CN112695052A - 一种重组人糖皮质激素受体GRα-His蛋白及其表达和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人糖皮质激素受体GRα‑His蛋白及其表达和纯化方法。本发明通过构建重组人糖皮质激素受体GRα蛋白的原核表达载体，使重组人糖皮质激素受体GRα在大肠杆菌中高效表达，表达的重组蛋白以融合蛋白形式存在，经纯化、鉴定获得重组人糖皮质激素受体GRα‑His蛋白。本发明的重组人糖皮质激素受体GRα‑His蛋白通过SPR技术检测与糖皮质激素药物(氢化可的松、地塞米松、泼尼松)结合，显示其均具有较强的亲和力，其亲和力分别为2.99×10^‑5M、5.41×10^‑4M、1.51×10^‑4M，有利于检测动物源性食品药品中糖皮质激素的残留。

Description

一种重组人糖皮质激素受体GRα-His蛋白及其表达和纯化 方法

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程领域，具体涉及一种重组人糖皮质激素受体GRα蛋白及其表达和纯化方法。

背景技术

糖皮质激素是一类甾体固醇激素，广泛应用于畜牧养殖业中，用于提高饲料转化率，促进畜禽生长，主要包括氢化可的松、地塞米松、甲基泼尼松、泼尼松等40余种。此类激素药物也可导致肥胖、多毛、血糖升高、高血压、骨质疏松、肾脏损伤、代谢紊乱及破坏机体免疫力等，对人体产生巨大潜在危害。近年来，在经济利益的驱使下，人们为了促进动物生长和提高瘦肉率，糖皮质激素长期滥用及不合理使用现象非常普遍。因此，建立有效的糖皮质激素残留检测方法，实现动物源性食品中滥用糖皮质激素的监控尤为必要。

糖皮质激素主要通过与糖皮质激素受体(GRα)结合而发挥功能。GRα是一种可溶性单链多肽组成的磷蛋白，广泛分布于机体组织细胞中，属于类固醇激素受体家族的一员，它与糖皮质激素具有高亲和力与专一性，是糖皮质激素发挥重要生理和药理作用的中介物。生理状态下，GRα与热休克蛋白Hsp90以复合体的形式存在而促进GRα参与糖皮质激素信号传导：Hsp90与GRα的结合能够改变GRα的立体构象，使GRα的激素结合区像一个口袋一样打开，从而能够与糖皮质激素结合。当糖皮质激素与GRα结合后，Hsp90从Hsp90-GRα蛋白复合体中解离，导致GRα的DNA结合区及受体二聚化位点暴露，疏水口袋打开，糖皮质激素与GRα结合后LBD构象发生改变，导致AF2亚域重构，从而激活GRα发挥生理效应。鉴于糖皮质激素是通过体内高选择性的作用于GRα，而阻断或改变GRα复合物正常生理功能信号来发挥其药效活性。目前有关于人糖皮质激素受体GRα基因表达载体的构建和蛋白表达虽已有文献报道，但这些方法都没有对表达的GRα蛋白进行纯化，也没有检测对糖皮质激素的亲和力，其蛋白活性是未知的。本发明拟通过重组表达、纯化人GRα蛋白并检测其与糖皮质激素结合的亲和力，有助于开展动物源性食品中糖皮质激素的全谱检测研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人糖皮质激素受体GRα蛋白及其表达和纯化方法，通过构建重组人糖皮质激素受体GRα的原核表达载体，实现重组人糖皮质激素受体GRα在大肠杆菌中的高效表达。

本发明的目的是提供一种重组人糖皮质激素受体GRα-His蛋白的表达和纯化方法。

本发明的另一目的提供以上所述GRα-His蛋白的表达和纯化方法所制备的GRα-His蛋白。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种重组人糖皮质激素受体GRα-His蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将含有人糖皮质激素受体GRα基因的重组表达载体质粒转化到宿主菌，获得重组菌株；

S2.对重组菌株进行诱导，表达GRα-His蛋白；

S3.采用镍离子亲和层析柱对步骤S2表达的蛋白进行纯化，用平衡缓冲液平衡层析柱，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，得GRα-His蛋白溶液；

