CN103694358B - 位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽及其在三维定向固定IgG抗体中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种位点特异性生物素标记的IgG亲和肽，是在IgG亲和肽的羧基端以生物方式连接生物素构建而成，该位点特异性生物素标记的IgG亲和肽一经产生，无需体外标记即可定向亲和吸附于亲和素或链霉亲和素预包被的固相载体表面。本发明的位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽，可用于将IgG抗体固定在固相载体表面，结合后，IgG抗体的Fab端可充分暴露，从而充分保持了抗体的抗原结合活性，进而可有效提高固相免疫分析的灵敏性、特异性与稳定性。本发明采用Avi-tag与IgG抗体亲和肽构建融合蛋白，解决了IgG抗体亲和肽的定向亲和固定，进而获得均一、Fab段充分暴露及保持高抗原结合活性的三维定向固相化IgG抗体。

Description

位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽及其在三维定向固定IgG抗体中的应用

技术领域

本发明涉及一种位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽，及其在三维定向固定IgG抗体中的应用，属于基因工程及免疫分析领域。

背景技术

固相免疫测定技术是临床免疫学检验的重要组成部分，如酶联免疫吸附试验及免疫传感器、免疫诊断芯片等新技术，其应用基础是将抗原或抗体包被在固相载体上进行免疫测定，一般包被抗体更为常用。如酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）即是经典的固相免疫测定技术，具有灵敏、简单、快速及易于自动化操作等特点，在生物医学、临床诊断等领域广泛应用，国内外普遍采用聚苯乙烯（Polystyrene,PS）微孔板/管/珠等为固相载体材料且96孔PS微孔板更为常用。目前抗体在PS固相载体表面固相化方法主要有物理吸附法、化学共价交联法及捕获间接包被法等方法。

物理吸附法是应用较早的抗体固相化技术，目前仍有相当普遍的应用。该法原理是通过蛋白质分子结构的疏水基团与固相载体表面疏水基团通过物理吸附结合，这种吸附是非特异性的，存在蛋白吸附能力差及抗体活性低等问题。研究表明通过物理吸附作用直接固定在载体表面的多克隆抗体75%失去抗原结合活性，而单克隆抗体则90%没有抗原结合活性（ButlerJE,etal.MolImmunol.1993,30:1165）。

化学共价交联法主要是通过在载体表面的改性或修饰，引入双功能偶联剂、-NH2等活性基团，使生物分子吸附到PS表面过程由被动的物理吸附变成了共价偶联。共价键依靠不同分子间活性基团的化学反应产生的强相互作用力，如丹麦NUNC公司的氨基化PS微孔板及美国康宁公司的琥珀酰亚胺脂活化酶标板，有效提高了固相抗体（抗原）的结合量。目前认为化学共价法是提高固相材料抗体结合数量相对有效的方法，理论上只要带有合适活性基团的生物活性分子都能通过共价键牢固地结合在固相表面，研究者在载体表面引入不同的活性基团，与蛋白质分子内天然氨基酸残基，或经“ClickChemistry”修饰的某些氨基酸残基共价结合完成抗体的固定。尽管该模式是可控的固定方式，但存在的问题是：参与共价化学键的活性基团在蛋白质分子内的位置有不确定性和不唯一性，不能有效保证抗体定向固定及高免疫学活性。Peter对NUNC公司的高吸附酶标板（MaxiSorp-650）研究发现，尽管抗体包被量达到650ng/cm²，但仅仅只有5～10%的包被抗体具有抗原捕捉能力。

利用抗原-抗体反应捕获待包被抗体，在一定程度上可实现被捕获抗体的定向固定。即将抗-抗体的包被抗体先进行固定；也可采用IgG亲和蛋白如SpA，该蛋白为金黄色葡萄球菌细胞壁的单链多肽，分子量为42kD，能通过疏水作用结合人、兔等多种动物IgG的Fc段，且这种结合不影响IgG的Fab段与抗原特异性结合的免疫活性。在IgG抗体固定化时，SpA可作为受体蛋白先吸附在PS板后，再结合IgG抗体Fc段实现捕获法固定IgG。采用间接包被方式能暴露抗体的抗原结合部位，有利于捕捉体系中的抗原，在一定程度上提高了免疫检测的特异性与灵敏度，但第一抗体或受体蛋白仍采用物理吸附法或化学共价偶联，仍不能有效实现第一抗体或受体蛋白的定向包被固定。

