CN102586313A - p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法及其在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，特别涉及p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备及应用。该p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法能够提高p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表达效率和生物活性，p75NTR-ED-Fc融合蛋白能够用于促进损伤中枢神经再生与功能恢复。

Description

p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法及其在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备及应用。

背景技术

中枢神经系统（Central nervous system, CNS）损伤与修复一直是神经科学研究的热点。发育神经生物学及大量移植修复实验证实成年哺乳动物CNS损伤后不仅可再生而且由神经元固有的特性（Intrinsic properties）和其所处的微环境（Environment cues）决定，与周围神经系统损伤后的成功再生相比，CNS再生失败的主要原因是由于损伤微环境中多种再生抑制分子，如Nogo-A、MAG (Myelin-associated glycoprotein)和OMgp（Oligodendrocyte-myelin glycoprotein）的存在。它们均能独立通过Nogo-66 受体（Nogo-66 receptor，NgR）及其下游可能的信号通路参与神经再生的抑制作用。NgR是一种GPI（Glycosyl phosphatidylinositol）锚定膜蛋白，本身无信号转导能力，其下游分子的活化需要其协同受体（Co-receptor）的参与。研究表明中枢神经神经元p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor, p75NTR）作为NgR的一个协同受体，可通过其细胞外域（Extracellular domain, ED）与NgR碳末端结合介导髓磷脂抑制物对轴突再生的抑制作用。目前虽然p75NTR抑制剂在体外可增强神经元突起的生长，但体内实验却仍未证实其能够促进损伤中枢神经元的轴突再生及功能恢复。

研究表明，体外移植p75NTR高表达的雪旺细胞（Schwann cells, SCs），嗅鞘细胞（Olfactory enshenthing cells, OECs），神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）等均可促进损伤脊髓的轴突再生和功能改善。尽管其作用机制目前尚不清楚，但它们有一个共同特点，即均高表达p75NTR。这些细胞表面高表达的p75NTR在移植于损伤脊髓后可能与再生环境中神经元的NgR-配体复合物发生相互作用，拮抗神经元的NgR信号通路，减少再生抑制分子的抑制效应，进而促进轴突的再生。但靠细胞培养移植治疗脊髓损伤，过程相对复杂，培养成本较高，可操作性不强，很难形成大规模生产。

目前重组蛋白的表达体系主要有真核表达体系和原核表达体系。真核表达体系最常用的为酵母表达体系和哺乳动物细胞表达体系。尽管真核表达体系可产生具有天然立体结构的分泌型蛋白，但真核表达体系也有其致命的缺点。如酵母表达体系糖链与哺乳动物加工不一致，培养上清中糖浓度较高，部分蛋白产物易降解，表达量不可控；再如哺乳动物细胞表达系统表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高，远不能满足未来药物开发的需要。原核表达体系中最常用的为大肠杆菌（Escherichia coli），其遗传背景清楚，基因工程操作简便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高，更重要的是其生产成本低、周期短，适合大规模生产。尽管其表达的蛋白很难进行正确折叠，生物活性较低，但pET原核表达系统通过对载体及宿主的改进，该状况已有较大改观。

发明内容

本发明的目的是提供一种p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法，以提高p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表达效率和生物活性。

本发明的另一目的是提供p75NTR-ED-Fc融合蛋白的新用途，具体讲是提供p75NTR-ED-Fc融合蛋白在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用，以促进损伤中枢神经再生与功能恢复。

本发明所述p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法由以下步骤实现：

（1）p75NTR-ED-Fc原核表达载体的构建与鉴定

以真核表达载体pcDNA-p75NTR-ED-Fc质粒为模板，根据Genebank中编号为NM_002507.1的p75NTR核苷酸序列及编号为XM_002348257.1的IgG的Fc段核苷酸序列分别设计特异的p75NTR正向引物和半特异的p75NTR/Fc反向引物，并在引物两端分别引入Kpn I、Xho I酶切位点及相应的保护碱基，经PCR扩增得到p75NTR-ED-Fc片段，引物序列如下：

Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'

Kpn I酶切位点

Reverse primer: 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3'

                  Xho I酶切位点

PCR扩增获得的p75NTR-ED-Fc片段，经Kpn I和Xho I双酶切后回收纯化并将其克隆于同样双酶切的pET32a+表达载体中，最终获得含硫氧还蛋白及His标签的pET-p75NTR-ED-Fc原核表达载体，对获得的pET-p75NTR-ED-Fc重组表达质粒进行PCR、酶切和测序鉴定验证其插入序列的准确性；

