CN109999178A - p75ECD在制备用于治疗心肌梗死的药物中的应用 - Google Patents

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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

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Abstract

本发明属于医药领域，公开了p75ECD在制备用于治疗心肌梗死的药物中的应用，尤其是涉及心肌梗死/心肌再灌注损伤的预防和/或治疗方法，所述方法包括向需要的对象于再灌注之前给药有效量的p75细胞外结构域(p75ECD)。

Description

p75ECD在制备用于治疗心肌梗死的药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及神经营养因子受体p75的细胞外结构域的用途，特别是用于心肌梗死/心肌再灌注损伤的预防和/或治疗方法。
背景技术
急性心肌梗死发生后，采取溶栓或者经皮冠脉介入等方法实施再灌注缩小心肌梗死面积是改善临床预后的最有效策略。然而，临床上心肌梗死的死亡率仍接近10％，慢性心力衰竭发生率则高达25％。除了缺血本身造成过多心肌细胞坏死外，缺血心肌在恢复血液灌注后，可能引起超微结构、功能、代谢及电生理方面发生进一步损伤，这是在缺血损伤基础上再次引起的损伤，称为心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)，也是影响再灌注治疗效果的重要因素。
目前，还没有真正有效的心肌保护药物或措施，这与心肌缺血及再灌注损伤复杂的病理生理过程有关。MIRI涉及氧化应激、钙超载、炎症反应等诸多机制。尽管动物实验表明，通过药物及缺血预处理和后处理等机械性措施，激活促细胞生存激酶，阻断终末效应器，可以保护心脏。但是，迄今基于上述机制假说的临床实践均未能取得成功：再灌注时使用药物减轻氧化应激、钙超载及炎症反应并未显示有意义的心脏保护作用，经静脉注射环孢霉素A阻断终末效应器，也未能减轻心肌损伤，缺血后处理的临床应用同样未能成功。
中国专利申请公布号CN106466479A公开了脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)用作治疗情感障碍的靶点，其中教导了proBDNF的受体p75NTR或片段p75ECD-Fc作为信号传递分子，也可用于治疗情感障碍，例如抑郁症和焦虑症等。
PCT/CN2016/077412公开了神经营养因子受体p75的细胞外结构域(p75ECD)或其功能性片段、变体、类似物或衍生物用于治疗和/或预防神经病症，例如脑淀粉样血管病(CAA)或tau蛋白病，以及用于诊断和/或预后阿尔茨海默病(AD)。该申请的内容并入本发明，引作参考。
现有技术虽已认识到p75ECD是一种神经保护因子，却未明确提及其可保护心肌。
发明概述
本发明将p75ECD或其功能性片段、变体、类似物或衍生物应用于治疗心肌梗死发生之后进行再灌注治疗所发生的心肌再灌注损伤，达到保护心肌的目的。
本发明涉及p75ECD或其功能性片段、变体、类似物或衍生物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗心肌梗死/心肌再灌注损伤。
根据本发明，p75ECD或其功能性片段、变体、类似物或衍生物是p75ECD或p75ECD-Fc融合体。
根据本发明，所述p75ECD-Fc融合体是重组肽。
根据本发明，所述重组p75ECD-Fc融合肽以0.1mg/kg对象体重至250mg/kg对象体重之间的剂量给药。
根据本发明，所述p75ECD具有由SEQ ID NO:1提供的氨基酸序列。
根据本发明，所述p75ECD-Fc具有由SEQ ID NO:2提供的氨基酸序列。
根据本发明，所述p75ECD通过静脉内、腹膜内、脑室内、鞘内或肌内注射来给药。
本发明采用如下方案：
1)采用开胸结扎左主冠状动脉(冠脉)法构建大鼠心肌梗死及再灌注损伤模型；
2)具体地，结扎冠脉心肌缺血45分钟，松开冠脉再灌注24小时或28天；
3)干预方法：再灌注前5分钟，经尾静脉注射p75ECD；
4)检测指标：
再灌注24小时取心脏测心肌梗死面积，再灌注28天超声心动图评估心脏功能。
其中，模型对照组使用同等剂量生理盐水。
结扎左主冠脉方法制备在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型
取200～250g雄性清洁级SD大鼠，无创小圆针8-0丝线在动脉圆锥与左心耳之间的左主冠脉处进针，聚乙烯管推管压迫造成心肌缺血，松开丝线恢复冠脉血流(再灌注)。再灌注24小时，重新结扎左主冠脉，经颈外静脉注射0.1％伊文思蓝及10％KCl处死大鼠，速取心脏，用于三苯基氯化四氮唑(TTC)法测定心肌梗死面积。
心肌缺血及梗死面积测定
取再灌注24小时的心脏，垂直心室长轴，去除心尖部分，切取2～3片薄切片，置1％TTC溶液，37℃孵育15min。10％甲醛溶液固定24小时。数码相机拍摄朝心尖切面，蓝色为正常心肌，浅红色为缺血存活心肌，灰白色为坏死心肌。使用美国国立健康研究院ImageJ软件测定左室切面(LV)、缺血存活区及坏死区(AN)面积。缺血危险区(AAR)为缺血存活及坏死区面积之和，以AN/AAR表示梗死面积，以AAR/LV表示缺血危险区面积。
超声心动图评估心功能
取再灌注28天的大鼠，麻醉后取左侧卧位或仰卧位，使用10MHz电子相控阵换能器获取左室短轴乳头肌水平M型超声图像，测量左室收缩末内径(LVESd)及左室舒张末内径(LVEDd)，连续测量3个心动周期，取3次测量的平均值。左室短轴缩短率(LVFS)(％)＝(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100。按照Teichholz等提出的公式：V＝7.0×D3/(2.4+D)，V为容积，D为超声测量内径。左室舒张末容积(LVEDv)＝7.0×LVEDd3/(2.4+LVEDd)，左室收缩末容积(LVESv)＝7.0×LVESd3/(2.4+LVESd)。左室射血分数(LVEF)(％)＝(LVEDv-LVESv)/LVEDv×100。
本发明有益效果
1)本发明采用再灌注前静脉给药p75ECD，可以保护大鼠心肌，缩小心肌梗死面积；
2)本发明通过更长时间观察，证实p75ECD可以改善再灌注后大鼠心脏重构及功能。
附图简述
为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式。本发明包括但不限于这些附图。
图1显示不同剂量的p75ECD对大鼠缺血/再灌注心肌梗死面积的影响。
实施例
为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的优选方案进行描述。这些描述只是举例说明本发明所述的固体组合物的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。
实施例1：p75ECD缩小心肌梗死面积
将200-250g SD大鼠分为以下4组(n＝6)：模型对照组，p75ECD1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg组。于再灌注前5分钟给药，再灌注24小时，重新结扎左主冠脉，经颈外静脉注射0.1％伊文思蓝及10％KCl处死大鼠，速取心脏，垂直心室长轴，切取心脏，测定左室切面、缺血存活区及坏死区(AN)面积，缺血危险区(AAR)为缺血存活及坏死区面积之和，以AN/AAR表示梗死面积。结果4组心肌梗死面积分别为(45±4)％、(41±6)％、(35±6)％、(34±3)％。显示1mg/kg组无心肌保护作用，3mg/kg、9mg/kg组均为心肌保护作用，P值均为0.001，9mg/kg组较3mg/kg组无进一步优势。因此3mg/kg是最佳剂量(参见图1)。
实施例2：p75ECD改善心脏功能