S4.将步骤S3所得的蛋白溶液加入到透析缓冲液中进行透析，即得纯化的GRα-His蛋白。

优选地，步骤S1所述表达载体为原核表达载体pET-28a(+)。

优选地，步骤S1所述宿主菌为大肠杆菌。

优选地，步骤S1的具体步骤为：将人糖皮质激素受体GRα基因构建到原核表达载体pET-28a(+)中得到重组原核表达载体pET-28a-GRα质粒，再将重组表达载体质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。

优选地，步骤S2所述诱导的方法为采用诱导剂IPTG进行诱导。

更优选地，所述诱导的方法为：在含氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养至OD_600nm为0.4～0.6，加入终浓度为0.2～0.6mM的IPTG进行诱导。

更优选地，所述IPTG的终浓度为0.2mM。

更优选地，所述诱导的条件为：在18℃条件下诱导表达24h。

优选地，步骤S3所述平衡缓冲液含有浓度为15～20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、250～300mmol/L的NaCl，pH为7.8～8.0。

更优选地，步骤S3所述平衡缓冲液含有浓度为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、300mmol/L的NaCl，pH为8.0。

优选地，步骤S3所述洗脱缓冲液含有浓度为15～20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、250～300mmol/L的NaCl、200～250mmol/L的咪唑，pH为7.8～8.0。

更优选地，步骤S3所述洗脱缓冲液含有浓度为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、300mmol/L的NaCl、250mmol/L的咪唑，pH为8.0。

优选地，步骤S4所述透析缓冲液含有浓度为15～20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、250～300mmol/L的NaCl、0.5～1mmol/L的二硫苏糖醇、体积浓度为8～10％的丙三醇，pH为8.0～8.5。

更优选地，步骤S4所述透析缓冲液含有浓度为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、300mmol/L的NaCl、1mmol/L的二硫苏糖醇、体积浓度为10％的丙三醇，pH为8.5。

因此，本发明还要求保护以上任一所述GRα-His蛋白的表达和纯化方法所制备的GRα-His蛋白。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过构建重组人糖皮质激素受体GRα蛋白的原核表达载体，并通过合理调整、优化蛋白表达和纯化的实验条件，使重组人糖皮质激素受体GRα在大肠杆菌中高效表达，经纯化、鉴定获得重组人糖皮质激素受体GRα蛋白，本发明的重组人GRα蛋白可与三种糖皮质激素结合，具有较强的结合亲和力，有利于检测动物源性食品中糖皮质激素残留。本发明通过成本较低的表达系统体外获得大量的GRα蛋白，并成功检测到与药物相结合，可用于实际样品中糖皮质激素药物残留的检测，为开展糖皮质激素检测的研究提供基础。

附图说明

图1为GRα基因PCR扩增产物电泳分析结果；M：1kb DNA Marker。

图2为重组表达载体pET-28a-GRα酶切鉴定结果；其中，M1：DNA Marker DL2000，M2：1kb DNA Marker，1-2：GRα-His的质粒与酶切后产物；

图3为重组人GRα蛋白的不同诱导表达条件的结果；其中，M：marker；1：0.6mM IPTG诱导24h沉淀，2：0.4mM IPTG诱导24h沉淀，3：0.2mM IPTG诱导24h沉淀；4：0.6mM IPTG诱导24h上清，5：0.4mM IPTG诱导24h上清，6：0.2mM IPTG诱导24h上清。

图4为重组人GRα-His蛋白的镍离子亲和层析柱纯化结果；其中，1：含10mmol/L咪唑的缓冲液，2：含25mmol/L咪唑的缓冲液，3：含250mmol/L咪唑的缓冲液。

图5为重组人GRα-His蛋白的Western blotting检测结果；其中，1-2：重组GRα-His蛋白。

图6为重组人GRα-His蛋白与氢化可的松的浓度梯度结合曲线。

图7为重组人GRα-His蛋白与地塞米松的浓度梯度结合曲线。

图8为重组人GRα-His蛋白与泼尼松的浓度梯度结合曲线。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明中的原核表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性内切酶BamHI和XhoI、质粒提取试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司；IPTG、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；His标签Ni-NTA纯化柱购自亚科因(武汉)生物技术有限公司；抗His标签鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

