CN109010797A - 一种Tat-SPK2肽防治心肌肥厚或心力衰竭的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗心肌肥厚或心力衰竭的Tat‑SPK2肽及其应用，所述Tat‑SPK2肽从N端到C端的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRGGSGDGLLYEV LNGLLDRPD。Tat‑SPK2肽能够应用在制备治疗人类心肌肥厚或心力衰竭药物中。Tat‑SPK2肽能够减轻异丙肾上腺素所致的小鼠心肌肥厚，Tat‑SPK2对心肌肥厚或心力衰竭具有防治作用，其心脏保护作用机制与自噬无关，而是通过上调SIRT3和Bcl‑2，下调BNIP3而产生。

Description

一种Tat-SPK2肽防治心肌肥厚或心力衰竭的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种Tat-SPK2肽防治心肌肥厚或心力衰竭的应用。

背景技术

心肌肥厚(cardiac hypertrophy)尤其是左室肥厚(Left ventricularhypertrophy, LVH)是心脏对慢性压力或容量超负荷产生的靶器官反应，见于高血压、瓣膜病、急性心肌梗塞和先天性心脏病等。我国现有高血压病患者约2.66亿，其中三分之一的高血压患者可伴发LVH。心肌肥厚是一种极其重要的心血管危险因素，能增加冠心病、中风或暂时缺血性心脏病发作等发生猝死的机率。更为重要的是，心肌肥厚也是慢性心力衰竭发生和发展的重要机制之一。

心力衰竭（heart failure）是指在正常的静脉回流情况下，由于心输出量绝对或相对减少，不能满足机体代谢需要而引起以循环障碍为主的综合征。临床上以肺循环和（或）体循环瘀血以及组织血液灌注不足为主要特征。心力衰竭的病因是多重而复杂的，主要包括心肌收缩和/或舒张功能障碍和心脏负荷长期过重及心室充盈受限。心力衰竭实际是心脏功能由代偿向失代偿转化的结果。心力衰竭尤其是慢性心力衰竭时，机体防止心输出量减少产生的代偿反应包括神经内分泌反射和心肌构型重建，心肌肥厚就是心脏构型重建的主要表现。心肌肥厚早期对心功能具有一定的代偿意义；然而，在心肌肥厚晚期，病理性心肌肥厚伴随着心肌细胞凋亡、心肌成纤维细胞增殖和心肌纤维化间质增生，促使心脏功能逐渐由代偿转化为失代偿，参与了心力衰竭的发生和发展。

目前心肌肥厚或心力衰竭的临床治疗药物相近，主要是抑制心力衰竭或心肌肥厚过程中神经内分泌的过度激活，纠正血流动力学紊乱。常用的治疗药物包括：1.血管紧张素转换酶抑制剂(ACEIs) 和血管紧张素Ⅱ受体I阻断剂(ARBs)：减少血管紧张素(AngⅡ)的生成和作用，舒张动静脉，降低心脏前后负荷，并可逆转心血管重塑和左心室肥厚；2.利尿剂：通过排除机体多余的水分，减少有效循环血量，减轻心脏前负荷，消除组织间隙水肿或肺水肿，螺内酯等醛固酮受体拮抗剂还可对抗醛固酮的心脏重塑作用；3. 钙拮抗剂：抑制胞外Ca²⁺内流，使胞内游离Ca²⁺浓度下降，舒张血管，降低血压，减轻前或（和）后负荷来改善心脏功能；4.β受体阻滞剂：阻断β受体，抑制交感神经系统活性及肾素释放，降低血压，消退或部分逆转心脏构型重建，上调β受体，恢复心脏对交感神经递质的敏感性。5. 正性肌力药物：如洋地黄类及非苷性正性肌力药（包括磷酸二酯酶抑制剂和β受体激动剂），直接加强心肌收缩力，增加心输出量，减少心脏收缩末期残余血量，降低前负荷，恢复心功能。上述1－4类药物缓解或逆转心肌肥厚，逐渐改善心功能，适用于心肌肥厚或慢性心力衰竭的长期治疗，但疗程较长，且对于急性心力衰竭疗效有限。而第5类正性肌力药物强心苷及非苷性正性肌力药，临床应用时不良反应多而严重，增加心律失常的风险，甚至增加心力衰竭的死亡率。综上所述，目前临床上仍需开发能够有效逆转心肌肥厚进展为心力衰竭，不良反应轻微的新型药物。