进一步使用p75ECD心肌保护最佳剂量3mg/kg于再灌注28天采用超声心动图评估心脏重构和功能。检测时大鼠体重350-450g，分为以下3组(n＝5)：模型对照组，假手术组，p75ECD 3mg/kg组。结果代表心室重构的指标左室舒张末内径(LVEDd)在3组分别为(11.36±0.52)mm、(8.83±0.65)mm和(9.98±0.30)mm，3组左室收缩功能指标射血分数(LVEF)分别为(30±2)％、(62±8)％和(40±6)％，短轴缩短率(LVFS)分别为(16±1)％、(35±6)％和(22±3)％。3组间上述3个指标均存在统计学差异，P值均＜0.05，显示p75ECD3mg/kg组可以改善心肌梗死后心室重构及心脏功能。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对其进行若干改进和修饰，但这些改进和修饰也落入本发明权利要求请求保护的范围内。
序列表
<110> 苏州澳宗生物科技有限公司
<120> p75ECD在制备用于治疗心肌梗死的药物中的应用
<130> SPI177237-03
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 221
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys
1 5 10 15
Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln
20 25 30
Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val
35 40 45
Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln
50 55 60
Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys
85 90 95
Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys
100 105 110
Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu
115 120 125
Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr
130 135 140
Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu
145 150 155 160
Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser
165 170 175
Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln
180 185 190
Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly
195 200 205
Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn
210 215 220
<210> 2
<211> 396
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human p75ECD - linker - human Fc fusion
<400> 2
Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys
1 5 10 15
Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
20 25 30
Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val
35 40 45
Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
50 55 60
Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
100 105 110
Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp
115 120 125
Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp
130 135 140
Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys
145 150 155 160
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
165 170 175
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
180 185 190
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
195 200 205
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
210 215 220
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
225 230 235 240
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
245 250 255
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
260 265 270
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
275 280 285
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
290 295 300
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
305 310 315 320
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
325 330 335
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
340 345 350
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
355 360 365
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
370 375 380
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
385 390 395

Claims (7)

1.p75ECD或其功能性片段、变体、类似物或衍生物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗心肌梗死/心肌再灌注损伤。
2.权利要求1的应用，其中p75ECD或其功能性片段、变体、类似物或衍生物是p75ECD或p75ECD-Fc融合体。
3.权利要求2的应用，所述p75ECD-Fc融合体是重组肽。
4.权利要求2或3的应用，所述重组p75ECD-Fc融合肽以0.1mg/kg对象体重至250mg/kg对象体重之间的剂量给药。
5.权利要求1或2的应用，所述p75ECD具有由SEQ ID NO:1提供的氨基酸序列。
6.权利要求2或3的应用，所述p75ECD-Fc融合体具有由SEQ ID NO:2提供的氨基酸序列。
7.权利要求1或2的应用，所述p75ECD通过静脉内、腹膜内、脑室内、鞘内或肌内注射来给药。
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