实施例1重组人糖皮质激素受体蛋白(GRα)表达载体pET-28a-GRα及表达菌株的构建

1、通过NCBI GeneBank数据库查找人GRα基因序列(登录号为X03225.1，序列如SEQID NO：1所示)，采用全基因合成方法获取GRα基因的质粒，以质粒为模板，加入上游引物和下游引物进行PCR扩增(扩增产物结果如图1所示)，上、下游引物如下所示：

上游引物GRα-F(SEQ ID NO：2)：

5'-cgcggatccATGGACTCCAAAGAATCATTAACTCC-3'；

下游引物GRα-R(SEQ ID NO：3)：

5'-ccgctcgagCTTTTGATGAAACAGAAGTTTTTTGA-3'；

将扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化PCR扩增产物；将回收纯化的产物和pET-28a(+)表达载体用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定(如图2所示)，将酶切鉴定正确的阳性质粒送铂尚生物技术(上海)有限公司测序，测序结果与目的序列一致，成功构建重组原核表达载体pET-28a-GRα。

2、将重组原核表达载体pET-28a-GRα转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中：取出保存于-80℃超低温冰箱中的BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上解冻，将5～10μL的连接产物加入至50μL的BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即放置在冰中，冷却10min；加入预冷的750μL LB液体培养基中，37℃条件下200rpm振荡培养2h；将培养好的菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。

3、筛选阳性菌落：在上述平板上，随机挑选多个白色菌落，用30μL无菌水稀释后用作PCR扩增验证模板，经PCR扩增后送铂尚生物技术(上海)有限公司测序，最终获得重组人GRα基因序列的大肠杆菌工程菌。

实施例2重组人GRα-His蛋白的表达、纯化及鉴定

1、重组人GRα-His蛋白的表达

挑取实施例1转化重组的阳性质粒的单菌落接种于1mL含氨苄青霉素(100μg/mL)LB液体培养基中，37℃过夜培养；将培养物以1:100转入LB液体培养基中扩大培养，37℃培养至OD_600nm为0.6时，加入终浓度0.2mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在18℃条件下诱导表达24h。同时设置空载体和pET28a-GRα未诱导为对照。

诱导完后离心，将收集的菌体悬浮于100mL预冷PBS(含PMSF 1mmol/mL)中，4℃进行超声破碎至澄清，15000rpm，离心15min，分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析；用考马斯亮蓝染色液染色20～30min后，置于脱色液中脱色数小时，直至蓝色背景消失。图3中SDS-PAGE电泳检测结果的泳道3和6显示，采用0.2mmol/L IPTG诱导使得目的蛋白在大肠杆菌中获得了大量表达。

2、重组人GRα-His蛋白的纯化

根据pET-28a(+)表达载体上带有的6×His标签，采用镍离子亲和层析柱进行蛋白纯化，具体步骤为：用平衡缓冲液平衡柱子，用柱子的5～10倍体积含咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液；将收集的洗脱液放入透析缓冲液中，透析缓冲液为含NaCl、DTT、丙三醇的Tris-HCl缓冲液，4℃条件下透析8～12h，即获得纯化的重组人GRα-His蛋白。

其中，平衡缓冲液为含NaCl的Tris-HCl缓冲液，pH为8.0，Tris-HCl缓冲液的浓度为20mmol/L，NaCl浓度为300mmol/L；

洗脱缓冲液为含NaCl、咪唑的Tris-HCl缓冲液，pH为8.0，Tris-HCl缓冲液的浓度为20mmol/L，NaCl浓度为300mmol/L，咪唑浓度为250mmol/L；

透析缓冲液为含NaCl、DTT、丙三醇的Tris-HCl缓冲液，pH为8.5，Tris-HCl缓冲液的浓度为20mmol/L，NaCl浓度为300mmol/L，DTT浓度为1mmol/L，丙三醇体积浓度为10％。

将纯化得到的重组人GRα-His蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图4的泳道3所示，当使用含有浓度为250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液时，SDS-PAGE电泳结果显示具有清晰的单一条带，说明所得到的重组人GRα-His蛋白纯化效果较好。