间接包被技术中也可利用生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem，BAS）固定生物素化抗体，该技术以化学共价偶联标记抗体分子内-NH₂、-CHO或-SH等活性位点通过化学法与活化生物素共价偶联得到生物素化抗体，与已包被在聚苯乙烯等固相载体表面的亲和素或链霉亲和素，以生物素-亲和素具有的独特结合特性介导生物素化抗体的固相化。一个抗体分子内存在多个偶联位点，故一个抗体分子可偶联上3～5个生物素分子；尽管亲和素或链霉亲和素的包被方式不是定向固定，然而一个亲和素或链霉亲和素具有4个生物素结合位点，因而其生物素结合位点不易全被掩盖，所以该技术可有效提高抗体的包被量。然而，生物素与抗体分子内的活性基团是一种随机结合方式，当反应基团的氨基酸残基位于抗体Fab或附近时，导致固相化的生物素化抗体的Fc端向外而掩盖Fab段，这样的固相抗体就失去了抗原结合能力（如图1所示）。

抗体在载体表面固定后的空间构型、数量及免疫学活性是影响固相免疫测定技术稳定性、灵敏度和选择性的关键因素，建立一种抗体固定化技术，将抗体的Fc段固定在载体表面，使得Fab端从载体的表面充分向空间展示且抗原结合活性得以完好保持，对于提高固相免疫分析的灵敏性、特异性与稳定性具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种实现IgG抗体的特异性三维定向固定的“生物桥梁”——位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽，本发明的位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽，一经产生，无需体外标记即可介导IgG亲和肽定向亲和吸附于亲和素或链霉亲和素预包被的固相载体表面。利用生物亲和方式将本发明的位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽与预包被亲和素或链霉亲和素的聚苯乙烯载体特异性结合，再利用生物亲和方式将本发明的位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽与IgG抗体结合，即可得到三维固相化IgG抗体，该三维固相化IgG抗体的Fab端可充分暴露，从而充分保持抗体的抗原结合活性，进而可有效提高固相免疫分析的灵敏性、特异性与稳定性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种位点特异性生物素标记的IgG亲和肽，是在IgG亲和肽的羧基端连接生物素构建而成，该位点特异性生物素标记的IgG亲和肽一经产生，无需体外标记即可定向亲和吸附于亲和素或链霉亲和素预包被的固相载体表面。

所述位点特异性生物素标记的IgG亲和肽的制备方法如下：

（1）根据(Gly₄-Ser)₃及Avi基因序列，化学合成(Gly₄-Ser)₃-Avi的基因片段，重组至pUC18载体，获得中间质粒载体（这个过程是常规技术手段就可以实现的，所提及的pUC18载体是所属领域的常规载体）；

（2）设计引物以PCR方式获得IgG亲和肽（ZZ亲和肽）基因，重组至上述中间质粒载体，获得原核表达载体；

（3）原核表达载体转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），获得基因工程菌；

（4）培养基因工程菌，培养基中含有终浓度为50μM的生物素，依菌体内BirA酶同步催化，在所表达的目的蛋白的Avi序列的赖氨酸位点结合生物素；

（5）纯化目的蛋白，获得生物素定点定量连接的IgG亲和肽：ZZ-Biotin。

进一步地，制备方法具体如下：

（1）根据Avi-tag氨基酸序列，化学合成其基因序列：

5′-GGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA-3′（如SEQIDNO.1所示）；

并在其5′端置入柔性蛋白Linker：(Gly₄-Ser)₃的基因序列，得(Gly₄-Ser)₃-Avi-tag基因序列，并分别在该重组基因片段上下游置入PstI、HindIII酶切位点，酶切插入pUC18载体，得中间质粒载体；

