KR102497242B1 - 당뇨병, 고혈압 및 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

당뇨병, 고혈압 및 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1, 2, 3 또는 4 중 하나 이상에 상응하는 치료학적 유효량의 폴리펩티드, 펩티드 또는 유사체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 약학적으로 허용 가능한 희석제, 및/또는 약학적으로 허용 가능한 부형제 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 치료제는 경구용 제형, 비경구용 제형, 국소용 제형, 수성 제형, 고형 제형, 동결건조 제형 또는 경피형 제형으로서 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 당뇨병, 및/또는 고혈당증, 및/또는 고콜레스테롤혈증, 및/또는 고혈압, 및/또는 대사증후군 중 적어도 하나를 치료하기 위한 방법이 개시된다.

Description

당뇨병, 고혈압 및 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
진성 당뇨병(diabetes mellitus) 또는 간단하게 당뇨병(diabete)은 관리되지 않을 경우 고혈당증(hyperglycemia) 또는 고혈당(high blood sugar)을 초래한다. 시간이 지남에 따라, 고혈당증은 많은 인체의 시스템, 특히 신경 및 혈관에 심각한 손상을 초래한다. 당뇨병에는 여러 가지 변종이 있다. 제1형 당뇨병(Type 1 diabete)의 경우, 췌장은 인슐린을 거의 또는 전혀 생산하지 않는다. 제1형 당뇨병의 치료는 인슐린 주사를 필요로 한다. 당뇨병의 가장 일반적인 유형인 제2형 당뇨병(Type 2 diabete)의 경우, 췌장이 충분한 양의 인슐린을 생산하지 않거나, 생산된 인슐린이 세포 저항으로 인해 덜 효과적이거나, 또는 이 둘 모두이다. 세계보건기구는 제2형이 전 세계 당뇨병 사례의 90%를 대표한다고 규정하고 있다. 제2형 당뇨병의 치료는 약물 및 인슐린 요법뿐만 아니라, 건강한 식사 및 신체 활동을 포함한다.
당뇨병의 만성 고혈당증의 합병증은 내피 손상(endothelial damage), 증식성 망막증(proliferative retinopathy), 신경병증(neuropathy), 신장병증(nephropathy), 고혈압(hypertension) 및 허혈성 심질환(ischemic heart disease)을 포함한다. 당뇨병은 심장병, 뇌졸중, 신부전, 실명 및 사지 절단(limb amputation)의 주요 원인 중 하나이며, 이와 같이 당뇨병은 모든 산업 국가의 경제를 고갈시키고 있다.
제2형 당뇨병의 사례에서는 종종 약물학적 개입(intervention)이 치료를 위해 필요하다. 술포닐 우레아, 디펩티딜 펩티다아제 IV(DPP-IV) 억제형, 메글리티나이드, 비구아니드, 티아졸리디네디온 및 알파-글루코시다아제 억제형와 같은 제2형 당뇨병을 위한 많은 유형의 승인된 약제가 있다. 그러나 이들 약물은 배탈, 저당혈증, 체중 증가, 간 질환, 피부 발진, 두통 및 호흡기 감염을 포함하는 원치 않는 부작용을 초래한다. 또한, 이들 약제는 종종 보다 효과적이기 위해 병용 요법으로서 함께 사용된다. 하지만, 다수 약물의 사용은 원치 않는 부작용의 가능성을 증가시킨다. 제2형 당뇨병 환자의 거의 50%는 결국 인슐린의 투여가 필요하다.
인슐린 투여는 제1형 당뇨병에 대한 유일한 치료 옵션인 채로 남아 있다. 또한, 인슐린에 의한 제1형 당뇨병의 치료는 변화하는 생리적 조건 하에서 요구되는 정확한 인슐린 투여량을 결정하는 것의 어려움으로 인해 고혈당증 및 저당혈증의 일주기(daily cycle)에 의해 유도되는 장기적인 합병증을 피할 수 없다.
고혈압, 고콜레스테롤 및 고혈당증은 종종 두 유형의 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병에 걸린 개체에 존재한다. 고혈압, 고콜레스테롤 및 당뇨병의 조합은 심장 마비 또는 뇌졸중의 위험을 현저하게 증가시킨다. 현재, 이들 세 가지 질환(고혈압, 고콜레스테롤 및 당뇨병)을 치료하는데 사용되는 약물에는 여러 가지 부작용이 있다. 따라서, 현재 사용 가능한 약물에서 나타나는 부작용 없이, 혈당을 낮추고 또한 혈압 및 콜레스테롤을 조절하는 치료학적 조성물을 갖는 것이 유용할 수 있다. 이러한 조성물은 당뇨병과 함께 고혈압, 콜레스테롤의 치료에 유용할 것이다.
본 발명은 당뇨병, 뇌졸중, 말초 혈관 질병, 폐고혈압, 대사 증후군, 고콜레스테롤혈증 및 죽상경화증과 같은, 높은 혈압 및 높아진 혈당치(고혈당증)와 연관된 질병을 포함하는 임상적 질병을 치료하기 위한 신규한 약학적 조성물 및 방법에 관한 것이다.
예기치 않게도, 40s 리보솜 단백질 S2(ribosomal protein S2, RPS2)의 활성 영역에 상동인 서열에 상응하는 폴리펩티드가 혈당치의 감소, 인슐린 저항성의 감소, 간 포도당 생산의 감소, 글루카곤 레벨의 감소, 혈압(수축 및 이완 수치)의 감소 및 혈중 콜레스테롤 수준의 감소를 촉진하는 능력에 의해 입증되는 바와 같이 경구 및 정맥 내 투여를 위한 치료로서 유익함이 밝혀졌다.
