CN105504064A - Pcna融合蛋白及表达方法和生物素化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方法，所述PCNA融合蛋白的序列包括849个碱基，共编码283个氨基酸，前261个氨基酸为PCNA序列，方法为将分别用限制性内切酶切的PCNA基因的PCR产物、表达载体连接进行连接，再转入细胞中表达并诱导培养得到，并与生物素连接酶、生物素等孵育得到生物素化的PCNA融合蛋白。通过上述方式，本发明得到的PCNA融合蛋白能够特异性偶联生物素，其氨基酸序列包含人PCNA，同时在C末端带有一段序列标签-AviTag。几乎所有的蛋白质都可以在一个独特的Avi-tag位点轻易且有效地被生物素化，该方法不会对蛋白的抗原活性产生影响。

Description

PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方法

技术领域

本发明涉及医药生物领域，特别是涉及一种PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方法。

背景技术

1978年，Miyachi等在系统性红斑狼疮患者的血清中发现了一种只存在于增殖性细胞（正常增殖细胞及肿瘤细胞）的抗原，并将其命名为增殖细胞核抗原（ProliferatingCellNuclearAntigen，简称PCNA）。以后的研究发现PCNA与细胞增殖的启动密切相关，是反映细胞增殖状态的良好指标，因此近年来掀起了对PCNA研究的热潮，尤其在肿瘤方面。

PCNA作为细胞异常增殖的关键蛋白与临床研究紧密相关。国内外在多种肿瘤疾病中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展、分级、分期、放疗敏感性、预后、复发和转移、死亡原因、肿瘤标志物等各个方面的相关性。研究结果显示：在常见的胃癌、肺癌、肝癌等疾病中都有PCNA的异常表达。除此之外，也有研究表明某些细胞增殖性疾病的发生和发展也与PCNA相关，如：类风湿性关节炎中滑膜细胞、老年核性白内障和皮质性白内障晶体上皮细胞及动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞的异常增殖。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方法，该融合蛋白涵盖了人PCNA的主要抗原表位，采用BirA活化生物素形成生物素酰-5'-腺苷酸，将生物素特异地转移到PCNA-Avitag上，反应条件温和且标记的专一性极高。每一个AviTag仅可以加入一个生物素分子，对整个蛋白的活性和功能影响很小，因此本方法特别适合用于抗原的生物素化。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种PCNA融合蛋白，所述PCNA融合蛋白的序列为SeqNo.1，所述序列包括849个碱基，共编码283个氨基酸，所述编码序列中前261个氨基酸为PCNA序列。

提供一种PCNA融合蛋白的表达方法，包括步骤为：

（1）对PCNA基因进行PCR扩增得到PCR产物，上游引物包括BamHI序列，下游引物包括XhoI序列；

（2）分别对PCR产物和表达载体pET-22b(+)用限制性内切酶进行酶切，酶切后的所述PCR产物和所述表达载体连接得到连接产物，所述限制性内切酶为BamHI和XhoI；

（3）将所述连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞中，并于培养基上进行培养得到阳性质粒；

（4）将所述阳性质粒转入E.coliBL21感受态细胞中，并于培养基上培养得到阳性菌种，并对所述阳性菌种进行诱导培养；

（5）对所述诱导培养后的阳性菌种纯化，得到PCNA融合蛋白。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述上游引物为5'-CGGATCCGATGTTCGAGGCGC-3'，所述下游引物为5'-CTCGAGAGAGCCTTAGTGCCA-3'。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述连接产物转化入细胞中是通过热激法实现的；步骤（3）中所述细胞涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，挑取单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养；步骤（3）中所述培养过夜，提取质粒后进行双酶切，鉴定并筛选得到阳性质粒。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（4）中所述阳性质粒转入细胞中是通过热激法实现的；步骤（4）中所述细胞涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，在37℃下培养16小时，挑取单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养；步骤（4）中所述培养为过夜培养，培养后提取质粒，双酶切，筛选得到阳性菌种。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（4）中对所述阳性菌种进行诱导培养的步骤为：将所述阳性菌种转接至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养，并加入IPTG进行诱导表达优化，诱导培养温度为20-37℃。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（5）中所述诱导培养后的阳性菌种先进行离心并超声破碎，再用BindingBuffer平衡好的Ni-NTAAgarose亲和层析柱纯化。