（2）Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒pET-p75NTR-ED-Fc转化至E.coli BL-21 pLys感受态细胞中，挑选白色克隆于LB培养基中，35～39℃，220～280rpm振荡培养约4～7小时，在OD₆₀₀达到0.5～1.0时加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mmol/L，继续诱导表达12～20小时，高速冷冻离心机离心收集培养好的菌体后重悬于Tris-HCl缓冲液中，然后用超声破菌，离心，SDS-PAGE电泳初步检测菌体上清及沉淀中蛋白的表达情况；

（3）Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化

取步骤（2）所得上清，利用His-tag亲和层析柱纯化破菌上清中的目标融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc，将该纯化后的目标融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc通过脱盐柱除去溶液中的咪唑和NaCl；

（4）酶切除去Trx

在纯化后的融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc溶液中加入重组牛肠激酶，酶切除去Trx，获得p75NTR-ED-Fc融合蛋白；

（5）p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化

利用His-tag亲和层析柱对酶切后的融合蛋白p75NTR-ED-Fc进行纯化，得到含有切去融合标签Trx的融合蛋白p75NTR-ED-Fc，利用阴离子交换层析柱对所得融合蛋白p75NTR-ED-Fc进一步纯化，并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，将纯化后的融合蛋白采用透析缓冲液透析到保存缓冲液中，获得最终蛋白产品。

本发明所述制备方法利用大肠杆菌pET32a+表达体系采用基因工程方法构建外源融合蛋白p75NTR-ED-Fc 与原核多肽硫氧还蛋白（Trx）及His标签（Tag）的融合蛋白，不仅具有上述原核表达体系的优点，而且易于纯化，大大提高了表达蛋白的生物活性。另外，本发明利用人p75NTR-ED-Fc融合蛋白拮抗NgR信号达到促进神经损伤后再生的目的具有明显优势：受体-Fc (Fragment cristallizable) 融合蛋白已被证实是除了抗体药物外，清除体内多余配体分子的又一有效手段，且与抗体药物相比，不必进行繁琐的抗体筛选和人源化过程；受体结构域在融合蛋白中执行结合配体的功能，而Fc 部分可有多种作用，如可使用通用的标记二抗进行检测，可通过与protein A 的结合而使用亲和层析方便地纯化，更重要的是可大大延长药物在体内的半衰期。除上述优势外，p75NTR-ED与Fc结合还可提高p75NTR-ED的浓度并使其固定，从而模拟SCs、OECs等细胞的p75NTR定位，有利于充分提高其生物学功能。

为观察重组p75NTR-ED-Fc融合蛋白在中枢神经损伤修复过程中对抗NgR信号对神经再生及功能恢复的影响，分别采用体外和体内实验检测该重组蛋白对神经元突起生长的促进效应及对损伤脊髓的修复作用。

附图说明

图1A是重组质粒的PCR鉴定结果图，其中M为DNA Marker DL 2000，1、2分别为克隆1、2；

图1B是重组质粒pET-p75NTR-ED-Fc酶切鉴定结果图，其中1: pET-32a+ Kpn I+Xho I双酶切，2: 重组pET-p75NTR-ED-Fc Kpn I+Xho I双酶切，M: Wide Range DNA Marker（500-15000），3: pET-32a+ Xho I单酶切，4: 重组pET-p75NTR-ED-Fc Xho I单酶切；

图2是重组p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表达和纯化的SDS-PAGE结果图，其中M：蛋白质标准，1：未经IPTG诱导的全菌裂解液，2：经IPTG诱导的全菌裂解液，3：经IPTG诱导的破菌上清，4：经IPTG诱导的菌体破菌沉淀，5～6：破菌上清His-tag柱穿流样（未结合到亲和柱的部分），7：破菌上清His-tag柱洗脱样（Trx-p75NTR-ED-Fc蛋白），8：酶切除去Trx纯化的重组p75NTR-ED-Fc蛋白；

图3是重组p75NTR-ED-Fc融合蛋白的Western Blot鉴定结果图，其中1-2：纯化的目标蛋白，3：未诱导的破菌上清；

图4A是重组p75NTR-ED-Fc可中和MAG对神经突起生长的抑制作用，在预先用MAG处理的培养液中培养大鼠新生鼠背根节神经元（Dorsal root ganglia, DRG），加入p75NTR-ED-Fc培养24h后与只加MAG组进行比较，标尺：100mm；