鞘氨醇激酶2（SPK2）是维持鞘脂类及其代谢产物之间动态平衡的关键酶之一，我们的前期研究表明SPK2 是一种含有BH3功能域的蛋白，通过其BH3功能域与Bcl-2蛋白发生直接相互作用，解离Beclin-1和Bcl-2，激活自噬，从而对神经细胞缺血缺氧损伤产生保护作用。由此，我们根据SPK2的BH3功能域设计了Tat-SPK2多肽，发现其亦可激活自噬对离体培养的神经细胞缺糖缺氧损伤模型和小鼠局灶性脑缺血模型具有神经保护作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种Tat-SPK2肽及其在制备防治心肌肥厚或心力衰竭药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种治疗心肌肥厚或心力衰竭的Tat-SPK2肽，所述Tat-SPK2肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRGGSGDGLLYEVLNGLLDRPD，如SEQID NO:1所示。

所述Tat-SPK2肽在制备防治心肌肥厚或心力衰竭药物中的应用。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

上述方案中，所述Tat-SPK2肽又可叫做Tat-鞘氨醇激酶2多肽，其中，所述Tat的氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，SPK2实质上是指取自SPK2 蛋白210~227位的氨基酸序列SGDGLLYEVLNGLLDRPD，Tat与SPK2之间由2个甘氨酸连接（GG）。所述Tat-SPK2肽可根据现有的多肽合成技术由生物技术合成公司来合成，在已知多肽的氨基酸序列的前提下，多肽的合成属于常见的现有技术。

现有技术中已知SPK2是一种含有BH3功能域的蛋白，通过其BH3功能域干扰Beclin-1和Bcl-2之间的相互作用来介导自噬。为此，发明人根据SPK2的BH3功能域设计并合成了Tat-SPK2多肽：Tat-SPK2肽 N端11个氨基酸由Tat穿膜序列组成，中间由2个甘氨酸连接，C端18个氨基酸序列为SPK2蛋白210~227位的BH3结构域的序列。以往的研究发现（中国专利CN106975071A），基于SPK2-BH3结构域设计的Tat-SPK2肽通过激活自噬产生对神经细胞缺血缺氧损伤的保护作用，可用于防治缺血性脑中风。发明人最近的研究发现，Tat-SPK2肽能够对心肌肥厚或心力衰竭产生治疗作用。神经体液因素是诱发心肌肥厚的重要原因，异丙肾上腺素(isoprenaline，ISO)是一种非选择性β-肾上腺素受体激动剂，小剂量长期给药能够增加心肌收缩力和耗氧量，并促进心肌细胞内环磷酸腺苷（cAMP）和糖原合成，增加总蛋白和非收缩蛋白合成，引起心肌肥厚，尤其是左心室肥厚，后期导致心力衰竭。在本项发明中，发明人采用小鼠皮下注射异丙肾上腺素致心肌肥厚模型，观察了Tat-SPK2肽对小鼠心肌肥厚模型的作用及机制。

研究发现，Tat-SPK2肽能有效缓解异丙肾上腺素所致小鼠心肌肥厚，能显著降低心脏重量指数，减轻心肌细胞肥大，防止心肌肥厚或心力衰竭。值得注意的是，发明人创新性地发现Tat-SPK2肽抑制心肌肥厚的作用机制与自噬无关，即与防治缺血性脑中风的机制完全不同，而是通过上调SIRT3和Bcl-2蛋白表达，降低BNIP3蛋白表达，抑制线粒体凋亡，从而产生心脏保护作用。

使用方法：对于治疗人类的心肌肥厚或心力衰竭来说，Tat-SPK2肽的给药方式可以为静脉注射或静脉滴注，剂量为40µg -1mg/kg/d（指每天，每千克人体重量的给药剂量为40µg~1mg）。