본원에서는 RPS2 폴리펩티드, RPS2 펩티드 유사체 및/또는 이의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 방법 및 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, RPS2 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, RPS2 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, RPS2 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, RPS2 폴리펩티드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, RPS2 폴리펩티드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, RPS2 폴리펩티드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, RPS2 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, RPS2 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, RPS2 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
제1 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 40s 리보솜 단백질 S2(RPS2), 또는 이의 단편 또는 유사체를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 40s 리보솜 단백질 S2(RPS2) 또는 이의 단편으로 구성되는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 40s 리보솜 단백질 S2(RPS2)를 포함하거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 40s 리보솜 단백질 S2(RPS2) 단편을 포함하거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 40s 리보솜 단백질 S2(RPS2) 단편을 포함하거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 40s 리보솜 단백질 S2(RPS2) 단편을 포함하거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
일 구현예에서, RPS2 또는 이의 단편은 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구현예에서, RPS2는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구현예에서, RPS2 단편은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구현예에서, RPS2 단편은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구현예에서, RPS2 단편은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, RPS2 또는 이의 단편은 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, RPS2는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, RPS2 단편은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, RPS2 단편은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, RPS2 단편은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, RPS2 또는 이의 단편은 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일 구현예에서, RPS2는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일 구현예에서, RPS2 단편은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일 구현예에서, RPS2 단편은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일 구현예에서, RPS2 단편은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열로 구성된다.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 제형을 제공한다. 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드는 제1 양태에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드일 수 있다.
구현예에서, 제형은 경구용 약학적 제형이다. 구현예에서, 제형은 약학적 비경구용 제형이다. 구현예에서, 제형은 약학적 국소용 제형이다.
구현예에서, 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체(들)를 포함할 수 있다. 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제(들)를 포함할 수 있다. 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제(들)를 포함할 수 있다.
구현예에서, 제형은 수성(aqueous) 약학적 제형이다. 펩티드는 수용성 약학적 제형 내에 0.05 내지 5 ㎍/L의 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 0.08 내지 3 ㎍/L의 농도로 존재할 수 있거나, 0.1 내지 1 ㎍/L의 농도로 존재할 수 있다. 펩티드는 적어도 0.05 ㎍/L, 예를 들어 적어도 0.7, 0.1 또는 0.15 ㎍/L의 농도로 존재할 수 있다. 펩티드는 5 ㎍/L 이하, 예를 들어 4, 3 또는 2 ㎍/L 이하(예를 들어, 1 ㎍/L 이하)의 농도로 존재할 수 있다. 수성 약학적 제형은 완충액(buffer)을 포함할 수 있다. 완충액은 약 7 내지 약 8의 pH를 가질 수 있고, 예를 들어 완충액은 약 7.2 내지 약 7.6의 pH를 가질 수 있고, 예를 들어 완충액은 생리학적 pH(약 7.4의 pH, 예를 들어 7.3 내지 7.5의 pH)를 가질 수 있다. 완충액은 인산완충식염수(phosphate buffered saline)일 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 제형을 포함하는 약제를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 제1 양태의 적어도 하나의 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 제형은 제2 양태의 제형일 수 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 질병을 치료하기 위한 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 제형을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 제1 양태의 적어도 하나의 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 제형은 제2 양태의 제형일 수 있다. 질병은 제1형 및/또는 제2형 당뇨병, 고혈당증, 고콜레스테롤혈증, 고혈압 및 대사 증후군 중 적어도 하나일 수 있다. 질병은 제1형 및/또는 제2형 당뇨병일 수 있다. 질병은 고혈당증일 수 있다. 질병은 고콜레스테롤혈증일 수 있다. 질병은 고혈압일 수 있다. 질병은 대사 증후군일 수 있다.
제5 양태에서, 본 발명은 제1형 및/또는 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 제형을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 제1 양태의 적어도 하나의 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 제형은 제2 양태의 제형일 수 있다. 사용은 간 포도당 생산의 감소, 및/또는 콜레스테롤 수치의 감소, 및/또는 글루카곤 수치의 감소, 및/또는 혈압의 감소를 제공할 수 있다. 사용은 간 포도당 생성의 감소를 제공할 수 있다. 사용은 콜레스테롤 수치의 감소를 제공할 수 있다. 사용은 글루카곤 수치의 감소를 제공할 수 있다. 사용은 혈압의 감소를 제공할 수 있다.
제6 양태에서, 본 발명은 제1형 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 제1 양태의 적어도 하나의 폴리펩티드일 수 있다.
제7 양태에서, 본 발명은 고혈당증, 및/또는 고콜레스테롤혈증, 및/또는 고혈압, 및/또는 대사 증후군 중 적어도 하나의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 제1 양태의 적어도 하나의 폴리펩티드일 수 있다. 약제는 고혈당증을 치료할 수 있다. 약제는 고콜레스테롤혈증을 치료할 수 있다. 약제는 고혈압을 치료할 수 있다. 약제는 대사 증후군을 치료할 수 있다.
제8 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 제형을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 당뇨병, 및/또는 고혈당증, 및/또는 고콜레스테롤혈증, 및/또는 고혈압 중 적어도 하나를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 제1 양태의 적어도 하나의 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 제형은 제2 양태의 제형일 수 있다. 방법은 유효량의 상기 폴리펩티드 또는 상기 제형을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 당뇨병(예를 들어, 제1형 및/또는 제2형 당뇨병)을 치료할 수 있다. 방법은 고혈당증을 치료할 수 있다. 방법은 고콜레스테롤혈증을 치료할 수 있다. 방법은 고혈압을 치료할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1, 2, 3 또는 4 중 하나 이상에 상응하는 치료학적 유효량의 RPS2 폴리펩티드 또는 펩티드 유사체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 치료제는 경구용 제형, 비경구용 제형, 국소용 제형, 수성 제형, 고형 제형, 동결건조 제형 또는 경피(trans-dermal) 제형으로서 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하기 위해 제형화될 수 있다.
도 1은 메트포르민으로 처리하고/하거나 IMG-1을 정맥 내 투여(10 ㎍) 및 구강 투여(200 ㎍)한 당뇨병 동물(주커(Zucker) 당뇨병 랫트 동물 모델)에서 체중 간의 관계를 보여주며, 체중 증가가 동물 사이에 일관됨을 보여주는 그래프이다.