3、重组人GRα-His蛋白的鉴定

将以上得到的SDS-PAGE胶转至0.45μm PVDF膜，加入5％脱脂牛奶室温封闭1-2h，TBST洗膜后加入一抗(抗His标签鼠单克隆抗体，稀释比例为1:1000)，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，再加入二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠，稀释比例为1:5000)，室温孵育1-2h，TBST洗膜，采用ECL发光液(A液和B液等量混匀)显影目的条带，进行成像拍照。

Western blotting检测结果如图5泳道1和2所示，在89KD处具有明显的蛋白条带，证明表达纯化的蛋白为重组人GRα-His蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例3重组人GRα-His蛋白与糖皮质激素药物结合检测

1、实验步骤

采用基于受体-配体结合的表面等离子共振(SPR)检测方法检测重组人GRα-His蛋白与糖皮质激素药物的结合，具体操作步骤如下：

(1)将羧基修饰的芯片作为SPR传感芯片安装在Open SPR仪器上；

(2)先以最大流速150μL/min，注入缓冲液PBS进行流通通道校正；

(3)仪器达到信号基线后，上样200μL 80％的异丙醇，运行10s后排气泡，达到基线后，再用PBS冲洗样本环，并用空气排空；

(4)上样200μL的EDC/NHS混合溶液，EDC浓度为400mM，NHS浓度为100mM，比例为1:1，流速为20μL/min，运行10min，从而活化SPR芯片表面的羧基基团；

(5)将实施例1得到的糖皮质激素受体蛋白GRα-His用PBS稀释，经PBS稀释后浓度分别为0、12.5、25、50、100、200nM的GRα-His稀释液；

(6)在所得的活化表面羧基后的SPR芯片上流入200μL糖皮质激素受体蛋白GRα稀释液进行芯片偶联；流速为20μL/min，运行10min，用PBS冲洗样本环，并用空气排空；

(7)在GRα-His偶联后的SPR芯片上注入200μL乙醇胺溶液，流速为20μL/min，运行10min，用以封闭未反应的活化过的羧基位点，用PBS冲洗样本环，并用空气排空；

(8)用DMSO溶液将糖皮质激素药物(氢化可的松、地塞米松、泼尼松)溶解后，用PBS稀释成浓度为0、5、10、20、40、80μM的氢化可的松溶液，浓度为0、0.25、0.5、1、2.5mM的地塞米松溶液和浓度为0、0.125、0.25、0.5、1mM的泼尼松溶液，并以20μL/min上样，GRα与糖皮质激素结合反应温度为25℃，结合时间为240s，自然解离180s；

(9)采用TraceDrawer分析软件中的1:1结合模型计算GRα-His与糖皮质激素药物的结合动力学和亲和力。

2、实验结果

结果如图6～8和表1所示，GRα-His与氢化可的松、地塞米松、泼尼松的结合亲和力分别为2.99×10^-5M、5.41×10^-4M、1.51×10^-4M(表1)，说明本发明制备得到的重组人GRα-His蛋白亲和力较强，具有很好的活性。

表1 GRα与糖皮质激素结合的动力学及亲和力参数

对比例1不同浓度诱导剂IPTG对重组人GRα-His蛋白表达效果的影响

重组人GRα-His蛋白的表达和纯化方法步骤同实施例2，只是在重组人GRα-His蛋白的表达过程中，诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的使用浓度为0.4mmol/L和0.6mmol/L。

实验结果如图3的SDS-PAGE电泳检测结果所示，其中，泳道1和2分别为0.6mM、0.4mM IPTG诱导24h沉淀，泳道4和5分别为0.6mM、0.4mM IPTG诱导24h上清，泳道3和6分别为为0.2mM IPTG诱导沉淀、上清；可以看出，使用0.4mmol/L和0.6mmol/L IPTG对重组菌株诱导表达蛋白的效果不如0.2mM的IPTG。

对比例2不同浓度咪唑的洗脱缓冲液对重组人GRα-His蛋白纯化效果的影响

重组人GRα-His蛋白的表达和纯化方法步骤同实施例2，只是在重组人GRα-His蛋白的纯化过程中，洗脱缓冲液中咪唑浓度分别为10mmol/L和25mmol/L。

实验结果如图4的SDS-PAGE电泳检测结果所示，其中，泳道1～3分别为含10mmol/L咪唑、含25mmol/L咪唑和含250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液；可以看出，只有当使用含有浓度为250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液时，SDS-PAGE电泳结果显示具有清晰的单一条带，且表达效果较好，说明所得到的重组人GRα-His蛋白纯化效果较好。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种重组人糖皮质激素受体GRα-His蛋白及其表达和纯化方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2334