本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要体现在：

1. Tat-SPK2肽能够有效缓解异丙肾上腺素所致小鼠心肌肥厚，显著降低心脏重量指数，减轻心肌细胞肥大，能够防止心肌肥厚或心脏构型重建，防止心力衰竭的发生和发展。

2. Tat-SPK2肽抑制心肌肥厚的作用机制与自噬无关，即与防治缺血性脑中风的机制完全不同，而是通过上调SIRT3和Bcl-2蛋白表达，降低BNIP3蛋白表达，抑制线粒体凋亡，从而产生心脏保护作用。

3. 对于治疗人类的心肌肥厚、扩张性心肌病或心力衰竭来说，所使用的Tat-SPK2剂量较小，推测毒性较小，相对安全。

附图说明

附图1为Tat-SPK2防止异丙肾上腺素 (ISO)导致的小鼠心肌肥厚的效果图。异丙肾上腺素（ISO）皮下注射连续2周诱导心肌肥厚。 卡托普利（Cap）100mg / kg，Tat-SPK2 1,2和4mg / kg腹腔注射给药连续2周。 A.代表图片显示Tat-SPK2对ISO诱导的心肌肥大的影响。 B. 表示光镜观察的左心室病理改变，各组动物左心室苏木精和曙红（HE）染色反映心肌病理改变（×200倍）。 C. 表示Tat-SPK2对小鼠心脏重量指数的影响。称量全心脏和左心室的湿重，计算心重指数（HWI =心脏重 / 体重）和左心指数（LVWI = 左心重 / 体重）以评价心肌肥厚程度。图中为平均值±标准差。 每组 13-15只小鼠。 与对照组相比，** P <0.01，*** P <0.001。 与ISO组相比，#P <0.05，## P <0.01，### P <0.001。 S（L）= Tat-SPK2 1mg / kg; S（M）= Tat-SPK2 2mg / kg; S（H）= Tat-SPK2 4mg / kg。

附图2表示Tat-SPK2在小鼠异丙肾上腺素（ISO）诱导的心肌肥厚模型中上调心肌SIRT3和Bcl-2蛋白表达，下调BNIP3蛋白表达。小鼠皮下注射异丙肾上腺素连续2周诱导心肌肥厚， 腹腔注射Tat-SPK2 4mg / kg连续2周。 通过蛋白质印迹分析测定心肌中P62，SIRT3，BNIP3和Bcl-2的蛋白表达水平，GAPDH的水平作为上样内参。 A. 表示Tat-SPK2对P62蛋白表达无明显影响。 B. 表示Tat-SPK2上调SIRT3蛋白表达。 C. 表示Tat-SPK2上调Bcl-2蛋白表达。 D. 表示Tat-SPK2下调BNIP3蛋白表达。图中平均值±标准差（以对照组为100%），每组 3只小鼠。* P <0.05。

附图3 表示Tat-SPK2肽每日给药对小鼠没有明显毒性。用溶媒或Tat-SPK2 4mg /kg /天 小鼠连续腹腔注射2周，A图表示Tat-SPK2肽对小鼠体重无明显影响。B图表示肝，胰，肾组织HE染色显示组织形态（×100倍），每组3只小鼠。

具体实施方式

下面及实施例对本发明作进一步描述：

实施例：一种治疗心肌肥厚或心力衰竭的Tat-SPK2肽及其应用

所述Tat-SPK2肽从N端到C端的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRGGSGDGLLYEVLNGLLDRPD 。本实施例涉及Tat-SPK2肽在制备治疗人类心肌肥厚或心力衰竭药物中的应用。对于治疗人类的心肌肥厚或心力衰竭来说，Tat-SPK2肽的给药方式可以为静脉注射或静脉滴注，剂量为40µg ~1mg/kg/d（指每天，每千克人体重量的给药剂量为40µg~1mg）。

根据SPK2的BH3功能域设计并合成了Tat-SPK2多肽（中肽生化有限公司，纯度95%)：Tat-SPK2 N端11个氨基酸由Tat穿膜序列（PTD）组成，中间由2个甘氨酸连接，C端18个氨基酸序列为SPK2 210~227位的BH3结构域的序列。采用小鼠皮下注射异丙肾上腺素致心肌肥厚模型，研究了Tat-SPK2肽对小鼠心肌肥厚模型的作用及机制。