도 2는 IMG-1 제형(구강 및 정맥 내)로 당뇨병 동물을 치료하는 것이 대조군 및 메트포르민과 비교하여 정상화된 혈당치를 나타냄을 보여주는 그래프이다.
도 3은 IMG-1 제형(구강 및 정맥 내)로 당뇨병 동물을 치료하는 것이 대조군 및 메트포르민과 비교하여, 정상화된 혈압(수축 및 이완) 수치를 나타냄을 보여주는 그래프이다.
도 4는 IMG-1 제형(구강 및 정맥 내)로 당뇨병 동물을 치료하는 것이 대조군 및 메트포르민과 비교하여, HbA1c 수치의 감소를 초래함을 보여주는 막대그래프이다.
도 5는 IMG-1 제형(구강 및 정맥 내)로 당뇨병 동물을 치료하는 것이 인슐린 수치(mcU/mL)에 영향을 미치지 않음을 보여주는 막대그래프이다.
도 6은 IMG-1 제형(구강 및 정맥 내)로 당뇨병 동물을 치료하는 것이 대조군 및 메트포르민과 비교하여, 글루카곤 수치의 감소를 초래함을 보여주는 막대그래프이다.
도 7은 IMG-1(구강 및 정맥 내)이 투여된 당뇨병 동물로부터 측정된 평균 콜레스테롤 수치(mg/dL)가 비처리 대조군과 비교하여 더 낮음을 보여주는 막대그래프이다. 처리된 동물은 평균이 170 mg/dL 미만이었던 반면, 대조군은 224 mg/dL로 측정되었다.
도 8은 IMG-1 제형이 제1형 당뇨병 동물 모델에서 혈당치를 낮추는데 효과적이며, 대조군(처리되지 않음) 당뇨병 유발 동물과 비교하여 현저하게 감소하였음을 보여주는 막대그래프이다.
도 9는 스프래그 다우리(Sprague Dawley) 동물 모델에서 24시간의 기간에 걸친 혈청으로부터의 IMG-1 청소율(clearance)(pg/mL로 측정됨)을 보여주는 그래프이다. 도시된 결과는 BES17-02-1, 2, 3(세 가지 동물로 표시)으로 분류된다.
도 10은 IMG-1 제형로 처리된 스프래그 다우리 동물에서의 혈당치를 보여주는 그래프이다.
도 11은 1.0 ㎍ 내지 1000.0 ㎍ 범위의 용량으로 투여된 IMG-1 제형이 스프래그 다우리 랫트에서 크레아티닌 수치에 영향을 미치지 않음을 보여주는 그래프이다.
도 12는 1.0 ㎍내지 1000.0 ㎍ 범위의 용량으로 투여된 IMG-1 제형이 스프래그 다우리 랫트에서 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 수치에 영향을 미치지 않음을 보여주는 그래프이다.
도 13은 2 ㎍의 용량으로 (정맥 내) 투여된 IMG-1 제형이 포도당 주입률(mg/kg/m)을 기초로 대조군과 비교하여 당뇨병 유발 비만(Diabetic-Induced Obese, DIO) 마우스에서 인슐린 저항성을 감소시킴을 보여주는 막대그래프이다.
도 14는 2 ㎍의 용량으로 (정맥 내) 투여된 IMG-1 제형이 대조군과 비교하여 DIO 마우스에서 간 포도당 생산(hepatic glucose production, HGP)을 억제함을 보여주는 막대그래프이다.
도 15는 2 ㎍의 용량(정맥 내)의 IMG-1 제형이 DIO 마우스에서 전신 포도당 전환, 당분해 또는 글리코겐 합성에 영향을 미치지 않으며 대조군과 본질적으로 동일함을 보여주는 막대그래프이다.
도 16은 2 ㎍의 용량(정맥 내)의 IMG-1 제형이 골격근 또는 백색 지방질의 포도당 흡수에 영향을 미치지 않음을 보여주는 막대그래프이다.
도 17은 (IMG-1L 및 IMG-1S로 명명된) 절단된 RPS2 펩티드의 활성을 전장 RPS2(IMG-1)와 비교하여 처리하지 않은 군과 대조적으로 보여주는 막대그래프이다. 전장 단백질의 C-말단의 단편에 상응하는 IMG-1L의 제형은 IMG-1(전장)과 비교하여 시험관 내(in vitro)에서 유사한 활성을 나타낸 반면; (전장 단백질의 N-말단의 단편에 상응하는) IMG-1S의 제형은 내피세포를 이용하는 MTT 분석법으로부터의 광학 밀도(Optical Density)에 의해 측정된 바와 같이 활성을 나타내지 않는 것으로 나타났다.
