CN109055416A - 一种可溶性重组蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可溶性重组蛋白的制备方法。所述方法将所要研究的目的蛋白与具有硫氧还蛋白和His标签融合表达，通过优化表达条件，可使目的蛋白的可溶性表达量显著提高，利用肠激酶酶切位点特性，通过两步亲和层析快速实现目的蛋白的纯化，纯度可达95％以上，与传统方法相比，本发明所述方法可使可溶性重组蛋白表达量显著提高，避免包涵体蛋白后处理复性及活性不稳定的麻烦，得到的重组蛋白生物学活性高且比较稳定，对于规模化生产高活性重组蛋白具有很好的应用前景。

Description

一种可溶性重组蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及应用DNA重组技术生产基因工程蛋白药物技术，具体公开了一种可溶性重组蛋白的制备方法。

背景技术

酶、蛋白、抗体等重组蛋白类产品在人们的生产、生活、医疗中发挥着不可或缺的作用。尤其是重组蛋白、单克隆抗体等生物技术药物是20世纪后期随着生命科学的发展而出现的最新一代药物，与传统的小分子化学药物相比，重组蛋白药物治疗效果显著，还有特异性强、毒性低、副作用小、生物功能明确等优势，其经过30多年的发展已成为现代生物制药领域最重要的一类产品之一。

到目前为止，人们表达的重组蛋白质已有4000多种，其中用E.coli表达的蛋白质要占90％以上，尽管基因重组技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，然而重组蛋白在表达和纯化工艺上还存在相当大的技术困难，远未达到满足人们需求的程度。许多外源蛋白在大肠杆菌胞内不能正确折叠获得天然空间结构和生物功能，而是以无活性的不可溶的包涵体形式存在。这样的重组蛋白不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1-3.0μm的固体颗粒。自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来，人们就一直期望得到高活性、高产量的重组蛋白。然而许多外源蛋白在大肠杆菌胞内不能正确折叠获得天然空间结构和生物功能，而是以无活性的不可溶的包涵体形式存在。要获得具有生物活性的目的蛋白需首先将包涵体溶解后进行重组蛋白复性，这些复杂操作极大增加了获得高活性纯品的难度和成本，为达到增加表达量，提高产物的正确构象及可溶性，方便下游纯化操作，人们采用亲和标签融合表达的方式，应用如麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽硫转移酶，硫氧还原蛋白，多聚组氨酸标签等，这些亲和表达策略大大促进了蛋白质的研究和应用。在重组蛋白的N端或C端融合可溶性的融合标签(fusion tag)是提高许多重组蛋白可溶性的一种有效的方法，已经证明能够提高重组蛋白可溶性的融合标签包括谷胱甘肽S转移酶、硫氧还原蛋白、麦芽糖结合蛋白、小分子泛素样修饰蛋白及NusA标签等。我们选择了硫氧还蛋白融合表达体系，这样以硫氧还蛋白融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞周质空间中，以可溶性形式高效表达，融合蛋白有完全生物学活性，表明融合蛋白在胞质中能折叠成正确的空间构象，从而避免了纯化时对重组蛋白进行变性、复性等复杂操作，为后处理带来方便，更适于放大生产。

发明内容

本发明的目的在于改进现有技术，提供一种表达纯化目的蛋白的方法，用于解决现有技术中的问题。本发明公开了一种可溶性重组蛋白的制备方法，所述方法将所要研究的目的蛋白与具有硫氧还蛋白和His标签融合表达，通过优化表达条件，可使目的蛋白的可溶性表达量显著提高，利用肠激酶酶切位点特性，通过两步亲和层析快速实现目的蛋白的纯化，纯度可达95％以上，与传统方法相比，本发明所述方法可使可溶性重组蛋白表达显著提高，避免包涵体蛋白后处理复性及活性不稳定的麻烦，得到的重组蛋白生物学活性高且比较稳定，对于规模化生产高活性重组蛋白具有很好的应用前景。

本发明公开的一种可溶性重组蛋白的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：

(1)构建目的蛋白表达载体：将目的蛋白编码基因序列插入表达质粒PET32上，构建获得目的蛋白表达载体；

(2)将步骤(1)中所得目的蛋白表达载体转化宿主菌，获得转化的宿主菌，并在表达条件下，培养转化的宿主菌，从而表达由目的蛋白、硫氧还蛋白和His标签标签组成的融合蛋白；

(3)通过优化表达条件实现融合蛋白可溶性表达，优化条件浓度为：以异丙基硫代半乳糖苷为诱导物对宿主菌进行诱导表达，诱导浓度为0.002-0.08mMoL/L，诱导温度为22-37℃，诱导表达时间为4-12小时；