图4B是重组p75NTR-ED-Fc可中和MAG对神经突起生长的抑制作用，统计分析各组神经元平均突起长度图，其中数据表示为：均数±标准误（与MAG组相比，***，p<0.001）；

图5A是免疫荧光法检测不同处理神经元中NgR的表达，用兔抗NgR抗体免疫荧光检测结果显示图，标尺：50mm；

图5B是免疫荧光法检测不同处理神经元中NgR的表达，NgR表达强度的定量分析结果图（与MAG组相比，**，p<0.001）。

图6A是脊髓半横断模型行为学检测结果，BBB评分结果图（与单纯损伤(SCI)组相比，*，p<0.05；**，p<0.01）；

图6B是脊髓半横断模型行为学检测结果，足迹试验结果图（红色标记大鼠前掌，蓝色标记后掌，d表示后掌中心垂直间距）；

图6C是脊髓半横断模型行为学检测结果，足迹试验结果统计图（与SCI组相比，**，p<0.01）；

图6D是脊髓半横断模型的神经电生理学检测结果；

图7A是核黄（Nuclear yellow, NY）逆行示踪标记各组损伤部位头侧（距损伤部位中心上游约5mm处）脊髓冠状切片图，结果显示p75NTR-ED-Fc蛋白可促进脊髓损伤后轴突的再生，标尺：80mm；

图7B是核黄（Nuclear yellow, NY）逆行示踪结果显示p75NTR-ED-Fc蛋白可促进脊髓损伤后轴突的再生。以脊髓损伤部位头侧逆行标记的阳性神经元数目表示轴突的再生情况（与SCI组相比，***，p<0.0001）；

图8A是免疫荧光法检测损伤脊髓组织中NgR的表达，用兔抗NgR抗体免疫荧光检测结果显示图，标尺：80mm；

图8B是免疫荧光法检测损伤脊髓组织中NgR的表达，NgR表达强度的定量分析结果图（与SCI组相比，***，p<0.0001）。

具体实施方式

实施1：p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法由以下步骤实现：

（1）p75NTR-ED-Fc表达载体的构建及鉴定

为获得大量天然表达的p75NTR-ED-Fc融合蛋白，本发明以真核表达载体pcDNA-p75NTR-ED-Fc质粒（本实验室保存）为模板，根据Genebank中编号为NM_002507.1的p75NTR核苷酸序列及编号为XM_002348257.1的IgG的Fc段核苷酸序列分别设计特异的p75NTR正向引物和半特异的p75NTR/Fc反向引物，并在引物两端分别引入Kpn I、Xho I酶切位点及相应的保护碱基，经PCR扩增得到p75NTR-ED-Fc片段，引物序列如下：

Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'

KpnI酶切位点

Reverse primer: 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3'

                  Xho I酶切位点

按以下方法进行PCR扩增：

PCR反应体系：

PCR反应程序：

预变性：94℃，5分钟

主循环：94℃，20秒；55℃，20秒；72℃，1.5分钟

循环数：30

后延伸：72℃，5分钟

PCR扩增后将获得的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)鉴定，发现有一条分子量在1350bp的条带，用Omega公司的胶回收试剂盒回收该片段，操作按试剂盒说明进行。胶回收的目的片段p75NTR-ED-Fc经Kpn I和Xho I双酶切后回收纯化。同时用Kpn1和Xho1双酶切处理pET32a+质粒（Invitrogen），然后与酶切后回收的p75NTR-ED-Fc片段进行连接（4^oC，过夜），连接体系如下：

最终获得含硫氧还蛋白（Trx）及His标签（Tag）的pET-p75NTR-ED-Fc原核表达载体。然后进行PCR、酶切和测序鉴定验证构建载体的正确性。PCR及酶切鉴定结果分别见图1A、图1B。

（2）Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的诱导表达

将上述构建并鉴定正确的pET-p75NTR-ED-Fc表达质粒转化到E.coli BL-21 pLys感受态细胞中，挑选白色克隆于LB培养基中，35～39℃，220～280rpm振荡培养约，4～6小时，在OD₆₀₀达到0.5～1.0时加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mmol/L，继续诱导表达12～20小时，高速冷冻离心机离心收集培养好的菌体后重悬于Tris-HCl缓冲液中，然后用超声破菌，15000rpm离心20min，SDS-PAGE电泳初步检测菌体上清及沉淀中蛋白的表达情况，结果表明目标融合蛋白在破菌上清和沉淀中均有表达（图2）。