하기의 상세한 설명은 당업계의 기술자에게 본 발명을 실시하는데 있어 도움을 주기 위해 제공되었지만, 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의해서 본원에 개시된 구현예의 변형 및 변경이 이루어질 수 있으므로 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 본 출원에서 인용된 모든 공보 및 기타 참조는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
정의
하기의 용어는 본 발명의 상이한 양태를 설명하기 위해 본 개시에서 사용된다. 이들 용어는 설명을 목적으로 사용될 뿐이며, 본 발명의 임의의 양태에 대한 범위를 한정하려는 의도가 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "활성 성분(active ingredient)", "활성 화합물(active compound)", "활성 성분(active component)" 및/또는 "활성제(active agent)"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 서열번호 1; 또는 서열번호 2; 또는 서열번호 3; 또는 서열번호 4; 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 펩티드 단편 또는 이의 유사체를 지칭할 수 있다. 활성 성분/화합물을 포함하는 본 발명의 제형은 활성 화합물의 임의의 특정한 투여량 또는 농도를 내포하지 않으면서 "IMG-1" 제형을 통칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "유효량(effective amount)"은 대상체에 투여될 때 혈당치를 200 mg/dl 미만으로 낮추고, 콜레스테롤을 200 mg/dl 미만으로 낮추고/거나 혈압을 140/90 mmHg 미만으로 낮추는데 효과적인 활성 성분/화합물의 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "약학적 제형(pharmaceutical formulation)", "약학적 조성물(pharmaceutical composition)", "제형(formulation)" 또는 "조성물(composition)"은 인간 또는 기타 동물과 같은 포유류에 직접 또는 재구성(reconstitution) 후 투여하기에 적합하도록 제조된 활성 화합물의 양을 함유하는 액체(수성, 젤 또는 연고) 또는 고체 형태를 (상호 교환적으로) 지칭한다. 필요한 경우, 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 첨가제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세제/계면활성제(예를 들어, PEG, 트윈(20, 80 등), 플루로닉(Pluronic)), 부형제, 산화방지제(예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌), 착색제, 착향제, 보존제, 안정화제, 완충액, 킬레이팅제(예를 들어, EDTA), 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 유동성 촉진제 및 교정제(corrigent)가 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 본원에 기재된 RPS2 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 유사체와 함께 기타 활성 성분을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료" 및 본원에 사용된 다른 문법적 등가물은 질병 또는 질환 증상을 완화(alleviating), 약화(abating) 또는 개선(ameliorating)하는 것, 추가적인 증상을 예방하는 것, 증상의 기저 대사 원인을 개선 또는 예방하는 것, 질병 또는 질환을 억제하는 것, 예를 들어 질병 또는 질환의 발병을 저지하는 것, 질병 또는 질환을 완화하는 것, 질병 또는 질환의 퇴행(regression)을 유발하는 것, 질병 또는 질환에 의해 유발된 질환을 완화하는 것, 또는 질병 또는 질환의 증상을 중지시키는 것, 및 예방을 포함한다. 용어는 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 달성하는 것을 추가로 포함한다. 치료적 이점은 치료중인 기저 질환의 근절(eradication) 또는 개선을 의미한다. 또한, 치료적 이점은 기저 질환과 연관된 생리학적 증상 중 하나 이상을 근절 또는 개선함으로써 달성되어, 환자가 기저 질환에 계속 시달리고 있음에도 불구하고 환자에게서 개선이 관찰된다. 예방적 이점의 경우, 조성물은 이 질병의 진단이 이루어지지 않을 수 있다 하더라도, 특정 질병이 발병할 위험이 있는 환자에게 또는 질병의 생리학적 증상 중 하나 이상을 보고하는 환자에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 당뇨병 또는 고혈압과 같은 질환을 치료하기 위한 "치료학적 유효량"은 당뇨병에서의 혈당치 감소 또는 고혈압에서의 혈압 감소 또는 고중성지질혈증 또는 고콜레스테롤혈증에서의 콜레스테롤 감소와 같은, 환자 또는 환자 집단에서 임상적으로 관련된 종말점(clinically-relevant end-point)을 달성할 수 있는 활성 화합물의 양이다. 비제한적인 예로서, IMG-1 조성물의 유효량의 투여는 (당뇨병 동물 모델에서) 200 mg/dL 미만으로 혈당을 낮추고; 140/90 mmHg 미만으로 혈압을 낮추며; 200 mg/dL 미만으로 총 콜레스테롤을 낮추는 것으로 동물 연구에서 나타났다.
본 발명은 대상체에서 하나 이상의 질병을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하며, 질병은 당뇨병(제1형 및/또는 제2형), 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 혈관병 또는 대사 증후군 중 하나 이상을 포함한다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 중 하나 이상과 함께 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 이의 활성 영역 중 하나 이상에 상응하는 정제 또는 합성의 RPS2 폴리펩티드 또는 펩티드 유사체를 포함한다. 약학적 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 경구용, 비경구용 또는 피부/국소용 투여를 위해 제형화될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 정제 또는 합성의 RPS2 펩티드, 이의 유사체 또는 활성 영역, 인산완충식염수(PBS)와 같은 완충액을 포함하는 수성 약학적 제형을 제공하며, 제형은 정상적인 생리학적 범위(약 7.4) 내의 pH를 갖고, RPS2 폴리펩티드 또는 펩티드 유사체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4 중 하나 이상에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 고혈당증, 고혈압 및/또는 고콜레스테롤혈증을 포함하는 하나 이상의 질환의 발병(onset)을 예방, 지연시키거나 중증도를 감소시키는 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 단백질 발현용 세포를 성장시키기 위한 배지 및 단백질 발현에 최적화된 세포 배양 생산 배지를 포함하는 세포 배양물, 특히 효모, 세균 및 포유류 세포 배양물 내에서의 단백질 발현을 개선하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 예시적이고 포괄적이지 않은 것으로 의도되는 실시예 및 실험 결과를 통해 설명되며, 이에 국한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
40s RPS2 펩티드 및 아미노산 서열(들)
놀랍게도, 절단된(truncated) 단편을 포함하는 정제, 분리된 40s 리보솜 단백질S2(RPS2)는 대상체에 투여될 때 혈당치를 감소시키고; 혈당치를 정상화시키고; 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추고; 혈압 수치를 감소 및 정상화시키고; 헤모글로빈 A1c 수치를 감소시키고; 글루카곤 수치를 감소시키며; 인슐린 저항성을 감소시키는 능력을 포함하는 치료적 이점을 나타냄이 밝혀졌다. 참조로서, 40s RPS2는 리보솜 단백질의 S5P 패밀리에 속하는 단백질이다. 인간에 대하여, RPS2 유전자는 40S 서브유닛의 구성요소이자 세포질 내에 위치하는 리보솜 단백질을 암호화한다.