(4)离心收集诱导后的宿主菌，超声破碎，收集上清液并采用Ni亲和层析法分离由目的蛋白、硫氧还蛋白和His标签组成的融合蛋白，收集200-400mM咪唑洗脱液，超滤浓缩并除去咪唑；

(5)将步骤(4)所得融合蛋白在适当的孵育条件下，用肠激酶进行切割，酶切液采用Ni亲和层析法分离，收集流穿液超滤浓缩，获得重组目的蛋白；

(6)将获得重组蛋白用0.22um滤膜过滤除菌，分装冻干保存，活性测定。

附图说明

图1 PTG-IL-6重组质粒酶切及PCR鉴定结果图中1、2道分别为PTG-IL-6质粒酶切及菌液PCR鉴定结果；3、4道分别为PTG-IL-6质粒酶切及菌液PCR鉴定结果；(挑取不同菌斑做筛选)M1：DL5000 marker，M2：DL5000 marker；

图2 pET-IL-6重组质粒酶及PCR鉴定结果图中1、2(3、4)(5、6)(7、8)分别pET-IL-6不同菌斑质粒酶切及菌液PCR鉴定结果，M1：DL5000 marker，M2：DL5000 marker；

图3重组人白介素6诱导表达图中1道为141未诱导结果；2道为141诱导结果；M：蛋白marker；

图4重组人白介素6蛋白IPTG浓度优化结果图中1、2、3、4、5、6分别终浓度0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2mM IPTG诱导141工程菌表达结果；M：蛋白marker；

图5重组人白介素6可溶性表达优化结果图中1、2分别终浓度0.002mM IPTG诱导菌体超声破碎后上清与沉淀；图中3、4分别终浓度0.004mM IPTG诱导菌体超声破碎后上清与沉淀；图中5、6分别终浓度0.008mM IPTG诱导菌体超声破碎后上清与沉淀；M：蛋白marker；

图6重组人白介素6第一次亲和层析纯化结果图中1、2、3、4、5、6、7、8、9分别300mM洗脱不同收集管样品电泳结果；M：蛋白marker；

图7重组人白介素6第二次纯化结果图中1、2、3、4、5、6、7、8、9分别酶切后流穿液不同收集管样品电泳结果；M：蛋白marker；

图8重组人白介素6免疫原性鉴定结果图中1为重组IL-6阳性对照；2位自制重组IL-6；两者均能IL-6单抗抗体反应

图9 TF-1细胞增殖实验测定重组人白介素6生物学活性结果

具体实施方式

下面通过具体的制备实施例进一步描述本发明，其应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明的目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用的材料和操作方法是本领域公知的。

实施例1.1人IL-6基因克隆：

方法：根据gene bank公布IL-6基因序列(序列号：NM00060)，利用PrimerPremier5.0软件设计引物一对异性引物P1：5’ACGGAATTCCCAGTACCCCCAGGAGAAG 3’，划线部分分别为酶切位点EcoRI，P2：5’AATAGCTCGAGTTACATTTGCCGAAGAGCC 3’，划线部分为XhoI酶切位点。以人外周血淋巴细胞提取总mRNA为模板，先反转录成cDNA，再以该cDNA为模板，用IL-6特异引物扩增出完整人重组IL-6基因片段，回收PCR产物连接到PTG19-T载体，得质粒PTG-IL-6，经过测序确定为正确序列，鉴定结果见图1；

实施例1.2原核表达载体构建：

1.使用DNA回收试剂盒回收PCR产物。

2.用限制性内切酶用EcoRI和XhoI双酶切已回收的PCR扩增产物，得到酶切产物；

3.用限制性内切酶用EcoRI和XhoI双酶切表达载体pET-32a(+)，利用DNA回收试剂盒回收载体骨架；

4.将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，即得到连接产物；

5.将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定：1)菌落PCR使用引物为P1和P2，结果在570bp左右有清晰单一条带的菌落为阳性菌落；2)酶切鉴定所用的酶为限制性内切酶EcoRI和XhoI，同时在570bp和5900bp左右有清晰单一条带的菌落为阳性菌落，鉴定结果见图2；3)将以上检定结果都为阳性的重组质粒进行DNA测序。测序正确的即为目的重组质粒，命名为pET-IL-6

6.将重组质粒pET-IL-6转化大肠杆菌BL21(DE3)后筛选单菌落，先用菌液PCR扩增鉴定，阳性菌提取质粒并进行酶切验证。结果为阳性的菌落，即为目的重组工程菌，命名为的141。

