CN108359686A

CN108359686A - 融合标签NusA在大肠杆菌表达PLCG2蛋白中的应用

Info

Publication number: CN108359686A
Application number: CN201810156867.4A
Authority: CN
Inventors: 胡晴; 李学斌
Original assignee: WUHAN EIAAB SCIENCE CO Ltd
Current assignee: WUHAN EIAAB SCIENCE CO Ltd
Priority date: 2018-02-24
Filing date: 2018-02-24
Publication date: 2018-08-03

Abstract

本发明涉及一种蛋白融合标签促进一种蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于按以下步骤进行：通过片段扩增和酶切酶连的方法在现有的表达载体上加入一段融合标签的序列，然后再将目的蛋白的序列克隆到被改造的表达载体上，将构建正确的表达载体转化到大肠杆菌中进行诱导表达，用SDS‑PAGE检测表达情况以及表达量。本发明解决了PLCG2蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达的量少的问题，减少了蛋白纯化过程中的繁琐步骤，且为下一步用此蛋白进行动物免疫试验提供了更好的免疫原，进一步提高以此蛋白和抗体为核心的试剂盒检测的准确度和精确度。

Description

融合标签NusA在大肠杆菌表达PLCG2蛋白中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白融合标签促进一种蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法。

背景技术

磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2）是一种磷脂。仅占膜磷脂的不到1%，功能却非常复杂。这种低丰度的多磷酸肌醇脂可被激素或细胞因子受体介导活化的磷酸脂酶C水解为第二信使分子肌醇三磷酸(IP3)和二酰基甘油(DAG)参与信号传递。

磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）具有水解细胞内第二信使环磷酸腺苷（cAMP）或环磷酸鸟苷（cGMP）的功能，降解细胞内cAMP或cGMP，从而终结这些第二信使所传导的生化作用。cAMP和cGMP对于细胞活动起着重要的调节作用。而其浓度的调节主要由腺苷酸环化酶的合成和磷酸二酯酶(PDEs)水解作用之间的平衡决定。PDEs在人体内分布广泛，生理作用涉及多个研究领域。近年来，PDEs作为新的治疗靶点，引起了众多学者广泛的关注，成为一个新的研究热点。而PEDs 蛋白的检测，免疫学方法无疑是最为方便的一种，免疫学方法检测需要建立检测的方法并制备试剂盒，而试剂盒的核心组分 - 抗体的制备方法是传统的用重组蛋白生产抗体，一般的流程是：先根据目的蛋白的特性和使用途径构建表达菌株，使其能表达符合条件的目的蛋白，然后培养并诱导其表达，收集菌体并裂解使其释放出目的蛋白，再根据目的蛋白的融合标签和其表达形式将裂解液用不同的方法进行纯化已得到纯化的目的蛋白，再用纯化的目的蛋白进行动物免疫实验，得到多克隆抗体，最后进行抗体的纯化得到。此方案程序繁琐，蛋白酶的成本高，不适合大规模工业生产，并且每多一步操作，不仅蛋白的量损失至少20%，蛋白免疫学活性也会损失30% 左右。

如果重组蛋白以包涵体（未能完整折叠的肽链，结构和功能都会改变）形式表达，不仅纯化步骤更繁琐，操作会更困难，而且蛋白的活性和质量无法保证，直接影响到下一步的实验研究。因为外源蛋白，特别是人源蛋白用大肠杆菌系统进行表达时，受到其缺乏翻译后修饰系统的限制容易形成包涵体形式，甚至无法表达或者表达量低，为解决这一问题，各种蛋白标签应运而生。

NusA是大肠杆菌自身的一种蛋白，即转录抗终止因子，由496个左右氨基酸组成，分子量55 kDa左右，是1999年Davia从4000种大肠杆菌蛋白库种筛选得到的。研究结果表明，含有NusA标签的大多数蛋白几乎全部以可溶性是表达，而单独表达或者与硫氧还蛋白标签（Trx-tag，一种常用于促溶的融合标签）融合表达是都以包涵体形式表达。NusA这种本身高度可溶的蛋白标签与重组蛋白融合后，能够明显提高融合蛋白的可溶性。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术中存在的问题，提供一种有效且实用的蛋白表达过程中促使其以可溶形式表达的方法，简化后续的纯化步骤，有效地提高蛋白产品的质量。