RPS2 아미노산 서열은 전형적인 핵 위치화 신호(nuclear localization signal)를 함유하지 않는다. 결실 돌연변이체 분석 및 rpS2-β-갈락토시다아제 키메라 단백질을 이용하여, RPS2 내 핵 표적 도메인의 추정 동일성(putative identify)을 결정하였다. 72-75개 아미노산을 포함하는 중앙 도메인은 키메라 β-갈락토시다아제를 핵에 표적화시키는 데 필요하며 충분하다. 핵 표적화 도메인은 리보솜 단백질 또는 기타 핵 단백질에서 이미-특성화된(already-characterized) 핵 위치화 신호와 상당한 유사성을 공유하지 않는다.
전장 RPS2 아미노산 서열은 서열번호 1로 명명된 293개 아미노산 서열이고; 서열번호 1의 절단된 C-말단 단편은 159개 아미노산 단편이며 서열번호 2로 명명되고; 통상적이지 않은(unconventional) 핵 위치화 신호는 서열번호 1의 아미노산 161-235 사이에 위치한 75개 아미노산 단편이며 서열번호 3으로 명명되고; 서열번호 1의 아미노산 135-221 사이에 위치한 87개 아미노산 단편은 서열번호 4로 명명되며; 서열번호 1의 절단된 N-말단 단편은 134개 아미노산 단편이며 서열번호 5로 명명된다.
서열번호 1의 RPS2 폴리펩티드는 BLAST 데이터베이스(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)를 활용하여 수행된 서열 분석으로 비교할 때 모든 동물 사이에서 94-100% 상동이다. 서열번호 2의 159개 아미노산으로 구성되는 C-말단 영역은 동물계 문(animalia phylum)에 대하여 99-100% 상동이다. 서열번호 3에 상응하는 75개 아미노산 핵 위치화 서열은 모든 동물 및 세균 간에 99-100% 상동성을 공유한다. 동물/세균 단백질 서열은 평균 98-100% 상동인 반면, 식물과의 상동성은 77% 상동에 이를 만큼 낮을 수 있다.
본 발명의 RPS2 아미노산 서열(293개 아미노산)은 하기와 같으며, 서열번호 1로 명명된다.
Figure 112019056261026-pct00001
본 발명의 RPS2 C-말단 단편은
Figure 112019056261026-pct00002
18kDa의 159개 아미노산 단편이다. C-말단 단편은 하기와 같으며, 서열번호 2로 명명된다.
Figure 112022072447079-pct00025
본 발명의 75개 아미노산 핵 위치화 신호(서열번호 1의 아미노산 161-235 사이의 서열에 대응함)는 하기와 같으며, 서열번호 3으로 명명된다.
Figure 112019056261026-pct00004
서열번호 1의 아미노산 135-221 사이의 N-말단에 가까운 핵 위치화 신호의 일부에 상응하는 87개 아미노산 서열은 하기와 같으며, 서열번호 4로 명명된다.
Figure 112019056261026-pct00005
본 발명의 RPS2 N-말단 단편은
Figure 112019056261026-pct00006
13kDa의 단편이며, 서열번호 5로 명명된다.
Figure 112019056261026-pct00007
본 발명에서 아미노산 서열 내 함유된 아미노산은 당업계에 알려진 방법에 따라 번역 후(post-translationally) 변경될 수 있다. 예를 들어, 피로글루타민화(pyroglutamylation)에 의해 N-말단 글루타민(Gln) 잔기를 피로글루탐산(pGlu) 잔기로 변경하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 자연스럽게, 이러한 번역 후 변경된 아미노산은 아미노산 서열 내 및 본 발명의 범위 내에 포함된다.
RPS2의 정제 및 RPS2의 시험관 내(in vitro) 발현
인간 40S 리보솜 단백질 S2 및 다양한 펩티드 부분(portion)을 암호화하는 RPS2 유전자를 pMAL-5 벡터(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))로 서브클로닝하였다. RPS2 유전자를 정방향 프라이머(서열: atggcggatgacgccggtgc) 및 역방향 프라이머(서열: ctatgttgtagccacagctgg)를 이용하여 증폭시켰고, 생성된 PCR 단편을 인산화시키고 저융점(low melt) 아가로오스로부터 정제하였다. 생성된 서열을 pMAL-5 벡터로 라이게이션(ligation)하고, 라이게이션 및 배양 후에 100 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양하여 생체 내(in vivo) 단백질 생산을 위한 형질전환체를 생성하였다.
RPS2 단백질의 생체 내 생산
RPS2 형질전환체를 5 ml의 배양액(broth)에 접종하고, 2 x 108 세포/ml로 성장시켰다. 이 배양물을 사용하여 200 mL의 LB amp 0.2% 포도당을 A600의 약 0.5의 A600에 접종하였다. 그런 다음, 배양물을 ITPG(isopropylthio-β-galactoside)를 0.3 mM의 최종 농도로 첨가하여 유도하고, 30℃에서 추가로 4시간 동안 성장시켰다. 그런 다음, 세포를 원심분리하고 배양물 1리터당 25 ml의 컬럼 완충액에 재현탁시켰다. 동결-해동에 이어 20 게이지 바늘을 통과시켜 세포를 융해시켰다. 융해된 세포를 원심분리하고, 25 ml의 조(crude) 추출물 당 125 ml의 차가운 CB를 첨가하여 상청액을 희석하였다. 희석된 조 추출물을 15 ml의 아밀로오스 컬럼에 첨가하고, 12 컬럼 부피의 CB로 세척하였다. 단백질을 CB 및 말토오스(10 mM)로 용출하였다. 그 결과 생성된 용출액을 200 ㎍/ml로 희석된 1 μl의 Xa 인자와 함께 4시간 동안 실온에서 배양하였다. 융합 단백질 절단 혼합물을 pH 8.0에서 투석하고, 아밀라아제 컬럼을 완충액으로 세척하고, 융합 단백질 절단 혼합물을 컬럼에 로딩하였다. 통과액(flow-through)을 수집하고, 분리된 단백질의 양을 바이신코닌산(BSA) 분석법으로 결정하고, 단백질의 양을 ELISA를 통해 평가하였다.