提供一种PCNA融合蛋白的生物素化方法，包括步骤为：向N,N-二羟乙基甘氨酸溶液中加入PCNA融合蛋白、生物素连接酶、三磷酸腺苷、乙酸镁和生物素混匀孵育，去除游离生物素得到生物素化的PCNA融合蛋白。

在本发明一个较佳实施例中，所述孵育是在30℃下孵育1小时，所述去除游离生物素是在超滤管中进行的。

在本发明一个较佳实施例中，所述生物素化的PCNA融合蛋白是包被于ELISA板上，通过Streptavidin-HRP二抗进行检测判断。

本发明的有益效果是：本发明的PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方法，得到的PCNA融合蛋白能够特异性偶联生物素，其氨基酸序列包含人PCNA，同时在C末端带有一段序列标签-AviTag。几乎所有的蛋白质都可以在一个独特的Avi-tag位点轻易且有效地被生物素化，该方法不会对蛋白的抗原活性产生影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明实施例二中PCNA融合蛋白质粒图；

图2是本发明实施例二中PCNA融合蛋白质粒酶切鉴定图；

图3是本发明实施例三中PCNA的表达和纯化图，图中BI为诱导前，M为Marker，AI为诱导后，S为上清，P为沉淀，FT为穿透，E1-E6为不同管收集的洗脱产物。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

PCNAcDNA基因的人工合成：

根据GenBank已公开的人PCNAcDNA序列（GenBank序列登录号：BC000491.2），在该序列开放阅读框（OpenReadingFrame，ORF）的3’端终止密码子之前添加能够翻译AviTag的基因序列。

AviTag的基因序列：

CTGAACGATATTTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGGCTCT。

实施例二：

PCNA融合蛋白的表达

（一）实验材料：

1、菌株与载体：大肠杆菌E.coliDH5a和BL21a购自Invitrogen公司。载体pET-22b(+)购自Novangen公司。

2、酶与试剂：DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶为NEB公司产品。

3、生化试剂：IPTG为Sigma公司产品。过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、低熔点琼脂糖为Bio-Rad公司产品。氨苄青霉素购自上海生物工程有限公司。BirA购自EpigenBiotech公司，Streptavidin-HRP二抗购自ThermoFisher公司。限制性内切酶（BamHI和XhoI）购于NewEnglandBiotech公司。

4、培养基：大肠杆菌培养基为LB，所述LB包括质量分数为1%的蛋白胨、质量分数为0.5%的酵母提取物、质量分数为1%的NaCl，pH值为7.0。

（二）实施步骤：

1、人工合成目的基因序列之后，进行PCR反应得到PCR产物。

2、上游引物：5'-CGGATCCGATGTTCGAGGCGC-3'。

3、下游引物：5'-CTCGAGAGAGCCTTAGTGCCA-3'。

4、回收PCR产物，并将PCR产物和表达载体pET-22b(+)经过BamHI/XhoI双酶切，所述PCR产物形成粘性末端，二者16℃过夜连接得到连接产物。所述连接产物通过热激法转化入E.coliDH5α感受态细胞中，涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，培养过夜，挑取单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中，培养过夜，提取质粒，双酶切，鉴定并筛选阳性质粒。次日，挑取阳性克隆子培养、提取质粒测序及酶切鉴定。测序结果与预期结果一致，没有任何碱基置换。双酶切鉴定位于850bp处出现目标条带，该条带大小与预期基本一致，说明目标基因已经成功克隆至表达载体pET-22b(+)中，并命名为pET-22b(+)-(PCNA)质粒。具体参阅图1和图2。

实施例三：

PCNA融合蛋白的诱导表达和纯化

1、PCNA融合蛋白的诱导表达：将测序正确且经酶切鉴定过的阳性重组质粒即实施例二中得到的阳性质粒通过热激法转入大肠杆菌E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，复苏后涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，37℃下培养16小时，挑取单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中，37℃，200r/min培养过夜，提取质粒，双酶切，筛选得到阳性菌种。

2、次日，按1：100的比例将所得阳性菌种转接至新鲜的含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中，37℃，200r/min培养至OD600≈0.6时，按单因素试验进行诱导表达优化，包括：温度、诱导剂量、诱导时间、培养pH条件等。可以选择加入IPTG至终浓度0.5mM，25℃诱导培养5h时，蛋白可溶性上清表达量最优。诱导培养温度可以选择20-37℃，20-25℃更优，低温诱导可降低蛋白表达速率，提高蛋白可溶表达量。