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atggactcca aagaatcatt aactcctggt agagaagaaa accccagcag tgtgcttgct 60

caggagaggg gagatgtgat ggacttctat aaaaccctaa gaggaggagc tactgtgaag 120

gtttctgcgt cttcaccctc actggctgtc gcttctcaat cagactccaa gcagcgaaga 180

cttttggttg attttccaaa aggctcagta agcaatgcgc agcagccaga tctgtccaaa 240

gcagtttcac tctcaatggg actgtatatg ggagagacag aaacaaaagt gatgggaaat 300

gacctgggat tcccacagca gggccaaatc agcctttcct cgggggaaac agacttaaag 360

cttttggaag aaagcattgc aaacctcaat aggtcgacca gtgttccaga gaaccccaag 420

agttcagcat ccactgctgt gtctgctgcc cccacagaga aggagtttcc aaaaactcac 480

tctgatgtat cttcagaaca gcaacatttg aagggccaga ctggcaccaa cggtggcaat 540

gtgaaattgt ataccacaga ccaaagcacc tttgacattt tgcaggattt ggagttttct 600

tctgggtccc caggtaaaga gacgaatgag agtccttgga gatcagacct gttgatagat 660

gaaaactgtt tgctttctcc tctggcggga gaagacgatt cattcctttt ggaaggaaac 720

tcgaatgagg actgcaagcc tctcatttta ccggacacta aacccaaaat taaggataat 780

ggagatctgg ttttgtcaag ccccagtaat gtaacactgc cccaagtgaa aacagaaaaa 840

gaagatttca tcgaactctg cacccctggg gtaattaagc aagagaaact gggcacagtt 900

tactgtcagg caagctttcc tggagcaaat ataattggta ataaaatgtc tgccatttct 960

gttcatggtg tgagtacctc tggaggacag atgtaccact atgacatgaa tacagcatcc 1020

ctttctcaac agcaggatca gaagcctatt tttaatgtca ttccaccaat tcccgttggt 1080

tccgaaaatt ggaataggtg ccaaggatct ggagatgaca acttgacttc tctggggact 1140

ctgaacttcc ctggtcgaac agttttttct aatggctatt caagccccag catgagacca 1200

gatgtaagct ctcctccatc cagctcctca acagcaacaa caggaccacc tcccaaactc 1260

tgcctggtgt gctctgatga agcttcagga tgtcattatg gagtcttaac ttgtggaagc 1320

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aatgattgca tcatcgataa aattcgaaga aaaaactgcc cagcatgccg ctatcgaaaa 1440

tgtcttcagg ctggaatgaa cctggaagct cgaaaaacaa agaaaaaaat aaaaggaatt 1500

cagcaggcca ctacaggagt ctcacaagaa acctctgaaa atcctggtaa caaaacaata 1560

gttcctgcaa cgttaccaca actcacccct accctggtgt cactgttgga ggttattgaa 1620

cctgaagtgt tatatgcagg atatgatagc tctgttccag actcaacttg gaggatcatg 1680

actacgctca acatgttagg agggcggcaa gtgattgcag cagtgaaatg ggcaaaggca 1740

ataccaggtt tcaggaactt acacctggat gaccaaatga ccctactgca gtactcctgg 1800

atgtttctta tggcatttgc tctggggtgg agatcatata gacaatcaag tgcaaacctg 1860

ctgtgttttg ctcctgatct gattattaat gagcagagaa tgactctacc ctgcatgtac 1920

gaccaatgta aacacatgct gtatgtttcc tctgagttac acaggcttca ggtatcttat 1980

gaagagtatc tctgtatgaa aaccttactg cttctctctt cagttcctaa ggacggtctg 2040

aagagccaag agctatttga tgaaattaga atgacctaca tcaaagagct aggaaaagcc 2100

attgtcaaga gggaaggaaa ctccagccag aactggcagc ggttttatca actgacaaaa 2160

ctcttggatt ctatgcatga agtggttgaa aatctcctta actattgctt ccaaacattt 2220

ttggataaga ccatgagtat tgaattcccc gagatgttag ctgaaatcat caccaatcag 2280

ataccaaaat attcaaatgg aaatatcaaa aaacttctgt ttcatcaaaa gtga 2334

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

cgcggatcca tggactccaa agaatcatta actcc 35

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

ccgctcgagc ttttgatgaa acagaagttt tttga 35

<210> 4

<211> 785

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

Met Asp Ser Lys Glu Ser Leu Thr Pro Gly Arg Glu Glu Asn Pro Ser

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Gln Glu Arg Gly Asp Val Met Asp Phe Tyr Lys Thr