（2）表达载体及基因工程菌的构建：

①设计引物PCR扩增ZZ亲和肽基因，并插入到上述中间质粒载体的EcoRI、PstI位点，构建得到重组表达载体pUCZZ-(Gly₄-Ser)₃-Avi-tag，该重组表达载体表达得到的重组蛋白是羧基端带柔性蛋白Linker及Avi-tag的ZZ亲和肽；

②上述重组表达载体CaCl₂转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），氨苄LB抗性平板（即培养基中除常规LB培养基的成分外，还含氨苄100μg/mL）筛选阳性克隆，获得基因工程菌；

（3）基因工程菌的培养及体内生物素化：

①挑取单克隆菌落接种于5mL液体LB培养基（培养基中除常规LB培养基的成分外，还含氨苄100μg/mL），37℃过夜培养、活化；

②活化菌液按照2%（v/v）的接种量转接于新鲜的50mL液体LB培养基（培养基中除常规LB培养基的成分外，还含氨苄100μg/mL），37℃培养至OD₆₀₀为0.3时，在培养基中加入终浓度为50μM的生物素，继续培养16h，依大肠杆菌菌体内BirA酶同步催化所表达的目的蛋白在Avi序列赖氨酸位点结合生物素；

（4）融合蛋白的提取：

①经上述培养的基因工程菌4℃，1000rpm离心10min，收集菌体；

②菌体以5mL0.1M的Tris缓冲液重悬，置入-80℃液氮中10min，再迅速置入37℃的恒温水浴中15min，如此反复冻融3次；

③上述反复冻融的菌液4℃，1200rpm离心10min，上清转入一新离心管中；

（5）目的融合蛋白的纯化：

①清洗柱子：用2柱体积的BufferA清洗Strep-Tactin柱；

②样品上柱：取步骤（4）冻融的菌液上清5mL流通上柱结合目的蛋白；

③冲洗柱子：用5柱体积的BufferA洗柱，并收集每部分的洗脱液；

④目的蛋白的洗脱：以BufferB洗脱目的蛋白，收集每一部分并各取20μlSDS-PAGE鉴定；

⑤目的蛋白的脱盐与浓缩：使用Millipore超滤器，4℃，4000rpm，离心30min浓缩，将浓缩液以0.01MTBS稀释至合适体积，既得定点定量、生物学标记的生物素化IgG抗体亲和肽：ZZ-Biotin。

所述BufferA的配方组成为：100mMTris·Cl，150mMNaCl，1mMEDTA，余量为水，pH8.0（为现有技术中的常规试剂）。

所述BufferB的配方组成为：100mMTris·Cl，150mMNaCl，1mMEDTA，2.5mMdesthiobiotin，pH8.0（为现有技术中的常规试剂）。

所述LB培养基的配方为：1L培养基中含5g酵母粉,10g蛋白胨,5gNaCl,100mg氨苄青霉素，余量为水，pH7.2～7.4。

本发明的位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽，可用于将IgG抗体固定在固相载体表面，利用本发明的位点特异性生物素标记的IgG亲和肽将IgG抗体固定在固相载体表面的方法为：（A）首先，将位点特异性生物素标记的IgG亲和肽（ZZ-Biotin）与预包被亲和素或链霉亲和素的聚苯乙烯载体以生物素-亲和素结合特异性定向吸附固定；（B）然后再利用IgG亲和肽与IgG抗体的特异性结合将IgG抗体结合到IgG亲和肽上，结合后，IgG抗体的Fab端可充分暴露，从而充分保持了抗体的抗原结合活性，进而可有效提高固相免疫分析的灵敏性、特异性与稳定性。

一种结合有IgG亲和肽的固相载体，其结构为：在预包被亲和素或链霉亲和素的聚苯乙烯载体表面特异性定向吸附固定有IgG亲和肽，是通过以下方法制备而成：将位点特异性生物素标记的IgG亲和肽（ZZ-Biotin）与预包被亲和素或链霉亲和素的聚苯乙烯载体以生物素-亲和素结合特异性定向吸附固定，即得。