생체 내 동물 연구를 위해, 컬럼 정제 후 용액 내 서열번호 1 에 상응하는 정제된 RPS2 단백질을 PBS로 (경구 또는 정맥 내 투여에 따라) 원하는 농도로 희석하였다. 이어서, 이후의 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시켜, 실시예에 기재된 바와 같이 동물 대상체에 투여하기 위해 제형을 여과-멸균하였다.
유사한 연구를 세균 RPS2에 대한 유전자에 대해서 수행하였고, 인간 RPS2와 비교하여 생체 내에서 유사한 결과를 얻었다. 대조군 동물 모델에서의 독성학 연구뿐만 아니라 당뇨병 동물 모델에서의 IMG-1 제형에 대한 시험을 포함하는, 분리된 RPS2 폴리펩티드 및 펩티드 단편의 치료제로서의 안정성 및 효능을 시험하기 위해 다양한 연구를 수행하였다. 수행된 연구 및 얻어진 결과는 첨부된 도면과 함께 본원에 실시예로서 제시된다.
실시예 1: 제2형 당뇨병 동물 모델
랫트의 주커 당뇨성 비만(Zucker Diabetic Fatty, ZDF) 균주는 널리 알려져 있으며, 일반적으로 고혈압 및 고콜레스테롤뿐만 아니라 비만과 연관된 제2형 당뇨병을 연구하는데 사용된다. ZDF 균주는 조기-발병 당뇨병의 근친 교배(inbred) 랫트 모델이며, 모든 fa/fa 수컷 랫트가 퓨리나(Purina) 5008(Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA, USA)의 특별식을 먹었을 때 10 내지 12주에 당뇨병이 발병한다. 표현형은 균질(homogeneous)하며, 이는 주로 균주가 유전적으로 근친 교배이며 특별식이 제공된다는 사실 때문이다.
주커 당뇨성 비만(ZDF) 랫트에게 퓨리나 5008(Charles River Laboratories International, Inc.)의 특별식을 먹여 체중을 증가시켰다. 연구 전에 동물의 혈당치를 평가하였고; 200 mg/dl을 초과하는 혈당치를 갖는 랫트만을 연구에 사용하였다. 동물을 비처리(n=7), 1일 1회 메트포르민 투여(200 mg/kg, n=7), 1일 1회 10 ㎍의 IMG-1 정맥 내 투여(IV, n=8) 및 1일 1회 200 ㎍의 IMG-1 경구 투여(PO, n=9)의 4개의 군으로 무작위로 나누었다. 동물에게 이 식이를 35일간 유지하면서, 1주일에 2회 체중을 측정하였다. 35일 후에 동물을 희생시켰다. 도 1은 30일의 기간 동안 측정된 그룹당 체중(g)의 분포를 보여준다.
아큐트렌드 플러스 시스템(Accutrend Plus System)을 이용한 실험을 통해 ZDF에서 공복혈당(Fasting blood glucose, FBG) 수치를 평가하였다. IMG-1로 처리한 ZDF 랫트는 투여 방식에 상관없이, 처리 후 3일 안에 혈당치의 뚜렷한 감소를 보였으며(IV 투여된 IMG-1에 대해서는 179 mg/dl의 평균 FBG 수치 및 PO 투여된 IMG-1에 대해서는 135 mg/dl의 평균 FBG 수치 대(vs) 비처리 및 메트포르민 처리군 각각에서 281 mg/dl 및 258 mg/dl의 FBG 수치), 모든 IMG-1 처리한 동물은 7일까지 정상 FBG 수치를 보였다(200 mg/dl 미만의 수치). 비처리 대조군과 메트포르민 처리한 동물은 연구 전체에 걸쳐 유의적인 FBG 수치 상승을 보였고, 연구 종료 시에는 평균 수치가 400 mg/dl(각각, 481 mg/dl 및 468 mg/dl)을 초과하였다. 도 2는 IMG-1이 당뇨병 동물 모델에서 혈당치를 정상화하고, 혈당치는 IMG-1 대 대조군 및 메트포르민으로 처리한 동물에서 낮아짐을 보여준다.
ZDF 랫트의 혈압을 테일 커프(tail cuff) 혈압 모니터(CODA, 켄트 사이언티픽사의 모니터(Monitor from Kent Scientific))를 이용하여 주 2회 관찰하였다. 처리 3일 이내에, IMG-1로 처리한 랫트는 저혈압을 보이기 시작했으며, IMG-1을 경구로 복용한 ZDF 랫트는 7일까지 정상 BP를 보인 반면, IMG-1을 정맥 투여한 랫트는 10일까지 정상 BP를 보였다(IV 및 PO 투여된 IMG-1에 대하여 각각 120/82 mmHg 및 115/80 mmHg). 반면, 비처리 및 메트포르민 처리한 ZDF 랫트는 고혈압을 보였다(140/90 mmHg 초과, 비처리의 경우 141/95 mmHg 및 메트포르민 처리의 경우 142/99 mmHg). 도 3은 IMG-1 대 대조군 및 메트포르민으로 처리한 동물에서 수축 및 이완 혈압 수치를 나타내며; 1MG-1의 처리가 당뇨병 동물 모델에서 혈압을 정상화함을 보여준다.
HbA1c 수치를 평가하기 위해, 0일, 15일 및 35일째 희생시에 모든 동물에서 채혈을 수행하였다. 채취된 혈액 및 혈청에 대하여 생체 분석을 수행하였다. 3개의 시점 모두에서, 모든 동물의 헤모글로빈 A1c(HbA1c) 수치를 측정하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 평균 Hb1Ac 수치는 0일째에는 현저하게 다르지 않았고(9.7 및 10.8 사이); 15일째에는 Hb1Ac 수치가 비처리 및 메트포르민 군 모두와 비교하여 IMG-1 처리군에서 현저하게 낮았으며(IV의 경우 10.2 및 PO의 경우 9.5 대 비처리의 경우 12.1 및 메트포르민의 경우 11.0); 35일에는 IMG-1 처리한 동물이 자체의 초기 시작 수치(IV의 경우 10.4 및 PO의 경우 10.5)뿐만 아니라 비처리 및 메트포르민 처리한 동물 모두에서보다(비처리의 경우 12.3 및 메트포르민의 경우 11.8) 현저하게 낮은 수치를 보였다(IV의 경우 7.4 및 PO의 경우 7.5).
