CN103267841A

CN103267841A - 一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备elisa酶标抗原的方法

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Publication number: CN103267841A
Application number: CN2013101788667A
Authority: CN
Inventors: 余兴龙; 葛猛; 李润成
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2033-05-15
Also published as: CN103267841B

Abstract

一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备ELISA酶标抗原的方法，该酶标抗原是将酶标链霉亲和素(亲和素的一种)与链霉亲和素结合肽(SBP)重组融合抗原混合形成，该方法利用链霉亲和素与生物素能够特异性结合的原理，利用基因工程的方法将模拟生物素结构的链霉亲和素结合肽（SBP）与抗原蛋白分子构建成一个融合蛋白；融合蛋白中的SBP与酶标链霉亲和素通过彼此间的亲和力而结合，形成同时具有抗原活性又有酶活性的新型酶标抗原。这种方法不需要特殊的化学基团来作为偶联的靶位，具有更为广泛的适用性；并且，不直接对抗原分子进行标记，减少了对抗原结构的影响、降低了标记物对抗原抗体反应产生的空间阻碍，从而提高检测的敏感性。

Description

一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备ELISA酶标抗原的方法

技术领域

本发明属于免疫学和生物技术领域，具体涉及一种利用亲和素结合肽与亲和素相结合的原理构建和制备ELISA酶标抗原的方法，用该方法制备的酶标抗原可以用于检测抗体的酶联免疫吸附试验方法建立。

背景技术

酶标抗原在酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay , ELISA）中用于抗体的检测。传统的酶标抗原制备方法是基于化学偶联的方法，即通过抗原分子与交联剂之间的化学反应形成共价键而连接。不同的交联剂针对抗原分子上的不同的化学基团（主要是伯胺、巯基、羧基等）进行反应。所以，标记效率以及标记之后的酶标抗原的反应活性与这些特殊基团的数量及其分布有关。如果抗原分子中可用于标记的化学基团的数量少或者处于分子的内部结构中，则标记效率会很低；如果这些基团正好处于抗原表位上或位于表位附近，则标记可能会改变表位的空间结构以及产生空间位阻，从而影响与抗体的结合从而影响检测效果。各种抗原的结构多种多样，其主要的功能区域很多都还不确定，所以也不确定标记的过程是否会对其结构和功能造成影响从而降低甚至失去其与抗体结合的能力。这也是为什么酶标抗原在ELISA检测上应用较少的主要原因之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备ELISA酶标抗原的方法，该方法利用链霉亲和素（Streptavidin，SA；亲和素的一种）与生物素（Biotin）能够特异性结合的原理，利用基因工程的方法将模拟生物素结构的链霉亲和素结合肽（Streptavidin binding peptide，SBP）与抗原蛋白分子构建成一个融合蛋白；融合蛋白中的SBP与酶标链霉亲和素（Enzyme-Streptavidin，Enzyme-S）通过彼此间的亲和力而结合，形成同时具有抗原活性又有酶活性的新型酶标抗原。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备ELISA酶标抗原的方法，其特点是：该酶标抗原是根据酶标链霉亲和素的体积摩尔浓度以及SBP重组融合抗原的体积摩尔浓度，将酶标链霉亲和素与SBP重组融合抗原以1:4的摩尔比混合，于4℃偶联反应48小时制得。

本方法的关键是SBP重组抗原与酶标链霉亲和素（酶分子4标记的链霉亲和素3）之间能够发生高效结合，并形成一个既有酶分子的活性又有抗原抗体反应性的酶标抗原复合物，见图1。这其中SBP重组融合抗原通过蛋白表达来获得；而酶标链霉亲和素则直接购买。SBP重组融合抗原与酶标链霉亲和素通过简单的混合则可以形成酶标链霉亲和素结合抗原（即酶标抗原）。