3、按照上述已确定的培养及诱导条件，进行大量培养500mL。离心，离心条件为6500rpm，5分钟，收集菌体，并用蒸馏水洗涤菌体，再用20mM、pH值为7.3的PBS缓冲液重悬，加入1mMPMSF后冰浴条件下超声破碎（破碎条件为：超声15s，间隔5秒，超声总时间为15min），离心超声破碎后的液体，离心条件为13000rpm，10min，4℃。离心后取上清。

4、将上述步骤中的上清上样于以用BindingBuffer平衡好的Ni-NTAAgarose纯化柱。BindingBuffer为：20mMPBSpH7.3，WashingBuffer为：20mMTrisBufferpH8.0，Elutionbuffer为：20mMTris，0.3M咪唑，pH8.0。用SDS-PAGE检测PCNA融合蛋白的诱导表达及纯化过程，见图3。纯化得到的PCNA融合蛋白大小约为35KDa，纯度大于95%，可用于后续试验。

实例四、PCNA融合蛋白的生物素化

1、生物素标记：在1ml浓度为50mM的N,N-二羟乙基甘氨酸bicine（pH值为8.3）中，加入100μg的PCNA融合蛋白，同时加入15个活性单位的BirA（BiotinLigase,BirA,EC6.3.4.15），和终浓度为10mM的三磷酸腺苷ATP，10mM的乙酸镁，和50uM生物素混匀后，30℃孵育一个小时。

2、去除游离生物素：根据目的蛋白的大小选择合适的超滤管进行超滤和浓缩。将标记后的样品加入到10KDa的超滤管中，离心浓缩后，再加入10倍体积的5mMTris缓冲液，连续4次，达到去除游离生物素和浓缩的目的。

3、生物素化PCNA融合蛋白的ELISA检测：将未经生物素化的PCNA融合蛋白、生物素化PCNA融合蛋白及阴性对照BSA（未经生物素化），分别以10ng/孔和1ng/孔的包被量包被在ELISA板上，通过Streptavidin-HRP二抗进行检测。下表为生物素化PCNA融合蛋白的ELISA检测结果，由ELISA结果生物素标记后与对照有显著差异，说明标记成功。

	1	2	3	4	5
						10ng/well	0.372	0.732	1.619	1.334	0.477
1ng/well	0.374	0.420	1.105	0.724	0.470

上表中1-5分别为：空白对照、未经生物素化的PCNA融合蛋白、生物素化PCNA融合蛋白（largesample）、生物素化PCNA融合蛋白PCNA-Avitag（smallsample）、BSA（未生物素化）。