实施例1.3重组白介素6的诱导表达及表达条件优化

1.将重组工程菌141接种于5mL含氨苄抗性(Amp+)的液体LB培养基中，在37℃，200rpm的摇床上震荡培养，至OD600值为0.8时，加入诱导物IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，终浓度0.5mM/L)，180rpm继续诱导培养，诱导时间为5小时：同时设对照组，除不加诱导物IPTG外，其他操作相同，通过SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白表达，结果见图3；

2复苏制备好的141工程菌，备用；把新鲜的培养物接种分别接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养3个小时，分别按终浓度0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2mM加入IPTG，继续摇菌5个小时后收集菌体，裂解制备蛋白样品，通过SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白表达，结果见图4；

3把新鲜的培养物接种分别接种于100mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养3个小时，分别加入终浓度为0.002mM/L、0.004mM/L、0.008mM/L IPTG，继续摇菌5个小时后收集菌体，PBS重悬后超声破碎，分别收集上清与沉淀，取以上4种样品各40μL，分别加入10μL5X蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸5-10分钟。然后各上样10μL，进行SDS-PAGE电泳方法检测，电泳检测结果如图5所示，诱导后的菌体沉淀中在38kD左右处出现一条蛋白条带，与预期大小相符。

实施例1.4重组人白介素6蛋白纯化

重组白介素6第一步纯化

1.离心收集诱导表达后菌体，PBS重悬后超声破碎，离心收取上清备用；

2.取出琼脂糖凝胶FF填料，湿法装柱5mL，使用10倍柱床体积纯化水冲洗柱子，流速1.5mL/min。

3.使用5倍柱床体积50mM PBS pH7.4平衡柱子，流速1.5mL/min；

4.取20mL菌体破碎后上清，过0.45um滤膜后稀释1倍，上样、流速0.8mL/min；

5.低浓度咪唑(5mM)洗5-10柱体积，过梯度咪唑(50-300mM)，收下每个洗脱峰；

6. 50mM PBS pH7.4(含500mM咪唑)洗柱子2-3倍柱床体积。

7.纯化水冲洗柱子10倍柱床体积。

8. 20％乙醇洗柱子2-3倍柱床体积，柱子20％乙醇4℃保存。

纯化过程中每步需各取60μL的样品，分别加入15μL 5X蛋白上样缓冲液(含DTT)，混匀后煮沸5-10分钟。然后各上样20μL进行SDS-PAGE电泳检测，电泳检测结果如图5所示。纯化所得目的蛋白跑SDS-PAGE胶如图6。并且rhIL-6的纯度能够达到85％以上。

重组白介素6第二步纯化目的蛋白浓缩、洗滤、酶切

1.酶切前纯化所得目的蛋白用10KD超滤浓缩管浓缩，4℃、5000rpm，浓缩至1mL左右的体积。

2.再用50mM PBS pH7.4洗滤浓缩后蛋白，每次洗10倍体积，洗三次，确保除去目的蛋白中的咪唑。

3.目的蛋白浓缩洗滤后测浓度，加肠激酶缓冲液和肠激酶，酶切36h左右，使His标签和目的蛋白完全切开。

4. IL-6酶切后纯化

5.过滤纯化水冲洗柱子10倍柱床体积，流速1.5mL/min。

6. 50mM PBS pH7.4平衡柱子5倍柱床体积，流速1.5mL/min。

7.酶切后样品稀释1倍后上样，收集流穿，流速0.8mL/min。

8.用50mM PBS pH7.4洗脱目的蛋白，流速0.8mL/min。

9.用含300mM咪唑的50mM PBS pH7.4洗柱子，洗下His标签。

10.用含500mM咪唑50mM PBS pH7.4洗柱子2-3倍柱床体积。

11.过滤纯化水冲洗柱子10倍柱床体积。20％乙醇洗柱子2-3倍柱床体积，柱子20％乙醇4℃保存。

纯化所得目的蛋白跑SDS-PAGE胶如图7，经分析纯度＞95％。

目的蛋白酶切纯化后，用超滤浓缩管浓缩至1mg/mL左右，分装冻干保存。

实施例1.5重组白介素6鉴定

1.将重组人白介素6电泳完毕的SDS-PA6E胶放入TBST缓冲液中漂洗一次，蛋白胶放到转膜缓冲液中浸泡。

2.将一层海绵垫在膜转移缓冲液中浸湿，用镊子夹到转膜仪上，按照海绵垫，三层滤纸，蛋白胶，聚偏氟乙烯(PVDF)膜，三层滤纸，海绵垫，顺序放好，对齐，夹起放到转膜仪上，操作时，滤纸、海绵垫均要在转膜缓冲液中浸湿。每层之间若有气泡应用玻璃试管轻轻滚动将其赶出。