一种三维固相化IgG抗体，其结构为：IgG亲和肽与IgG抗体结合，IgG亲和肽定向吸附固定在预包被亲和素或链霉亲和素的聚苯乙烯载体表面，是通过上述方法制备而成。

上述步骤（A）“将位点特异性生物素标记的IgG亲和肽（ZZ-Biotin）与预包被亲和素或链霉亲和素的聚苯乙烯载体以生物素-亲和素结合特异性定向吸附固定”的具体方式如下：

①按100μL/孔的ZZ-Biotin蛋白溶液（PBST溶液，含1MNaCl；ZZ-Biotin蛋白浓度0.05μg/mL）加到亲和素预包被聚苯乙烯的96孔聚苯乙烯板孔内，37℃温育2h；

②以含0.2MNaCl的PBST溶液洗涤，或：以含0.2MNaCl及0.005%NaN3的PBST溶液洗涤，共洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干96孔板，获得ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，4℃保存。

上述步骤（B）“利用IgG亲和肽与IgG抗体的特异性结合将IgG抗体结合到IgG亲和肽上”的具体方式如下：

①按100μL/孔的IgG抗体（抗体的浓度为0.1μg/mL，溶剂为含1MNaCl的PBS溶液，）加到上述ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，37℃温育2h；

②以含0.2MNaCl的PBST溶液洗涤，共洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干96孔板，获得三维定向固定的IgG抗体。

所述缓冲液PBST为pH7.4的PBS溶液中含有0.05%Tween-20。

所述缓冲液PBS为pH7.4的溶液中，含有NaCl137mM，KCl2.7mM，Na₂HPO₄10mM，KH₂PO₄2mM。

由背景技术可知，SpA可亲和IgG抗体而在免疫测定中应用，但SpA的IgG结合活性来自E、D、A、B、C5个高度同源的IgG结合结构域。研究发现，其IgG结合结构域不仅与IgG的Fc段结合，也与某些IgG的Fab段（如人IgG1的F(ab')₂）结合。本发明以ZZ亲和肽结构域代替SpA的5个同源IgG结合结构域克服了SpA与某些IgG的Fab段结合的缺点。SpA也应用于IgG抗体的间接包被，但SpA与固相载体的吸附是随机化学或物理吸附，不能实现SpA的定向吸附固定。因此本发明采用仅与IgG的Fc段结合结构域—ZZ亲和肽，提高了对IgG的Fc结合特异性，也实现了ZZ亲和肽的定向固定。

由背景技术可知，生物素化抗体可通过生物素-亲和素作用有效包被在亲和素包被的载体表面，但生物素与抗体分子内的活性基团是一种随机结合方式，当反应基团的氨基酸残基位于抗体Fab或附近时，导致固相化的生物素化抗体的Fc端向外而掩盖Fab段，仍不能保证所吸附的抗体是定向固定的抗体。理论上讲，Avi-tag可与单链抗体ScFv构建融合蛋白实现生物素标签介导ScFv抗体的定向固定，但对于目前免疫分析中最为常用的多克隆及单克隆抗体，因受到构建融合蛋白技术限制，不能实现多克隆及单克隆抗体的定向固定。

本发明采用Avi-tag与IgG抗体亲和肽构建融合蛋白，解决了IgG抗体亲和肽的定向亲和固定，更为进步的是，实现了多克隆及单克隆抗体在聚苯乙烯载体上的生物学方式三维定向固定。本发明提供了一种位点特异性生物素标记的IgG亲和肽介导固相化三维IgG抗体，是利用生物素化标签肽（Avi-tag）与IgG抗体亲和肽之间构建重组蛋白，在菌体内实现IgG亲和肽的定点生物素化，继而利用生物素-亲和素特异性亲和作用将IgG抗体亲和肽定向吸附在PS表面，进而结合IgG抗体Fc段达到抗体Fab端向外定向展示，获得均一、Fab段充分暴露及保持高抗原结合活性的三维定向固相化IgG抗体。

附图说明

图1：化学共价偶联的生物素化抗体在亲和素包被的固相载体表面的结合固定示意图。

图2：位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽在亲和素包被的固相载体表面的定向固定示意图。

图3：位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽导向IgG抗体的三维定向固定示意图。

图4：位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽介导IgG定向固定与化学共价偶联生物素化IgG直接吸附固定的ELISA检测结果比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