下面对本发明的技术方案做进一步的描述：

（1） SBP重组融合抗原的制备

链霉亲和素结合肽（Streptavidin binding peptide, SBP）是一类能够与链霉亲和素发生特异性结合的多肽，包括：YNCHPMNNLCKE（见SEQ ID NO.1所示）、ERCWYVMHWPCNA（见SEQ ID NO.2所示）、PKCGWMYYPECKV（见SEQ ID NO.3所示）、 DVEAWLGARVPLVET（见SEQ ID NO.4所示）、DVEAWLGAR（见SEQ ID NO.5所示）、SAWRHPQFGG（见SEQ ID NO.6所示）、SNWSHPQFEK（见SEQ ID NO.7所示）、AECHPQGPPCIEGRK（见SEQ ID NO.8所示）、DEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP（见SEQ ID NO.9所示）等。将这些链霉亲和素结合肽的基因与抗原蛋白的基因以合适的方式进行嵌合并在蛋白表达系统中进行表达。所获得的表达产物中即含SBP重组融合抗原，通过亲和层析法对目的蛋白进行纯化获得SBP重组融合抗原。

（2）酶标链霉亲和素的准备

酶标链霉亲和素主要包括辣根过氧化酶标记的链霉素亲和素以及碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，可以直接购买商品化的产品。

（3）酶标链霉亲和素结合抗原的制备

根据酶标链霉亲和素的体积摩尔浓度以及SBP重组融合抗原的体积摩尔浓度，将两者以1:4的摩尔比例混合，并在4℃反应48小时，即获得能够用于抗体检测的酶标链霉亲和素结合抗原。

与传统化学偶联方法制备的酶标抗原相比，本发明的有益效果如下：

（1）标记过程简单：本方法在将抗原分子与SBP融合表达且纯化之后，只需要将其与酶标链霉亲和素简单混合并反应48小时则可完成偶联。偶联之后可以直接使用，不需要另外纯化。而传统的化学偶联法除了抗原和酶分子外，至少还需要使用到交联剂和阻断剂，并且偶联之后需要纯化。

（2）适用性广：本方法通过人为的在抗原分子加上SBP，再通过其与酶标亲和素之间的特性结合而实现抗原与酶分子的间接偶联，不同于传统化学偶联法必须通过抗原分子上特殊的化学基团偶联，所以，即使抗原分子不含这些特殊的化学基团，同样可以用该方法进行偶联，具有更为广泛的适用性。

（3）检测敏感性高：由于该方法不直接对抗原分子进行标记，减少了对抗原结构的影响、降低了标记物对抗原抗体反应产生的空间阻碍，从而更好的保留了抗原与抗体的反应活性，提高检测的敏感性。

附图说明

图1是本发明酶标抗原的构成以及与抗体的结合模式图。

其中：1表示抗原；2表示链霉亲和素结合肽；3表示链霉亲和素；4表示酶分子；5表示抗体分子（Fab片段），1-4构成酶标抗原。

图2是基于3种酶标抗原建立的双抗原夹心ELISA对比检测9头阴性猪接种PCV2后的抗体。

其中：A、B、C对应的酶标抗原分别是HRP-SAC、HRP-SBC以及传统化学偶联法制备的酶标抗原。

具体实施方式

实施例1

本实施例为利用本发明方法制备检测猪2型圆环病毒抗体的酶标抗原，建立双抗原夹心ELISA方法，并与用传统化学偶联法制备的酶标抗原建立的双抗原夹心ELISA对比，通过检测效果来说明本方法的可靠性以及优势。

1）用本发明方法制备检测圆环病毒2抗体的酶标抗原

a. 选择亲和素结合肽以及与抗原分子Cap⊿41蛋白进行融合

选择序列为DEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP和YNCHPMNNLCKE的2种SBP分别与猪2型圆环病毒的抗原分子——Cap⊿41蛋白（不含信号肽）进行融合表达获得两种SBP-Cap⊿41融合抗原，分别为ACap⊿41和BCap⊿41。具体过程如下：根据两种SBP以及Cap⊿41蛋白的基因序列设计引物，引物序列及其扩增的目的基因见表1。通过PCR扩增获得融合蛋白对应的目的基因，并克隆到pET28-a(+)原核表达载体中，构建重组表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLySs中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组融合蛋白。用蛋白纯化试剂盒（Novagen公司产品）纯化可溶性表达的融合蛋白ACap⊿41和BCap⊿41。

表1 PCR扩增基因及其所需引物

注：BCap⊿41基因通过重叠PCR扩增获得，先Fb与Rb配对以pBEn-SBPa载体为模板扩增，Fc与Rc配对以含Cap基因的pET28a-Cap质粒为模板扩增，最后将两种PCR产物混合为模板，以Fb与Rc配对进行扩增。ACap⊿41和BCap⊿41均克隆于Nco I和Sal I位点之间。

b. 组装酶标抗原

将辣根过氧化酶（HRP）标记的链霉亲和素（Pierce公司产品）稀释到7.0×10^-8mol/L，分别与纯化的ACap⊿41和BCap⊿41（浓度均为2.8×10^-7mol/L）等体积混合，4℃反应48h，即获得检测猪2型圆环病毒抗体的酶标抗原HRP-SAC和HRP-SBC。