（3）Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化

考虑到上清蛋白具有生物学活性的可能性更大，因此本发明仅对上清中的融合蛋白进行了纯化。取步骤（2）所得上清，利用His-tag亲和层析柱Chelating Sepharose Fast Flow纯化破菌上清中的目标蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc。具体方法：用5～10倍柱体积的缓冲液A（上样及平衡缓冲液50mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH 8.0）平衡柱子，然后上样。再用10%缓冲液B（洗脱缓冲液50mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 0.5M咪唑, pH 8.0）预洗脱，去除杂蛋白。最后用100%缓冲液B洗脱，收集目标组分，即为目标蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc。将His-tag亲和层析柱纯化后的目标融合蛋白通过脱盐柱Superdex G-25 Fine 除去溶液中的咪唑和NaCl。具体方法：用5～10倍柱体积的缓冲液C（上样及平衡缓冲液50mM Tris-HCl, pH 8.0）平衡柱子，然后上样，直接用缓冲液C洗脱，收集目标组分。

（4）酶切除去Trx

在纯化后的融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc溶液中加入重组牛肠激酶，37℃水浴酶切1～3小时或4℃酶切过夜除去Trx，获得p75NTR-ED-Fc融合蛋白。

（5）p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化

再次利用His-tag亲和层析柱对酶切后的融合蛋白p75NTR-ED-Fc进行纯化。用5～10倍柱体积的缓冲液A平衡柱子，然后上样，用缓冲液B洗脱，收集穿透液（不挂柱的部分），该部分含有切去融合标签Trx的融合蛋白p75NTR-ED-Fc。

利用阴离子交换层析柱Q Sepharose High Performance对所得融合蛋白p75NTR-ED-Fc进一步纯化。具体方法：用5～10倍柱体积的缓冲液C平衡柱子，然后上样。再用0～100%缓冲液D（洗脱缓冲液50mM Tris-HCl, 1M NaCl, pH 8.0）梯度洗脱，收集目标组分并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果表明获得的融合蛋白纯度大于95%，分子量约50kD，与理论值一致，且能够被兔抗NGFRp75多克隆抗体特异性识别（图2，3）。

将纯化后的融合蛋白采用透析缓冲液E（50mM Tris-HCl, 10%甘油, pH 8.0）透析到保存缓冲液中，获得最终的蛋白产品。

实施例2：体外观察p75NTR-ED-Fc对抗NgR信号对神经元突起生长的促进效应

常规方法分离培养新生SD大鼠背根节（Dorsal root ganglia, DRG）神经元，细胞计数后以10⁶个/ml细胞密度接种于多聚赖氨酸包被的24孔培养板中。预先用PBS将MAG、p75NTR-ED-Fc融合蛋白和牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）浓度调至100ng/ml。待上述培养的DRG神经元贴壁后换液，并随机分为3组，每组重复2次。第一组：仅加入1ml MAG；第二组：加入MAG与p75NTR-ED-Fc融合蛋白各1ml；第三组：正常对照，仅加入1ml BSA。上述各组细胞在培养24h后用4%多聚甲醛固定，采用Image-Pro Plus 5.0软件测量培养24h后的突起长度，进行干预前后的突起生长分析（neurite outgrowth assay）。为减少误差，每次实验在200倍倒置显微镜下随机选取10个视野进行测量，实验重复3次，每次复孔检测，取平均值进行统计分析。同时为进一步明确该融合蛋白是否通过抑制NgR信号促进神经突生长，本发明采用免疫荧光法检测干预前后的NgR表达情况。

结果表明，p75NTR-ED-Fc融合蛋白在一定程度上可中和MAG对神经元突起生长的抑制作用，促进神经突生长（图4A，图4B），对神经元NgR的表达有明显的抑制作用（图5A，图5B）。

实施例3：在体检测p75NTR-ED-Fc对损伤脊髓的修复作用

成年SD大鼠的脊髓背柱用眼科剪横切（1mm深），建立大鼠脊髓半横切损伤模型，损伤后，立即在横断点两侧（各2mm）注射 p75NTR-ED-Fc融合蛋白（共25μl，0.4mg/ml），以单纯脊髓损伤（Spinal cord injury, SCI）作阴性对照，同时以假手术及正常大鼠为阳性对照，分别于1、2、4、6w后逆行示踪标记技术检测轴突的再生情况，详细操作过程如下：脊髓损伤后，各组动物在灌注前16～18 h，在坐骨神经注射核黄（Nuclear yellow, NY），以脊髓损伤部位头侧逆行标记的阳性神经元数目表示轴突的再生情况。同时采用行为学（BBB评分、足迹试验）及神经电生理方法检测伤侧后肢功能的恢复情况，并采用免疫荧光法检测NgR在损伤和治疗组脊髓中的表达情况。