NusA是大肠杆菌自身的一种蛋白，即转录抗终止因子，由496个左右氨基酸组成，分子量55 kDa左右。研究结果表明，含有NusA标签的大多数蛋白几乎全部以可溶性是表达，而单独表达或者与硫氧还蛋白标签（Trx-tag，一种常用于促溶的融合标签）融合表达是都以包涵体形式表达。NusA这种本身高度可溶的蛋白标签与重组蛋白融合后，能够明显提高融合蛋白的可溶性。

本发明的技术方案为：

蛋白融合标签促进一种蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于按以下步骤进行：通过片段扩增和酶切酶连的方法在现有的表达载体上加入一段融合标签的序列，然后再将目的蛋白的序列克隆到被改造的表达载体上，将构建正确的表达载体转化到表达宿主中进行诱导表达，用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况以及表达量。

所述蛋白融合标签为NusA蛋白标签，所述目的蛋白为PLCG2蛋白，所述表达载体为pET28a，所述克隆菌为大肠杆菌DH5α，所述表达宿主为大肠杆菌Rosetta和大肠杆菌C41菌株，在大肠杆菌中表达系统中常用的pET系列的载体还有pET30a和pET32a，此方法不仅限于一种载体。

本发明的PLCG2蛋白可以大量表达，且可溶性表达达95%以上。

构建可溶性表达PLCG2蛋白的表达菌株具体按照以下步骤进行：

1），在NCBI（National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心）查找NusA的序列信息，去掉末尾的终止密码子，设计分别带有酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ的引物，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定，若无非特异性条带，则用清洁回收试剂盒回收NusA片段；若有非特异性条带，则用胶回收试剂盒回收；

2），将回收得到的NusA片段和载体pET28a分别进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，用清洁回收试剂盒回收带双酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ的NusA片段，用胶回收试剂盒回收带双酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ的线性载体pET28a；

3），回收得到的酶切产物用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，根据抗性筛选正确的转化子，进行PCR鉴定和测序鉴定；

4），鉴定正确的转化子扩大培养，抽提质粒NusA-pET28a；

5），在NCBI查找plcg2序列信息，分析蛋白的性质，根据免疫原的要求，选择合适的阶段片段，进行密码子优化后，在武汉天一辉远生物有限公司全基因合成并通过克隆到载体pET28a上；

6），根据优化后的plcg2序列信息设计带有酶切位点NcoⅠ和NdeⅠ引物，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定，若无非特异性条带，则用清洁回收试剂盒回收plcg2片段；若有非特异性条带，则用胶回收试剂盒回收；

7），将回收得到的plcg2片段和载体NusA-pET28a分别进行NcoⅠ和NdeⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，用清洁回收试剂盒回收带双酶切位点NcoⅠ和NdeⅠ的NusA片段，用胶回收试剂盒回收带双酶切位点NcoⅠ和NdeⅠ的线性载体NusA-pET28a；

8)，回收得到的酶切产物用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，根据抗性筛选正确的转化子，进行PCR鉴定和测序鉴定。

本发明所依据的原理是NusA是大肠杆菌自身的一种蛋白，将在大肠杆菌中不能或者只有少量以可溶形式表达的蛋白与之融合表达，能促使其从包涵体形式向可溶形式转化，从而使蛋白的结构和性质得到改善，也使后续的纯化工作简化，动物免疫试验得到的抗体质量改善。

附图说明

图1图2为构建载体plcg2-NusA-pET28a的示意图。

图3为本发明中NusA片段的扩增，其中泳道1是DNA Marker，大小如图；泳道2是目的片段，大小1488 bp。

图4为本发明中plcg2片段的扩增，其中泳道1是DNA Marker，大小如图；泳道2是目的片段，大小603 bp。

图5为本发明中NusA-pET28a-DH5α转化子的PCR验证，其中泳道1是DNA Marker，大小如图；泳道2~6是选取的5个转化子；PCR引物为载体通用引物T7/T7t。