3.打开转膜仪，300mA转膜75分钟。

4.将膜取出，放入TBST缓冲液中，60rpm水平震荡仪漂洗3次，每次8分钟。

5.用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭液20mL，60rpm水平震荡仪室温封闭2小时。

6.用加有3μL一抗(白介素6抗体1∶1000)的3mL抗体孵育液，4℃60rpm水平震荡仪过夜孵育。

7.用10mL TBST，常温60rpm水平震荡仪洗涤pvdf膜三次，每次10分钟。

8.用加有2μL二抗的20mL抗体孵育液，常温60rpm水平震荡仪孵育pvdf膜2小时。

9.用10mL TBST，常温60rpm水平震荡仪洗涤pvdf膜三次，每次10分钟。

10.取化学发光底物试剂溶液A和溶液B各1mL，室温显色5分钟。

11.用滤纸将膜上的液体吸干，机器曝片。

结果见图3所示，阳性对照与自制重组IL-6均能与白介素6单抗发生特异性反应。

实施例1.6 TF-1细胞增殖法测定重组白介素6活性

方法：1、标准品及供试品溶液的制备：用基础培养基将自制重组白介素6溶解，分别稀释到每1mL含100ng，在同一块96孔细胞板上分别进行4倍系列稀释，共12个稀释度，每个稀释度做3个复孔，每孔分别留50uL，重复做2块板，以上操作在无菌条件下进行；

2、收取对数生长期TF-1细胞，1000rpm离心5min，细胞沉淀用RPMI1640清洗2次，重悬，计数，调整细胞浓度至4x10⁵/mL，50uL/孔加入已加有不同浓度重组白介素6的96孔板中培养48h后，加入MTT 20uL/孔，37℃放置4h后，加入酸性裂解液100uL/孔，吹打使其完全溶解或放置过夜溶解，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。

结果见图9所示，经多次活性验证，活性范围在0.1-0.2ng/mL。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种可溶性重组蛋白的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：

(1)构建目的蛋白表达载体：将目的蛋白编码基因序列插入表达质粒PET32上，构建获得目的蛋白表达载体；

(2)将步骤(1)中所得目的蛋白表达载体转化宿主菌，获得转化的宿主菌，并在表达条件下，培养转化的宿主菌，从而表达由目的蛋白、硫氧还蛋白和His标签标签组成的融合蛋白；

(3)通过优化表达条件实现融合蛋白可溶性表达，优化条件为：以异丙基硫代半乳糖苷为诱导物对宿主菌进行诱导表达，诱导浓度为0.002-0.08mMol/L，诱导温度为22-37℃，诱导表达时间为4-12小时；

(4)离心收集诱导后的宿主菌，超声破碎，收集上清液并采用Ni亲和层析法分离由目的蛋白、硫氧还蛋白和His标签组成的融合蛋白，收集200-400mM咪唑洗脱液，超滤浓缩并除去咪唑；

(5)将步骤(4)所得融合蛋白在适当的孵育条件下，用肠激酶进行切割，酶切液采用Ni亲和层析法分离，收集流穿液及PBS洗脱液超滤浓缩，获得重组目的蛋白；

(6)将获得重组蛋白用0.22μm滤膜过滤除菌，分装冻干保存，活性测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所用载体为PET32系列载体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述宿主菌为BL21或Rosetta系列工程菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述目的蛋白表达表达条件为IPTG诱导浓度为0.002-0.08mMol/L，IPTG诱导温度为22-37℃，IPTG诱导表达时间为4-12小时。

5.一种表达纯化目的蛋白的方法，所述方法具体包括如下步骤：

(1)将权利要求3构建的融合蛋白表达载体转化宿主系统，获得转化的宿主菌；

(2)将表达宿主菌在表达条件下培养，从而表达由目的蛋白、硫氧还蛋白和His标签组成的融合蛋白；

(3)去除不溶性物质并采用亲和层析法分离由目的蛋白、硫氧还蛋白和His标签组成的融合蛋白；

(4)将骤(3)所得融合蛋白在适当的条件下，用肠激酶酶切融合蛋白，将目的蛋白从融合蛋白中释放到溶液中；

(5)通过Ni亲和层析法将分离获得重组蛋白，超滤浓缩目的蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白纯化策略及方法还包括1-5步骤中的任一项及其组合。

7.如权利要求1-6任一权利要求所述的方法在表达纯化生物大分子目的蛋白中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述目的蛋白为基因重组药物产品，具体包括细胞因子、酶、抗菌肽、抗体或抗体片段。