若无特别说明，所涉及的试剂、试验方法均为常规法试剂、常规方法。

所述BufferB的配方组成为：100mMTris·Cl，150mMNaCl，1mMEDTA，2.5mMdesthiobiotin，pH8.0（为现有技术中的常规试剂）。

所述LB培养基的配方为：1L培养基中含5g酵母粉,10g蛋白胨,5gNaCl,100mg氨苄青霉素，余量为水，pH7.2～7.4。

所述LB培养基的配方为：1L培养基中含5g酵母粉,10g蛋白胨,5gNaCl,100mg氨苄青霉素，余量为水，pH7.2～7.4。

所述缓冲液PBST为pH7.4的PBS溶液中含有0.05%Tween-20。

所述缓冲液PBS为pH7.4的溶液中，含有NaCl137mM，KCl2.7mM，Na₂HPO₄10mM，KH₂PO₄2mM。

实施例1含(Gly₄-Ser)₃–Avi-tag基因序列中间质粒载体的构建

步骤如下：

（1）根据(Gly₄-Ser)₃及Avi-tag基因序列设计如下基因序列：

5′-GCGGAGGTGGATCTGGCGGAGGTGGATCGGGCGGAGGTGGATCAGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA-3′；如SEQIDNO.2所示；

其5′端及3′端分别设有PstI、HindIII酶切位点。

上述基因序列化学合成委托大连宝生物生物工程公司完成；

（2）化学合成得到的DNA片段双酶切重组至pUC18载体，获得含有(Gly₄-Ser)₃-Avi-tag融合基因的中间载体pUC(Gly₄-Ser)₃-Avi-tag。

实施例2IgG亲和肽-Avi-tag融合蛋白（ZZ-Avi-tagfusionprotein）的基因重组技术制备与纯化

步骤如下：

（1）IgG亲和肽（ZZ基因）序列的扩增、载体及基因工程菌的构建：设计引物：

5′-CCGGAATTCCATGGCGCAACACGATGAAG-3′（如SEQIDNO.3所示）；

和：5′-CCCCTGCAGTTAATTCGCGTC-3′（如SEQIDNO.4所示）；

以pEZZ18为模板，上述引物PCR扩增ZZ基因，克隆至实例1构建的中间质粒载体pUC(Gly4-Ser)3-Avi-tag的EcoRI、PstI位点，获重组表达载体pUCZZ-(Gly4-Ser)3-Avi-tag/E.coliBL21质粒，CaCl₂转化E.coliBL21，氨苄LB抗性平板（即培养基中除常规LB培养基的成分外，还含氨苄100μg/mL）筛选阳性克隆，获得基因工程菌。

（2）ZZ-Avi-tag融合蛋白的表达：

①挑取单克隆菌落接种于5mL液体LB培养基（培养基中除常规LB培养基的成分外，还含氨苄100μg/mL），37℃过夜（12h）培养、活化；

②活化菌液按照2%（v/v）的接种量转接于新鲜的50mL液体LB培养基（培养基中除常规LB培养基的成分外，还含氨苄100μg/mL），37℃培养至OD₆₀₀为0.3时，在培养基中加入终浓度为50μM的生物素，继续培养16h，依大肠杆菌菌体内BirA酶同步催化所表达的目的蛋白在Avi序列赖氨酸位点结合生物素。

（3）融合蛋白的提取：

①经上述培养的基因工程菌4℃，1000rpm离心10min，收集菌体；

②菌体以5mL0.1M的Tris缓冲液重悬，置入-80℃液氮中10min，再迅速置入37℃的恒温水浴中15min，如此反复冻融3次，释放目的蛋白；

③上述反复冻融的菌液4℃，12000rpm离心10min，上清转入一新离心管中；

（4）目的融合蛋白的纯化：

①清洗柱子：用2柱体积的BufferA清洗Strep-Tactin柱；

②样品上柱：取步骤（4）冻融的菌液上清5mL流通上柱结合目的蛋白；

③冲洗柱子：用5柱体积的BufferA洗柱；

④目的蛋白的洗脱：以BufferB洗脱目的蛋白，流速0.2ml/min，收集每一部分并各取20μlSDS-PAGE鉴定；

⑤目的蛋白的脱盐与浓缩：使用Millipore超滤器，4℃，4000rpm，离心30min浓缩，用5mL0.1MPBS加入超滤管中，离心30min，重复3次，可去除浓缩液中的EDTA并将缓冲液更换为0.1MPBS，将浓缩液以0.1MPBS稀释至合适体积，既得定点定量生物素标记的ZZ亲和肽：ZZ-Biotin。