图6为本发明中plcg2-NusA-pET28a-DH5α转化子的PCR验证，其中泳道1是DNAMarker，大小如图；泳道2~6是选取的5个转化子；PCR引物为载体通用引物plcg2-F/T7t。

图7为PLCG2蛋白的表达情况，未融合NusA标签，泳道1：未诱导的空白对照；泳道2：蛋白分子标准，大小如图所注；泳道3：上清样品，即可溶形式表达的蛋白；泳道4：沉淀样品，即包涵体形式表达的蛋白；目的蛋白分子量大小约22.11 kDa。

图8为PLCG2蛋白的表达情况，融合NusA标签，泳道1：蛋白分子标准，大小如图所注；泳道2：未诱导的空白对照；泳道3：上清样品，即可溶形式表达的蛋白；泳道4：沉淀样品，即包涵体形式表达的蛋白；目的蛋白分子量大小约76.67 kDa（其中标签蛋白的大小约54.56 kDa）。

具体实施方式

1.材料与试剂。

1.1菌株与质粒

大肠杆菌E. coli DH5α、E. coli Rosetta菌株为本公司保存。

1.2试剂与试剂盒

限制性内切酶Nco I、Nde I、Xho I和T4连接酶购自TaKaRa 公司；

质粒小量提取试剂盒（Plasmid Mini Kit）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（Gel ExtractionKit）和PCR清洁回收试剂盒（Cycle Pure Kit）购自OMEGA生物技术有限公司。

1.3培养基

LB培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，NaCl 10 g/L，固体培养基在此基础上加琼脂15 g/L。121℃灭菌30 min。

1.4溶液

50 mg/mL卡那霉素：称取3 g卡那霉素粉末，加蒸馏水溶解后，定容至100 mL。用0.22 μm的无菌滤膜过滤并分装在灭菌的1.5 mL离心管于-20℃保存；

1×PBS缓冲液（pH 7.5）：132 mL 1 mol/L K2HPO4，868 mL 1 mol/L KH2PO4，用磷酸或KOH调整pH值为7.5±0.1；

2×上样缓冲液：1.25 mL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）， 0.2 mL 10% SDS，0.2 mL0.5%溴酚蓝，2.5 mL甘油，加蒸馏水溶解后，定容至10 mL；

30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29.0 g，甲叉双丙烯酰胺1.0 g，加蒸馏水溶解后，定容至1 L；

1×跑胶缓冲液：3.03 g Tris base，14.4 g甘氨酸，1.0 g SDS，加蒸馏水溶解后，定容至1 L；

染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0 g，甲醇450 mL，冰乙酸100 mL，加蒸馏水溶解后，定容至1 L；

脱色液：甲醇100 mL，冰乙酸100 mL，加蒸馏水溶解后，定容至1 L。

2.实验过程。

2.1 NusA标签序列的扩增

根据去掉终止密码子的NusA基因序列，设计带有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物，以重组质粒NusA-pUC57为模板进行PCR反应：反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性1 min 20 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环34次，72℃延伸5 min ，PCR体系如下：

2.2 载体NusA-pET28a构建

PCR反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，长度大小符合目的基因后，用清洁回收试剂盒回收目的条带，用微量紫外分光光度计检测浓度和纯度；

清洁回收得到的NusA片段和pET28a质粒用NdeⅠ和XhoⅠ分别进行双酶切，酶切体系如下表：

双酶切后用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测酶切产物，判断酶切是否充分，用胶回收试剂盒分别进行回收；

分别清洁回收得到的酶切产物用T4连接酶进行连接，酶连体系如下表：

2.3 plcg2序列的扩增

根据优化后的plcg2基因序列，设计带有NcoⅠ和NdeⅠ酶切位点的引物，以重组质粒plcg2-pET28a为模板进行PCR反应：反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性1 min 20 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环34次，72℃延伸5 min ，PCR体系如下：

2.4 载体plcg2-NusA-pET28a构建

清洁回收得到的plcg2片段和NusA-pET28a质粒用NcoⅠ和NdeⅠ分别进行双酶切，酶切体系如下表：

2.5转化子的筛选

从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，在冰上放置5 min；加入酶连产物，轻轻混匀后，在冰上放置30 min；42℃水浴锅中热击90 s，立即置冰上冷却3-5 min；向离心管中加入800 µL LB培养基，37℃下200 r/min孵育45-60 min；取适量的菌液涂布于含有30 µg/mLKan的LB平板上，待菌液完全被吸收后，37℃倒置培养16-24 h；

