆状病毒分别继续接种Sf9细胞培养2代，将获得的重组病毒再接种到High Five细胞，表达并纯化得到重组蛋白E0-2和重组蛋白E0-3。

2.如权利要求1所述的一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液以及猪瘟抗体阴、阳性对照血清。

3.如权利要求1或2所述的一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述CSFV重组蛋白E0-1的包被浓度为1.5μg/mL。

4.如权利要求1或2所述的一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标标记物中酶标记的重组蛋白E0-2和酶标记的重组蛋白E0-3是等体积混合，重组蛋白E0-2和重组蛋白E0-3的摩尔浓度均为1.4×10^-7mol/L。

5.如权利要求1或2所述的一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标记的重组蛋白E0-2是由其含有的多肽基因与辣根过氧化物酶标记的亲和素因亲和作用相结合而得到。

6.如权利要求1或2所述的一种检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标记的重组蛋白E0-3是将重组蛋白E0-3按化学偶联法偶联辣根过氧化物酶得到。