序列

<110>

SeqNo.1

1ATGTTCGAGGCGCGCCTGGTCCAGGGCTCCATCCTCAAGAAGGTGTTGGAGGC

1MFEARLVQGSILKKVLEA

55ACTCAAGGACCTCATCAACGAGGCCTGCTGGGATATTAGCTCCAGCGGTGTAAACCTGCA

19LKDLINEACWDISSSGVNLQ

115GAGCATGGACTCGTCCCACGTCTCTTTGGTGCAGCTCACCCTGCGGTCTGAGGGCTTCGA

39SMDSSHVSLVQLTLRSEGFD

175CACCTACCGCTGCGACCGCAACCTGGCCATGGGCGTGAACCTCACCAGTATGTCCAAAAT

59TYRCDRNLAMGVNLTSMSKI

235ACTAAAATGCGCCGGCAATGAAGATATCATTACACTAAGGGCCGAAGATAACGCGGATAC

79LKCAGNEDIITLRAEDNADT

295CTTGGCGCTAGTATTTGAAGCACCAAACCAGGAGAAAGTTTCAGACTATGAAATGAAGTT

99LALVFEAPNQEKVSDYEMKL

355GATGGATTTAGATGTTGAACAACTTGGAATTCCAGAACAGGAGTACAGCTGTGTAGTAAA

119MDLDVEQLGIPEQEYSCVVK

415GATGCCTTCTGGTGAATTTGCACGTATATGCCGAGATCTCAGCCATATTGGAGATGCTGT

139MPSGEFARICRDLSHIGDAV

475TGTAATTTCCTGTGCAAAAGACGGAGTGAAATTTTCTGCAAGTGGAGAACTTGGAAATGG

159VISCAKDGVKFSASGELGNG

535AAACATTAAATTGTCACAGACAAGTAATGTCGATAAAGAGGAGGAAGCTGTTACCATAGA

179NIKLSQTSNVDKEEEAVTIE

595GATGAATGAACCAGTTCAACTAACTTTTGCACTGAGGTACCTGAACTTCTTTACAAAAGC

199MNEPVQLTFALRYLNFFTKA

655CACTCCACTCTCTTCAACGGTGACACTCAGTATGTCTGCAGATGTACCCCTTGTTGTAGA

219TPLSSTVTLSMSADVPLVVE

715GTATAAAATTGCGGATATGGGACACTTAAAATACTACTTGGCTCCCAAGATCGAGGATGA

239YKIADMGHLKYYLAPKIEDE

775AGAAGGATCTGCCGGAGGCTCTGGAGGCCTGAACGATATTTTCGAAGCTCAGAAAATCGA

259EGSAGGSGGLNDIFEAQKIE

835ATGGCACGAAGGCTCT

279WHEGS

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种PCNA融合蛋白，其特征在于，所述PCNA融合蛋白的序列为SeqNo.1，所述序列包括849个碱基，共编码283个氨基酸，所述编码序列中前261个氨基酸为PCNA序列。

2.一种PCNA融合蛋白的表达方法，其特征在于，包括步骤为：

（1）对PCNA基因进行PCR扩增得到PCR产物，上游引物包括BamHI序列，下游引物包括XhoI序列；

（2）分别对PCR产物和表达载体pET-22b(+)用限制性内切酶进行酶切，酶切后的所述PCR产物和所述表达载体连接得到连接产物，所述限制性内切酶为BamHI和XhoI；

（3）将所述连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞中，并于培养基上进行培养得到阳性质粒；

（4）将所述阳性质粒转入E.coliBL21感受态细胞中，并于培养基上培养得到阳性菌种，并对所述阳性菌种进行诱导培养；

（5）对所述诱导培养后的阳性菌种纯化，得到PCNA融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法，其特征在于，步骤（1）中所述上游引物为5'-CGGATCCGATGTTCGAGGCGC-3'，所述下游引物为5'-CTCGAGAGAGCCTTAGTGCCA-3'。

4.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法，其特征在于，步骤（3）中所述连接产物转化入细胞中是通过热激法实现的；步骤（3）中所述细胞涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，挑取单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养；步骤（3）中所述培养过夜，提取质粒后进行双酶切，鉴定并筛选得到阳性质粒。

5.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法，其特征在于，步骤（4）中所述阳性质粒转入细胞中是通过热激法实现的；步骤（4）中所述细胞涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，在37℃下培养16小时，挑取单菌落接种至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养；步骤（4）中所述培养为过夜培养，培养后提取质粒，双酶切，筛选得到阳性菌种。

6.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法，其特征在于，步骤（4）中对所述阳性菌种进行诱导培养的步骤为：将所述阳性菌种转接至含有40μg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养，并加入IPTG进行诱导表达优化，诱导培养温度为20-37℃。

7.根据权利要求2所述的PCNA融合蛋白的表达方法，其特征在于，步骤（5）中所述诱导培养后的阳性菌种先进行离心并超声破碎，再用BindingBuffer平衡好的Ni-NTAAgarose亲和层析柱纯化。

8.一种PCNA融合蛋白的生物素化方法，其特征在于，包括步骤为：向N,N-二羟乙基甘氨酸溶液中加入PCNA融合蛋白、生物素连接酶、三磷酸腺苷、乙酸镁和生物素混匀孵育，去除游离生物素得到生物素化的PCNA融合蛋白。

9.根据权利要求8所述的PCNA融合蛋白的生物素化方法，其特征在于，所述孵育是在30℃下孵育1小时，所述去除游离生物素是在超滤管中进行的。

10.根据权利要求8所述的PCNA融合蛋白的生物素化方法，其特征在于，所述生物素化的PCNA融合蛋白是包被于ELISA板上，通过Streptavidin-HRP二抗进行检测判断。