待上述加有抗生素的LB平板上长出单菌落后，挑取单菌落于装有1 mL LB培养基（含有30 µg/mL Kan）的1.5 mL灭菌离心管中，每个平板大约挑取5个左右转化子，37℃、200 r/min培养约6 h；

以菌液为模板进行PCR反应；1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，根据片段大小初步筛选阳性克隆；验证正确的转化子再进行测序以进一步验证；测序正确的转化子用PA瓶培养到合适浓度后，甘油终浓度25%保存于-80℃。

2.6诱导表达

用质粒抽提试剂盒小量提取plcg2-NusA-pET28a和plcg2-pET28a，分别转化表达菌大肠杆菌BL21（DE3）和大肠杆菌C41，转化方法同2.5；

挑取合适的转化子至PA瓶中（瓶中有10 mL含50 µg/mL卡那霉素的LB培养基，其中大肠杆菌BL21（DE3）还要另外添加氯霉素，其终浓度为50 µg/mL的），37℃下180 r/min生长5~6h，至OD₆₀₀约0.5左右；

取1 mL保存菌种（甘油终浓度25%）；取1 mL于1.5 mL无菌离心管中作为空白对照（不诱导的对照）；取4 mL于另一无菌的PA瓶中；每个PA瓶中加入4 μL 无菌的IPTG溶液（配制浓度为238 mg/mL），PA瓶分成两份，分别于16℃和37℃下过夜诱导，空白对照于37℃下过夜培养。

2.7 SDS-PAGE检测

2.7.1 SDS-PAGE胶的制备

按照下表所示制备SDS-PAGE胶，先制备分离胶，待凝后再制备浓缩胶；

2.7.2样品的制备

诱导完成后取出PA瓶，每个PA瓶中取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，6000 r/min离心1min，弃上清；

沉淀用300 μL 1×PBS充分重悬，置于冰水浴中超声破碎，至菌悬液澄清透亮，12,000r/min离心30 min；

上清取出至另一1.5 mL离心管中；沉淀用300 μL 500 mM尿素溶液（用1×PBS配制）溶解；

取此两种方法处理的样品10 μL，加入10 μL 2×上样缓冲液，沸水浴10 min；

2.7.3电泳及染色脱色

待沸水浴的样品冷却至室温后，将样品按照顺序加入PAGE胶的点样孔中，先设置80 V电压电泳15~20 min，观察到溴酚蓝然后设置120 V电压电泳90 min左右，注意观察溴酚蓝条带的位置，待其靠近底部时即可停止电泳；

取出PAGE胶，加入适量染色液，稍微加热后放在水平摇床上，染色30 min；倒掉染色液，加入适量脱色液，稍微加热后放在水平摇床上，脱色30 min；换两次脱色液，至肉眼可见清洗条带即可。

Claims

1.一种蛋白融合标签促进一种蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于按以下步骤进行：通过片段扩增和酶切酶连的方法在现有的表达载体上加入一段融合标签的序列，然后再将目的蛋白的序列克隆到被改造的表达载体上，将构建正确的表达载体转化到大肠杆菌中进行诱导表达，用SDS-PAGE检测表达情况以及表达量。

2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于：所述的蛋白融合标签为NusA，即转录抗终止因子。

3.根据权利要求书1或2所述的方法，其特征在于按以下步骤进行：

1）合成NusA片段，设计带有双酶切位点的引物，进行PCR扩增；

2）将NusA片段和载体pET28a分别酶切后，酶连得到改造后的载体NusA-pET28a；

3）合成plcg2片段，设计带有双酶切位点的引物，进行PCR扩增；

4）将plcg2片段和载体NusA-pET28a分别酶切后，酶连得到表达载体plcg2-NusA-pET28a；

5）将表达载体转化到表达宿主大肠杆菌BL21和大肠杆菌C41中，挑取转化子进行培养和诱导表达；

6）SDS-PAGE检测表达产物。