2）用新酶标抗原建立检测PCV2抗体的双抗原夹心ELISA方法

用HRP-SAC和HRP-SBC分别建立检测猪2型圆环病毒抗体的双抗原夹心ELISA方法，并且与基于传统酶标抗原建立的检测猪2型圆环病毒抗体的双抗原夹心ELISA方法进行对比。结果表明：用本发明方法制备的酶标抗原建立的检测猪2型圆环病毒抗体的双抗原夹心ELISA的检测敏感性高于用传统化学偶联方法制备的酶标抗原建立的双抗原夹心ELISA。具体表现为对阳性血清的检测S/P值更高，能够检测到抗体的时间更早（见图2）。

3）结论

检测猪2型圆环病毒抗体的酶标抗原用传统化学偶联法和本发明方法都能制备，但是用本发明制备的酶标抗原的检测敏感性明显高于用传统化学偶联法制备的酶标抗原，且本方法更加简便、省时。

实施例2

本实施例为利用本发明方法制备检测伪狂犬病毒gB蛋白抗体的酶标抗原（该酶标抗原用传统化学偶联法制备的效果差，不能用于ELISA方法建立），建立检测该抗体的双抗原夹心ELISA方法，并与检测该抗体的商品化试剂盒对比来确定用本方法制备的酶标抗原的效果。

1）用本发明方法制备检测伪狂犬病毒gB蛋白抗体的酶标抗原

a. 选择亲和素结合肽以及与抗原分子进行融合

选择序列为SNWSHPQFEK的SBP与伪狂犬病毒的抗原分子——gB4蛋白（gB的第820-917位氨基酸）进行融合表达获得SBP-gB4融合抗原。过程如下：根据所选SBP以及gB4蛋白的基因序列设计引物。其中，上游引物序列为：TATGGATCCAGCAACTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAGATGGCCTACCGGCACATCTCGCG（见SEQ ID NO.15所示）；下游引物序列为：GTAAGCTTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTC（见SEQ ID NO.16所示）。通过PCR扩增获得融合蛋白对应的目的基因，并克隆到pET28-a(+)原核表达载体中，构建重组表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLyS中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组融合蛋白。用亲和层析法（Novagen公司His-Bind Kit 产品编号：70239-3）纯化可溶性表达的融合蛋白SBP-gB4。

b. 组装酶标抗原

将辣根过氧化酶（HRP）标记的链霉亲和素（Pierce公司产品）稀释到7.0×10^-8mol/L，与纯化的SBP-gB4（浓度均为2.8×10^-7mol/L）等体积混合，4℃反应48h，即获得检测伪狂犬病毒gB抗体的酶标抗原。

2）建立检测伪狂犬病毒gB蛋白抗体的双抗原夹心ELISA方法

利用酶标抗原建立检测伪狂犬病毒gB蛋白抗体的双抗原夹心ELISA方法，并且与检测该抗体的商品化ELISA试剂盒（IDEXX公司）进行对比。结果表明：用本发明方法制备的酶标抗原建立的检测PRV-gB抗体的双抗原夹心ELISA与商品化试剂盒一致性较好（Kappa系数为0.86），敏感性和特异性分别为94.6%和91.3%，见下表2。

表2 双抗原夹心ELISA与IDEXX-ELISA检测PRV-gB抗体结果对比

注：Kappa系数＞0.75表示两种方法很好的检测一致性。

3）结论

用本发明方法制备的酶标抗原，可用于建立检测伪狂犬病毒gB蛋白抗体的ELISA方法，且检测效果与进口商品化试剂盒具有较好的一致性。

实施例3

本实施例为利用本发明方法制备检测伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶标抗原（该酶标抗原用传统化学偶联法制备的效果差，不能用于ELISA方法建立），建立检测该抗体的双抗原夹心ELISA方法，并与检测该抗体的商品化试剂盒对比来确定用本方法制备的酶标抗原建立的效果。