20 25 30

Leu Arg Gly Gly Ala Thr Val Lys Val Ser Ala Ser Ser Pro Ser Leu

35 40 45

Ala Val Ala Ser Gln Ser Asp Ser Lys Gln Arg Arg Leu Leu Val Asp

50 55 60

Phe Pro Lys Gly Ser Val Ser Asn Ala Gln Gln Pro Asp Leu Ser Lys

65 70 75 80

Ala Val Ser Leu Ser Met Gly Leu Tyr Met Gly Glu Thr Glu Thr Lys

85 90 95

Val Met Gly Asn Asp Leu Gly Phe Pro Gln Gln Gly Gln Ile Ser Leu

100 105 110

Ser Ser Gly Glu Thr Asp Leu Lys Leu Leu Glu Glu Ser Ile Ala Asn

115 120 125

Leu Asn Arg Ser Thr Ser Val Pro Glu Asn Pro Lys Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Ala Val Ser Ala Ala Pro Thr Glu Lys Glu Phe Pro Lys Thr His

145 150 155 160

Ser Asp Val Ser Ser Glu Gln Gln His Leu Lys Gly Gln Thr Gly Thr

165 170 175

Asn Gly Gly Asn Val Lys Leu Tyr Thr Thr Asp Gln Ser Thr Phe Asp

180 185 190

Ile Leu Gln Asp Leu Glu Phe Ser Ser Gly Ser Pro Gly Lys Glu Thr

195 200 205

Asn Glu Ser Pro Trp Arg Ser Asp Leu Leu Ile Asp Glu Asn Cys Leu

210 215 220

Leu Ser Pro Leu Ala Gly Glu Asp Asp Ser Phe Leu Leu Glu Gly Asn

225 230 235 240

Ser Asn Glu Asp Cys Lys Pro Leu Ile Leu Pro Asp Thr Lys Pro Lys

245 250 255

Ile Lys Asp Asn Gly Asp Leu Val Leu Ser Ser Pro Ser Asn Val Thr

260 265 270

Leu Pro Gln Val Lys Thr Glu Lys Glu Asp Phe Ile Glu Leu Cys Thr

275 280 285

Pro Gly Val Ile Lys Gln Glu Lys Leu Gly Thr Val Tyr Cys Gln Ala

290 295 300

Ser Phe Pro Gly Ala Asn Ile Ile Gly Asn Lys Met Ser Ala Ile Ser

305 310 315 320

Val His Gly Val Ser Thr Ser Gly Gly Gln Met Tyr His Tyr Asp Met

325 330 335

Asn Thr Ala Ser Leu Ser Gln Gln Gln Asp Gln Lys Pro Ile Phe Asn

340 345 350

Val Ile Pro Pro Ile Pro Val Gly Ser Glu Asn Trp Asn Arg Cys Gln

355 360 365

Gly Ser Gly Asp Asp Asn Leu Thr Ser Leu Gly Thr Leu Asn Phe Pro

370 375 380

Gly Arg Thr Val Phe Ser Asn Gly Tyr Ser Ser Pro Ser Met Arg Pro

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ser Thr Ala Thr Thr Gly Pro

405 410 415

Pro Pro Lys Leu Cys Leu Val Cys Ser Asp Glu Ala Ser Gly Cys His

420 425 430

Tyr Gly Val Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala

435 440 445

Val Glu Gly Gln His Asn Tyr Leu Cys Ala Gly Arg Asn Asp Cys Ile

450 455 460

Ile Asp Lys Ile Arg Arg Lys Asn Cys Pro Ala Cys Arg Tyr Arg Lys

465 470 475 480

Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys Lys Lys

485 490 495

Ile Lys Gly Ile Gln Gln Ala Thr Thr Gly Val Ser Gln Glu Thr Ser

500 505 510

Glu Asn Pro Gly Asn Lys Thr Ile Val Pro Ala Thr Leu Pro Gln Leu

515 520 525

Thr Pro Thr Leu Val Ser Leu Leu Glu Val Ile Glu Pro Glu Val Leu

530 535 540

Tyr Ala Gly Tyr Asp Ser Ser Val Pro Asp Ser Thr Trp Arg Ile Met

545 550 555 560