结果表明，p75NTR-ED-Fc融合蛋白既可促进脊髓损伤后轴突的再生，又对神经元具有明显的保护作用，还可促进脊髓损伤后功能的恢复（图6A-D，表1，表2）。蛋白治疗后损伤脊髓轴突的再生促进了轴浆的运输，表现为损伤部位头侧NY阳性标记神经元数量与单纯损伤组相比显著增强（图7A，图7B），且该融合蛋白对损伤脊髓NgR蛋白的表达有明显的抑制作用（图8A，图8B）。

**P<0.01，与单纯损伤组比较

*P<0.05，**P<0.01，与单纯损伤组比较。

p75NTR-ED-Fc基因序列表

<110>  第三军医大学大坪医院野战外科研究所

<120>  p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法及其在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用

<130>  /

<160>  /

<170>  Patent In version 3.1

<210>  1

<211>  1350

<212>  RNA

<213>  智人（Homo sapiens）

<400>  1

 1 atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt

61 ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta cacacacagc

121 ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg tggagccaac

181 cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt gagcgcgacc

 241 gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc gccgtgcgtg

301 gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga gacgactggg

361 cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc ctgccaggac

421 aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac

481 gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct ccgcgagtgc

541 acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac acggtccaca

601 cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagag

661 cgaggatccg acaaaactca cacatgccca ctgtgcccag cacctgaact cctgggggga

721 ccgtcagcct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct

781 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg

841 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac

901 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag

961 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc

1021 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag

1081 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc

1141 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg

1201 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg

1261 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg

1321 cagaagagcc tctccctgtc cccggggtaa

Claims (2)

1.p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）p75NTR-ED-Fc原核表达载体的构建与鉴定

以真核表达载体pcDNA-p75NTR-ED-Fc质粒为模板，根据Genebank中编号为NM_002507.1的p75NTR核苷酸序列及编号为XM_002348257.1的IgG的Fc段核苷酸序列分别设计特异的p75NTR正向引物和半特异的p75NTR/Fc反向引物，并在引物两端分别引入Kpn I、Xho I酶切位点及相应的保护碱基，经PCR扩增得到p75NTR-ED-Fc片段，引物序列如下：

Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'

Kpn I酶切位点

Reverse primer: 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3'

                  Xho I酶切位点

PCR扩增获得的p75NTR-ED-Fc片段，经Kpn I和Xho I双酶切后回收纯化并将其克隆于同样双酶切的pET32a+表达载体中，最终获得含硫氧还蛋白及His标签的pET-p75NTR-ED-Fc原核表达载体，对获得的pET-p75NTR-ED-Fc重组表达质粒进行PCR、酶切和测序鉴定验证其插入序列的准确性；

（2）Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒pET-p75NTR-ED-Fc转化至E.coli BL-21 pLys感受态细胞中，挑选白色克隆于LB培养基中，35～39℃，220～280rpm振荡培养约4～7小时，在OD₆₀₀达到0.5～1.0时加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mmol/L，继续诱导表达12～20小时，高速冷冻离心机离心收集培养好的菌体后重悬于Tris-HCl缓冲液中，然后用超声破菌，离心，SDS-PAGE电泳初步检测菌体上清及沉淀中蛋白的表达情况；

（3）Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化

取步骤（2）所得上清，利用His-tag亲和层析柱纯化破菌上清中的目标融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc，将该纯化后的目标融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc通过脱盐柱除去溶液中的咪唑和NaCl；

（4）酶切除去Trx

在纯化后的融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc溶液中加入重组牛肠激酶，酶切除去Trx，获得p75NTR-ED-Fc融合蛋白；

（5）p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化

利用His-tag亲和层析柱对酶切后的融合蛋白p75NTR-ED-Fc进行纯化，得到含有切去融合标签Trx的融合蛋白p75NTR-ED-Fc，利用阴离子交换层析柱对所得融合蛋白p75NTR-ED-Fc进一步纯化，并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，将纯化后的融合蛋白采用透析缓冲液透析到保存缓冲液中，获得最终蛋白产品。

2.p75NTR-ED-Fc融合蛋白在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用。

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