Tat-SPK2肽的氨基酸序列： YGRKKRRQRRRGGSGDGLLYEVLNGLLDRPD，如SEQ ID NO:1所示；

下面分别提供动物实验以及毒副作用的有关情况：

一、动物实验

动物：SPF级ICR小鼠(雄性，体重18~22g)由苏州大学医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002-2009，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037。动物饲养环境：室温22℃，湿度50-60%，通风良好，人工昼夜(12h/12h)，自由摄取食物和水。

ISO致小鼠心肌肥厚模型的建立：Tat-SPK2肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRGGSGDGLLYEVLNGLLDRPD。ICR小鼠随机分为6组：正常对照组、异丙肾上腺素组(ISO)、阳性对照组ISO+卡托普利(Cap)100mg/kg、ISO+Tat-SPK2 1mg/kg、ISO+Tat-SPK22mg/kg、ISO+ Tat-SPK2 4mg/kg。模型组及各给药组每日皮下注射ISO(上海麦克林生化科技有限公司)1 mg/kg 2次，间隔8h，正常对照组皮下注射等容积生理盐水。各给药组每天上午皮下注射ISO 4h后腹腔注射 Tat-SPK2或Cap (上海源叶生物科技有限公司)，正常对照组和模型组腹腔注射等容积生理盐水，连续14d。

小鼠心脏重量指数的测定：小鼠腹腔注射4%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后处死，开胸取心脏，用生理盐水洗净残血，滤纸吸干拍照，称量全心重(heart weight, HW)和左心室重(left ventricle weight，LVW)，计算心重指数(HWI＝HW/BW)和左心指数(LVWI＝LVW/BW)。部分左心室置4%中性甲醛固定，部分左心室置-80℃保存。

小鼠心肌组织HE染色：取心尖部左心室组织固定于4%中性甲醛溶液，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，切片，行HE 染色，光学显微镜下观察拍照。

小鼠心肌组织免疫印迹分析：左心室组织匀浆，以裂解缓冲液提取蛋白，裂解缓冲液组成：Tris-HCl（pH 7.4）10mM，NaCl 150mM，1％Triton X-100,1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，EDTA 5mM，蛋白酶抑制剂（Roche）。 BCA法测定蛋白质浓度。SDS-PAGE电泳， 40-60μg蛋白上样，转移至硝酸纤维素膜，蛋白印迹分析SIRT3(1:1000; CST, 5490S )，BNIP3（1：1000; CST, 3769），Bcl-2 (1:500; Santa Cruz, sc-7382), P62（1：1000; CST，5114S）水平。以GAPDH（1:10000; abcam, ab8245）为内参。

二、实验结果

1、Tat-SPK2减轻ISO所致小鼠心肌肥厚

ISO组小鼠心脏比正常组明显增大，Cap和Tat-SPK2组心脏有所缩小(附图1-A)。病理学检查显示：ISO组心肌组织经HE染色后心肌细胞肥大，细胞核深染，细胞间距变大。而Tat-SPK2 2和4mg/kg随剂量增大心肌细胞肥大现象有所减轻，表明Tat-SPK2能够减轻ISO所致的心肌细胞肥大等病理改变(附图1-B)。ISO处理2w后，心脏HWI和LVWI均显著增加（附图1-C），与ISO组相比，Cap和Tat-SPK2 1，2和4mg/kg显著降低 LVWI。上述数据表明，Tat-SPK2能够有效缓解ISO所致小鼠心肌肥厚。

2、Tat-SPK2对P62蛋白表达无影响，上调SIRT3和Bcl-2，下调BNIP3蛋白表达

应用蛋白印迹法检测了Tat-SPK2（4mg/kg）处理后心肌组织内蛋白表达的变化，结果显示，与正常组相比，ISO组和Tat-SPK2组小鼠心肌内的P62 蛋白表达均无明显改变（附图2-A），提示Tat-SPK2抑制心肌肥厚的作用机制与自噬无关，即与其防治缺血性脑中风的机制不同。另一方面，ISO组心肌组织内SIRT3和Bcl-2表达显著降低，而Tat-SPK2处理明显增加SIRT3和Bcl-2的表达（附图2-B,C）。Tat-SPK2处理亦显著降低心肌组织内BNIP3的表达（附图2-D）。上述数据表明，Tat-SPK2抑制心肌肥厚的作用机制是通过上调SIRT3和Bcl-2，抑制BNIP3蛋白表达。