Hb1Ac 수치와 함께, 인슐린 수치를 3개의 시점에서 모든 동물에게서 측정하였다. 도 5에 나타난 바와 같으나 도 4에 나타난 Hb1Ac 수치와 달리, 비처리 및 IMG-1 처리군 간에는 그 어떤 임의의 3개의 시점에서도 인슐린 수치에 현저한 차이가 없었다. 또한, 대조군에서 나타난 결과는 문헌과 일치하였다.
IMG-1, 메트포르민 및 대조군 동물의 인슐린 수치에는 변화가 없었지만, IV 및 PO로 IMG-1 처리한 동물 모두의 글루카곤 수치는 15일(각각 115 pg/ml 및 119 pg/ml에서 90 pg/ml 및 92 pg/ml로 감소) 및 35일(89 pg/ml 및 92 pg/ml)에 현저하게 감소하였고; 대조군 및 메트포르민 처리한 동물은 전체 연구를 통해 글루카곤 수치에서 현저한 차이를 보이지 않았다. 도 6은 IMG-1이 당뇨병 동물 모델에서 글루카곤 수치를 감소시킴을 나타내며; 대조군과 비교하여 글루카곤 수치의 감소는 IMG-1을 경구 및 IV 투여군간에 일관되었다.
음용수 내의 IMG-1에 지속적으로 접근하게 하거나 처리하지 않은(n=4) 후에 20 μg의 IMG-1를 1회 주사한 후 48시간이 지나서 ZDF 랫트의 콜레스테롤 수치를 평가하였다. IMG-1 처리한 동물은 비처리 코호트(cohort)와 비교하여 콜레스테롤의 수치의 현저한 감소를 보였다. 도 7은 당뇨병 동물 모델에서 IMG-1이 콜레스테롤을 감소시킴을 나타내며; 비처리 동물은 224 mg/dL의 콜레스테롤 수치를 보인 반면, IMG-1 처리한 동물은 171 mg/dL(IV) 및 156 mg/dL(경구)의 콜레스테롤 수치를 각각 보였다.
실시예 2: 제1형 당뇨병 동물 모델
IMG-1은 제2형 당뇨병 동물 모델에서 혈당치를 정상화하고 HA1C를 감소시키는 것으로 나타났으므로, IMG-1이 제1형 당뇨병 동물 모델에서 혈당치에 영향을 미칠 수 있는지를 확인하였다. 췌장 베타 세포에 우선적인 독성을 갖고 설치류에서 실험적 당뇨병 유발을 위해 널리 사용되는 화합물인 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 이용함으로써 마우스에 당뇨병을 유도할 수 있다. STZ는 스트렙토마이세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogens) 세균에 의해 생성되는 항생 물질이며, 췌장 베타 세포에 세포독성 효과를 발휘하는 고 반응성 메틸니트로조우레아 모이어티(methylnitrosourea moiety)에 결합된 포도당 분자(데옥시 형태로)를 함유한다.
STZ-유도 당뇨병 모델에서 IMG-1의 효능을 조사하기 위해, 20마리의 3-4개월의 수컷 C57BL/6J 마우스에 STZ를 IP 주사를 통해 5일 동안 투여하여 고혈당증의 발병을 촉진하였다. STZ 주사 후, 4시간의 금식 후 전처리(기준치(baseline)) 혈당치를 측정하고, 이를 2개의 연구 군인 대조군(위약, n=7) 및 IMG-1 군(n=8/군)으로 마우스를 선택하는데 사용하였다. 동물을 대조군의 1일 1회 경구 위관 영양법(oral gavage) 또는 PO로 33 ㎍의 IMG-1을 3주 동안 처리하였다. 처리 기간 동안 공복 혈당치를 2-3일의 간격으로 측정하고, 인슐린 및 글루카곤 수치를 마찬가지로 측정하였다. STZ 처리 후 18일에, 대조군 동물의 공복 혈당치는 216 mg/dl에서 319 mg/dl로 증가하였고, 대조군 동물 중 한 마리는(~14%) 성장 장애(failure to thrive)로 인해 안락사를 시켜야 한 것으로 나타났다. 하지만, IMG-1군의 혈당치는 포도당 수치가 209 mg/dl에서 237 mg/dl로 약간의 상승한 것으로 나타났으며, 18일째에 IMG-1 군은 도 8에 나타난 바와 같이 대조군 동물보다 현저하게 더 낮은 혈당치를 보이는 것으로 나타났다.
실시예 3: 독성학 및 PK 연구
IMG-1 제형의 청소율 및 독성학에 접근하기 위해 스프래그 다우리 모델을 활용하였다. 세 마리의 수컷 스프래그 다우리 랫트에 20 ㎍의 활성 화합물(서열번호 1에 상응함)을 정맥 내 투여로 처리한 후, 간격, 구체적으로 IMG-1 투여 후 0, 5분, 15분, 30분, 60분, 90분, 2시간, 4시간, 6시간, 24시간 및 48시간에 채혈을 수행하였다. 활성 화합물은 6시간의 기간에 걸쳐 측정된 IMG-1 활성 화합물의 혈청 수치(pg/mL)에 의해 도 9에서 나타난 바와 같이, 투여 후 2시간까지 모든 3마리 동물의 혈액에서 검출되었으며, 세 번째 동물은 처리 후 4시간까지 검출 가능한 수치를 보였다. 활성 화합물 수치와 함께, 혈당치를 스프래그 다우리 모델에서 평가하였다. IMG-1 투여는 ZDF 랫트에서 혈당치를 급격히 감소시키는 반면, 스프래그 다우리 랫트에 투여한 IMG-1 제형(20 ㎍)의 단일 투여량은 스프래그 다우리 동물에서 48시간의 기간에 걸친 혈당치가 보여주는 바와 같이 48시간 이내에 저혈당증을 촉진하지 않았다(도 9에 나타난 바와 같음).