1）用本发明方法制备检测伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶标抗原

a. 选择亲和素结合肽以及与抗原分子gE蛋白进行融合

选择序列为DVEAWLGAR的SBP与伪狂犬病毒的抗原分子——gEa蛋白（gE蛋白的第22-336位氨基酸）进行融合表达获得SBP-gEa融合抗原。过程如下：根据所选SBP以及gEa蛋白的基因序列设计引物。其中，上游引物序列为：CGGATCCGACGTTGAAGCTTGGTTAGGTGCTCGTCCGAGCCTCTCCGCCGAGAC（见SEQ ID NO.17所示）；下游引物序列为：GCGTCGACGGGTCAGGCGGTCAG（见SEQ ID NO.18所示）。通过PCR扩增获得融合蛋白对应的目的基因，并克隆到原核表达载体pET41-a(+)中，构建重组表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLyS中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组融合蛋白。用亲和层析法（Novagen公司His-Bind Kit产品编号：70239-3）纯化可溶性表达的融合蛋白SBP-gEa。

b. 组装酶标抗原

将辣根过氧化酶（HRP）标记的链霉亲和素（Pierce公司产品）稀释到7.0×10^-8mol/L，与纯化的SBP-gEa（浓度均为2.8×10^-7mol/L）等体积混合，4℃反应48h，即获得检测伪狂犬病毒gEa抗体的酶标抗原。

2）建立检测伪狂犬病毒gE抗体的双抗原夹心ELISA方法

利用酶标抗原建立检测伪狂犬病毒gE抗体的双抗原夹心ELISA方法，并且与检测该抗体的商品化ELISA试剂盒（IDEXX公司）进行对比。结果表明用本发明方法制备的酶标抗原建立的检测PRV-gE抗体的双抗原夹心ELISA与商品化试剂盒的检测一致性较好（Kappa系数为0.85），敏感性和特异性分别为94.9%和90.6%，见下表3。

表3 双抗原夹心ELISA与IDEXX-ELISA检测PRV-gE抗体结果对比

注：Kappa系数＞0.75表示两种方法很好的检测一致性。

3）结论

用本发明方法制备的酶标抗原，可用于建立检测伪狂犬病毒gE蛋白抗体的ELISA方法，且检测效果与进口商品化试剂盒具有较好的一致性。

实施例4

本实施例为利用本发明方法制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的酶标抗原，建立检测该抗体的双抗原夹心ELISA方法，并与检测该抗体的商品化试剂盒对比来确定用本方法制备的酶标抗原的效果。

1）用本发明方法制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的酶标抗原

a. 选择亲和素结合肽以及与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原分子进行融合

选择序列为ERCWYVMHWPCNA的SBP与猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原分子——N蛋白进行融合表达获得SBP-N融合抗原。过程如下：根据所选SBP以及N蛋白的基因序列设计引物。其中，上游引物序列为：CGAATTCGAACGTTGCTGGTACGTGATGCATTGGCCGTGCAATGCAATGCCAAATAACAACGGCAAGC（见SEQ ID NO.19所示）；下游引物序列为：GCGTCGACTCATGCTGAGGGTGATGCTG（见SEQ ID NO.20所示）。通过PCR扩增获得融合蛋白对应的目的基因，并克隆到原核表达载体pET28-a(+)中，构建重组表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLyS中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组融合蛋白。用亲和层析法（Novagen公司His-Bind Kit 产品编号：70239-3）纯化可溶性表达的融合蛋白SBP-N。

b. 组装酶标抗原

将辣根过氧化酶（HRP）标记的链霉亲和素（Pierce公司产品）稀释到7.0×10^-8mol/L，与纯化的SBP-N（浓度均为2.8×10^-7mol/L）等体积混合，4℃反应48h，即获得检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的酶标抗原。

2）建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的双抗原夹心ELISA方法

利用酶标抗原建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的双抗原夹心ELISA方法，并且与检测该病毒抗体的商品化ELISA试剂盒（IDEXX公司）进行对比。结果表明用本发明方法制备的酶标抗原建立的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的双抗原夹心ELISA与商品化试剂盒的检测一致性较好（Kappa系数为0.83），敏感性和特异性分别为96.6%和84.5%，见下表4。

表4双抗原夹心ELISA与IDEXX-ELISA检测繁殖与呼吸综合征病毒抗体结果对比

注：Kappa系数＞0.75表示两种方法很好的检测一致性。

3）结论

用本发明方法制备的酶标抗原，可用于建立检测繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白抗体的ELISA方法，且检测效果与进口商品化试剂盒具有较好的一致性。