三、实验结论

小鼠皮下注射ISO 14天后，心脏明显肥大，心脏重量指数（HWI和LVWI）显著增加，病理检测示心肌细胞肥大，胞核深染，表明心肌肥厚造模成功。应用Tat-SPK2腹腔注射14天后，Tat-SPK2 1，2和4mg/kg均显著降低LVWI，减轻心肌细胞肥大，表明Tat-SPK2能够防治心肌肥厚或心力衰竭。

以往的研究发现Tat-SPK2通过激活自噬产生对神经细胞缺血缺氧损伤的保护作用，因此首先采用蛋白印迹法检测了自噬底物蛋白P62的表达变化，然而，与正常组相比，ISO组和Tat-SPK2组小鼠心肌内的P62 蛋白表达均无明显改变，提示Tat-SPK2抑制心肌肥厚的作用机制与自噬无关，即与防治缺血性脑中风的机制完全不同。

Sirtuin-3（Sirt3）是线粒体基质中主要的脱乙酰酶，其在调节心脏功能中起重要作用；而BNIP3(类Bcl-2- 19 kDa相互蛋白 3)是诱导线粒体凋亡或坏死途径的重要因子，参与了病理性心室重塑、压力超负荷型心肌肥厚和心力衰竭的发生和发展；Bcl-2或Bcl-xL则能够与BNIP3结合阻断其二聚化，进而阻断BNIP3介导的线粒体凋亡。最近研究发现，Sirt3过度表达可以显著抑制阿霉素诱导的心肌肥厚，Sirt3通过抑制Bnip3介导的线粒体功能障碍，从而保护心脏功能，对抗心肌肥厚。有趣的是，发明人发现Tat-SPK2处理能够明显增加心肌组织内SIRT3和Bcl-2的蛋白表达，降低BNIP3的蛋白表达。这些结果强烈提示Tat-SPK2抗心肌肥厚的作用机制与自噬无关，而是通过上调SIRT3和Bcl-2，抑制BNIP3，抑制线粒体凋亡，从而产生心脏保护作用。

总之，上述结果表明，Tat-SPK2能够减轻异丙肾上腺素所致的小鼠心肌肥厚，Tat-SPK2对心肌肥厚或心力衰竭具有防治作用，其心脏保护作用机制与自噬无关，而是通过上调SIRT3和Bcl-2，抑制BNIP3而产生。

四、TAT-SPK2的安全性资料

本实验所用Tat-SPK2剂量较小，为1－4mg/kg腹腔注射, 发明人的实验结果显示，小鼠连续腹腔注射Tat-SPK2 4mg / kg /天 2周后，Tat-SPK2肽对小鼠体重（附图3-A），肝脏重量，脾脏重量和肾脏重量无明显影响，肝，胰，肾，睾丸，心脏和肺组织形态也无明显改变（附图3-B）。即使当Tat-SPK2腹腔注射40mg/kg（治疗剂量的10－40倍）时，动物亦未出现明显不良反应。因此，可以认为Tat-SPK2治疗心肌肥厚或心力衰竭毒性较小，比较安全。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州大学

<120> 一种Tat-SPK2肽防治心肌肥厚或心力衰竭的应用

<130>

<160> 1

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser Gly Asp Gly LeuLeu Tyr Glu Val Leu Asn Gly Leu Leu Asp Arg Pro Asp 31

Claims (2)

1.Tat-SPK2肽在制备治疗人类心肌肥厚或心力衰竭药物中的应用。

2. 根据权利要求书1所述的Tat-SPK2肽在制备治疗人类心肌肥厚或心力衰竭药物中的应用，其特征在于：所述Tat-SPK2肽从N端到C端的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRGGSGDGLLYEVLNGLLDRPD，如SEQ ID NO:1所示。