Thr Thr Leu Asn Met Leu Gly Gly Arg Gln Val Ile Ala Ala Val Lys

565 570 575

Trp Ala Lys Ala Ile Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Leu Asp Asp Gln

580 585 590

Met Thr Leu Leu Gln Tyr Ser Trp Met Phe Leu Met Ala Phe Ala Leu

595 600 605

Gly Trp Arg Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Ala Asn Leu Leu Cys Phe Ala

610 615 620

Pro Asp Leu Ile Ile Asn Glu Gln Arg Met Thr Leu Pro Cys Met Tyr

625 630 635 640

Asp Gln Cys Lys His Met Leu Tyr Val Ser Ser Glu Leu His Arg Leu

645 650 655

Gln Val Ser Tyr Glu Glu Tyr Leu Cys Met Lys Thr Leu Leu Leu Leu

660 665 670

Ser Ser Val Pro Lys Asp Gly Leu Lys Ser Gln Glu Leu Phe Asp Glu

675 680 685

Ile Arg Met Thr Tyr Ile Lys Glu Leu Gly Lys Ala Ile Val Lys Arg

690 695 700

Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Trp Gln Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys

705 710 715 720

Leu Leu Asp Ser Met His Glu Val Val Glu Asn Leu Leu Asn Tyr Cys

725 730 735

Phe Gln Thr Phe Leu Asp Lys Thr Met Ser Ile Glu Phe Pro Glu Met

740 745 750

Leu Ala Glu Ile Ile Thr Asn Gln Ile Pro Lys Tyr Ser Asn Gly Asn

755 760 765

Ile Lys Lys Leu Leu Phe His Gln Lys Gly Ser His His His His His

770 775 780

His

785

Claims (9)

1.一种重组人糖皮质激素受体GRα-His蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将含有人糖皮质激素受体GRα基因的重组表达载体质粒转化到宿主菌，获得重组菌株；

S2.对重组菌株进行诱导，表达GRα-His蛋白；

S3.采用镍离子亲和层析柱对步骤S2表达的蛋白进行纯化，用平衡缓冲液平衡层析柱，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，得GRα-His蛋白溶液；

S4.将步骤S3所得的蛋白溶液加入到透析缓冲液中进行透析，即得纯化的GRα-His蛋白。

2.根据权利要求1所述GRα-His蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，步骤S2所述诱导的方法为采用诱导剂IPTG进行诱导。

3.根据权利要求2所述GRα-His蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，所述诱导的方法为：在含氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养至OD_600nm为0.4～0.6后，加入终浓度为0.2～0.6mM的IPTG进行诱导。

4.根据权利要求3所述GRα-His蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，所述IPTG的终浓度为0.2mM。

5.根据权利要求3所述GRα-His蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，所述诱导的条件为：在18℃条件下诱导表达24h。

6.根据权利要求1所述GRα-His蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，步骤S3所述平衡缓冲液含有浓度为15～20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、250～300mmol/L的NaCl，pH为7.8～8.0。

7.根据权利要求1所述GRα-His的表达和纯化方法，其特征在于，步骤S3所述洗脱缓冲液含有浓度为15～20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、250～300mmol/L的NaCl、200～250mmol/L的咪唑，pH为7.8～8.0。

8.根据权利要求1所述GRα-His蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，步骤S4所述透析缓冲液含有浓度为15～20mmol/L的Tris-HCl缓冲液、250～300mmol/L的NaCl、0.5～1mmol/L的二硫苏糖醇、体积浓度为8～10％的丙三醇，pH为8.0～8.5。

9.权利要求1～8任一所述GRα-His蛋白的表达和纯化方法所制备的GRα-His蛋白。

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