实施例3ZZ-Biotin对ZZ亲和肽的定向固定

步骤如下：

（1）按100μL/孔的ZZ-Biotin蛋白溶液（PBST溶液，含1MNaCl；ZZ-Biotin蛋白浓度0.05μg/mL）加到亲和素预包被聚苯乙烯的96孔聚苯乙烯板孔内，37℃温育2h；

（2）以含0.2MNaCl的PBST溶液洗涤，共洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干96孔板，获得ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板（如图2所示），4℃保存。

实施例4ZZ-Biotin导向IgG多克隆抗体在微孔板表面的三维定向固定

步骤如下：

（1）按100μL/孔的兔IgG抗体（兔IgG抗体的浓度为0.1μg/mL，溶剂为含1MNaCl的PBS溶液，）加到上述ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，37℃温育2h；

（2）以含0.2MNaCl的PBST溶液洗涤，共洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干96孔板，获得三维定向固定的兔多克隆IgG抗体（如图3所示）。

实施例5ZZ-Biotin导向IgG单克隆抗体在微孔板表面的三维定向固定

步骤如下：

（1）按100μL/孔的鼠单克隆抗体（0.01μg/mL，含1MNaCl的PBS溶液，）加到聚苯乙烯微孔板已包被的96孔细胞培养板，37℃温育2h；

（2）以含0.2MNaCl的PBST溶液洗涤，共洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干96孔板，获得三维定向固定的鼠单克隆IgG抗体。

实施例6ZZ-Biotin导向三维定向固定IgG抗体对检测效能的影响

步骤如下：

（1）按100μL/孔的鼠-抗IgY单克隆抗体（IgG2a亚类）（鼠IgG抗体的浓度为0.1μg/mL，溶剂为含1MNaCl的PBS溶液）加到实施例3的ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，37℃温育2h；

（2）以含0.2MNaCl的PBST溶液洗涤，共洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干96孔板。

（3）100μL系列浓度的IgY（0～400ng/mL）加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，100μL/孔HRP标记的山羊-抗IgY抗体（1:2000）加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，TMB底物显色。

（4）对照实验：生物素化学直接标记的鼠-抗IgY单克隆抗体（IgG2a亚类）（鼠IgG抗体的浓度为0.1μg/mL，溶剂为含1MNaCl的PBS溶液）按100μL/孔的加入亲和素预包被聚苯乙烯的96孔聚苯乙烯板孔，4℃过夜包被，以PBST洗涤3次，每次5min，甩干；100μL系列浓度的IgY（0–400ng/mL）加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，100μL/孔HRP标记的山羊-抗IgY抗体（1:2000）加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，TMB底物显色。

（5）两种不同固定方式的结果如图4所示，本发明ZZ-Biotin导向三维定向固定IgG抗体的检测线性范围为0.5～800ng/mL，检测灵敏度为0.1ng/mL；对照试验即直接吸附固定模式的检测线性范围为2～600ng/mL，检测灵敏度为1ng/mL。本发明ZZ-Biotin导向三维定向固定IgG抗体技术在ELISA测定中有更宽的检测线性范围，检测灵敏度可提高10倍。

Claims (4)

1.一种位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽在制备三维定向固定IgG抗体中的应用，其特征是，所述位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽制备方法包括以下步骤：

（1）根据(Gly-Gly_-Gly_-Gly-Ser)₃及Avi基因序列，化学合成(Gly₄-Ser)₃-Avi的基因片段，所述Avi基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，重组至pUC18载体，获得中间质粒载体；