实施例5

本实施例为利用本发明方法制备检测猪瘟病毒抗体的酶标抗原，建立双抗原夹心ELISA方法，并与检测该抗体的商品化试剂盒对比来确定用本方法制备的酶标抗原的效果。

1）用本发明方法制备检测猪瘟病毒抗体的酶标抗原

a. 选择亲和素结合肽以及与抗原分子NS3蛋白进行融合

选择序列为PKCGWMYYPECKV的SBP与猪瘟病毒的抗原分子——NS3蛋白进行融合表达获得SBP-NS3融合抗原。过程如下：根据所选SBP以及NS3蛋白的基因序列设计引物。其中，上游引物序列为：C GAGCTCCCGAAATGCGGTTGGATGTATTACCCGGAATGCAAAGTTGGGCCTGCCGTTTGCAAGA（见SEQID NO.21所示）；下游引物序列为：GCCTCGAGTTATAGACCAACTACCTGT（见SEQ ID NO.22所示）。通过PCR扩增获得融合蛋白对应的目的基因，并克隆到原核表达载体pET32-a(+)中，构建重组表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLyS中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组融合蛋白。用亲和层析法（Novagen公司His-Bind Kit 产品编号：70239-3）纯化可溶性表达的融合蛋白。

b. 组装酶标抗原

将辣根过氧化酶（HRP）标记的链霉亲和素（Pierce公司产品）稀释到7.0×10^-8mol/L，与纯化的SBP-NS3（浓度均为2.8×10^-7mol/L）等体积混合，4℃反应48h，即获得检测猪瘟病毒抗体的酶标抗原。

2）建立检测猪瘟病毒抗体的双抗原夹心ELISA方法

利用酶标抗原建立检测猪瘟抗体的双抗原夹心ELISA方法，并且与检测该抗体的商品化ELISA试剂盒（IDEXX公司）进行对比。结果表明：用本发明方法制备的酶标抗原建立的检测猪瘟病毒抗体的双抗原夹心ELISA与商品化试剂盒的检测一致性较好（Kappa系数为0.81），敏感性和特异性分别为93.7%和86.9%，见下表5。

表5 双抗原夹心ELISA与IDEXX-ELISA检测猪瘟抗体结果对比

注：Kappa系数＞0.75表示两种方法很好的检测一致性。

3）结论

用本发明方法制备的酶标抗原，可用于建立检测猪瘟病毒NS3蛋白抗体的ELISA方法，且检测效果与进口商品化试剂盒具有较好的一致性。

Claims

1.一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备ELISA酶标抗原的方法，其特征在于：该酶标抗原是根据酶标链霉亲和素的体积摩尔浓度以及SBP重组融合抗原的体积摩尔浓度，将酶标链霉亲和素与SBP重组融合抗原以1:4的摩尔比混合，于4℃偶联反应48小时制得。

2.如权利要求1所述的一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备ELISA酶标抗原的方法，其特征在于：所述SBP重组融合抗原是将链霉亲和素结合肽与抗原蛋白分子进行融合表达，再通过亲和层析法对目的蛋白进行纯化制得。

3.如权利要求2所述的一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备ELISA酶标抗原的方法，其特征在于：所述SBP重组融合抗原是根据链霉亲和素结合肽及抗原蛋白分子的基因序列设计引物，通过PCR扩增获得目的基因，并克隆到原核表达载体中，构建重组表达质粒，并在蛋白表达系统中表达重组融合蛋白，再通过亲和层析法对目的蛋白进行纯化制得。

4.如权利要求2或3所述的一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备ELISA酶标抗原的方法，其特征在于：所述链霉亲和素结合肽包括SEQ ID NO.1所示序列、SEQ ID NO.2所示序列、SEQ ID NO.3所示序列、SEQ ID NO.4所示序列、SEQ ID NO.5所示序列、SEQ ID NO.6所示序列、SEQ ID NO.7所示序列、SEQ ID NO.8所示序列及SEQ ID NO.9所示序列。

5.如权利要求1所述的一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备ELISA酶标抗原的方法，其特征在于：所述酶标链霉亲和素包括辣根过氧化酶标记的链霉素亲和素以及碱性磷酸酶标记的链霉亲和素。