（2）设计引物以PCR方式获得IgG亲和肽基因，重组至步骤（1）获得的中间质粒载体，获得原核表达载体，其中所述的IgG亲和肽为ZZ亲和肽；

（3）原核表达载体转化感受态大肠杆菌BL21，获得基因工程菌；

（4）培养基因工程菌，培养基中含有生物素，依菌体内BirA酶同步催化，在所表达的目的蛋白的Avi序列的赖氨酸位点结合生物素；

（5）纯化目的蛋白，获得生物素定点定量连接的IgG亲和肽；

应用时，方法为：（A）首先，将位点特异性生物素标记的IgG亲和肽与预包被亲和素或链霉亲和素的聚苯乙烯载体以生物素-亲和素结合特异性定向吸附固定；（B）然后再利用IgG亲和肽与IgG抗体的特异性结合将IgG抗体Fc端结合到IgG亲和肽上。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽的制备方法具体步骤如下：

（1）根据Avi-tag氨基酸序列，化学合成其基因序列，并在其5′端置入柔性蛋白Linker：(Gly₄-Ser)₃的基因序列，得(Gly₄-Ser)₃-Avi-tag基因序列，并分别在该重组基因片段上下游置入PstI、HindIII酶切位点，酶切插入pUC18载体，得中间质粒载体；

（2）表达载体及基因工程菌的构建：

①设计引物PCR扩增ZZ亲和肽基因，并插入到步骤（1）获得的中间质粒载体的EcoRI、PstI位点，构建得到重组表达载体pUCZZ-(Gly₄-Ser)₃-Avi-tag；

②步骤①获得的重组表达载体通过CaCl₂转化感受态大肠杆菌BL21，氨苄LB抗性平板筛选阳性克隆，获得基因工程菌；

（3）基因工程菌的培养及体内生物素化：

①挑取步骤（2）获得的基因工程菌的单克隆菌落，接种于5mL液体LB培养基，37℃过夜培养、活化；

②步骤①获得的活化菌液按照2%的接种量转接于新鲜的50mL液体LB培养基，37℃培养至OD600为0.3时，在培养基中加入终浓度为50μM的生物素，继续培养16h，依大肠杆菌菌体内BirA酶同步催化所表达的目的蛋白在Avi序列赖氨酸位点结合生物素；

（4）融合蛋白的提取：

①步骤（3）培养获得的基因工程菌于4℃，1000rpm离心10min，收集菌体；

②菌体以5mL0.1M的Tris缓冲液重悬，置入-80℃液氮中10min，再迅速置入37℃的恒温水浴中15min，如此反复冻融3次；

③步骤②反复冻融的菌液4℃，1200rpm离心10min，上清转入一新离心管中；

（5）目的融合蛋白的纯化：

①清洗柱子：用2柱体积的BufferA清洗Strep-Tactin柱,所述BufferA的配方组成为：100mMTris·Cl，150mMNaCl，1mMEDTA，余量为水，pH8.0；

②样品上柱：取步骤（4）冻融的菌液上清5mL流通上柱结合目的蛋白；

③冲洗柱子：用5柱体积的BufferA洗柱，并收集每部分的洗脱液；

④目的蛋白的洗脱：以BufferB洗脱目的蛋白,所述BufferB的配方组成为：100mMTris·Cl，150mMNaCl，1mMEDTA,2.5mMdesthiobiotin，pH8.0；

⑤目的蛋白的脱盐与浓缩：使用Millipore超滤器，4℃，4000rpm，离心30min浓缩，即得定点定量生物素标记的ZZ亲和肽。

3.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述步骤（A）的具体方式如下：

①100μL/孔的量将IgG亲和肽-Biotin蛋白溶液加到亲和素预包被聚苯乙烯的96孔聚苯乙烯板孔内，37℃温育2h；

②以含0.2MNaCl的PBST溶液洗涤，或：以含0.2MNaCl及0.005%NaN₃的PBST溶液洗涤，共洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干96孔板，获得IgG亲和肽-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板。

4.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述步骤（B）的具体方式如下：

①按100μL/孔的量将IgG抗体加到步骤（A）处理后的IgG亲和肽-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，37℃温育2h；

②以含0.2MNaCl的PBST溶液洗涤，共洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干96孔板，获得三维定向固定的IgG抗体。