IMG-1 제형의 독성을 평가하기 위해, 파일럿 용량-탐색 독성 분석법(Pilot Dose-Finding Toxicity Assay)을 스프래그 다우리 랫트를 이용하여 수행하였다. 시험은 그룹당 암컷 동물 3마리 및 수컷 동물 3마리로 이루어진 5개의 군으로 구성하였다. 처리군에 하기의 IMG-1 농도, 즉 1.0 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍ 또는 1000 ㎍의 농도 중 하나의 단일 용량을 주었다. 대조군은 처리하지 않았다. 용량 투여 후 4시간 동안 매 1시간 마다, 그리고 5개의 군 모두에 총 14일 동안 매일 임상적 관찰을 수행하였다. 5개의 군(처리 및 비처리) 각각에 대하여 투여 후 7일 및 14일에 채혈을 하였다. 어떤 동물에서도 유해한 임상적 관찰은 관찰되지 않았다. 신장 기능을 평가하기 위해 크레아티닌 수치를 측정하고, 5개의 군 각각에서 간 기능을 평가하기 위해 알라닌 아미노기 전이효소 수치를 측정하였다. 도 10 및 도 11에 각각 나타낸 바와 같이, IMG-1 제형으로 처리한 동물과 비처리 동물 간에는 크레아티닌 및 알라닌 아미노기 전이효소 수치에서 식별 가능한(discernable) 차이는 보이지 않았다.
실시예 4: 인슐린 클램프(insulin clamp) 연구
인슐린 분비 및 저항성을 정량화하기 위한 가장 널리 인정되는 연구 방법은 동물이 포도당을 얼마나 잘 대사하는지 또는 동물이 인슐린에 얼마나 민감한지를 측정하는 정상혈당 인슐린 클램프(euglycemic insulin clamp) 기술 방법이다. 이 절차에서는, 일정한 혈장 인슐린 수치를 공복(fasting) 이상으로 유지하도록 외인성 인슐린을 주입하고, 다양한 비율로 포도당을 주입함으로써 포도당을 기준치(100-150 mg/dl 사이)로 고정한다.
IMG-1 처리한 동물(n=8) 대 대조군(n=8)에서의 인슐린 작용 및 포도당 대사를 평가하기 위해, 식이-유도 비만(diet-induced Obese, DIO) C57BL/6J 마우스에 2시간의 고인슐린성-정상혈당 클램핑 절차를 수행하였다. 클램핑 이전에, PBS 처리한 동물과 비교하여, (동물 1마리당) 2 ㎍의 IMG-1 제형을 클램프 시험 48시간 및 24시간 전에 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 투여하였다. IMG-1 처리한 동물은 PBS 처리한 동물(30 mg/kg/mL)보다 클램핑 동안 현저하게 더 높은 정상 상태(steady-state)의 포도당 주입속도(38.8 mg/kg/mL)를 보였다. 도 12에 나타난 바와 같이, IMG-1를 이용한 처리는 DIO 마우스에서 인슐린 저항성을 감소시킨다. 간 포도당 생성(Hepatic Glucose Production, HGP)은 또한 도 13에 나타난 바와 같이 IMG-1로 처리한 모든 동물에서 급격히 억제되었다. 또한, 고인슐린성-정상혈당 클램프 동안 IMG-1 처리한 모든 동물에서 간 인슐린 작용(HGP의 억제 비율(percent suppression))이 증가하였다. 하지만, 전신 포도당 전환, 당분해 및 글리코겐 합성의 수치가 대조군 동물과 처리된 동물 사이에서 거의 동일함을 보여주는 도 14에 의해 입증되는 바와 같이, IMG-1은 어떠한 처리된 동물에서도 전신 포도당 전환, 당분해 또는 글리코겐 합성에 영향을 미치지 않았다. 클램핑 절차의 결과는 또한 골격근의 포도당 흡수 및 백색 지방질 조직의 포도당 흡수가 비처리 및 처리된 동물 사이에서 거의 일치함을 보여주는 도 15에 의해 입증되는 바와 같이, 골격근 및 지방질 조직 내 포도당 대사는 클램프 분석법 동안 IMG-1 또는 PBS 처리한 동물에서 현저하게 다르지 않음을 보여준다.
실시예 5: RPS2 활성 영역의 확인
전장의 정제된 RPS2 단백질을 하이드록실아민(NH2OH)으로 분해하여 2개의 위치, 즉 위치 P1의 Asn 및 위치 P1'의 Gly에서의 아미노산 134에서 RPS2를 절단하고, 그 결과 약 13kDa의 짧은 RPS2(IMG-1s) 및 약 18kDa의 긴 RPS2(IMG-1L)로 명명된 2개의 서브 유닛을 생성하였다. 그 결과 생성된 단편을 비-변성 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분해시키고, 가시화시킨 다음 겔로부터 전기 용출하였다. 세포 배양물에서 시험하기 위한 제형을 제조하기 위해 이 단편을 사용하였다.
인간 피부 미세혈관 내피세포(Human Dermal Microvascular Endothelial Cell, CADMEC/HMVEC)는 내피 기능 및 질병의 많은 양상, 특히 미세혈관계와 관련된 것들을 연구하기 위한 우수한 모델 시스템을 제공한다. MTT 분석법은 세포 대사 활동을 평가하기 위한 비색분석법(colorimetric assay)이다. NAD(P)H-의존성 세포 산화환원 효소는 정해진 조건하에서, 존재하는 생존 가능한 세포의 수를 반영할 수 있다. 이들 효소는 테트라졸륨 염료 MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5- 디페닐테트라졸륨 브롬화물을 자주색을 띄는 불용성 포르마잔으로 환원시킬 수 있다. 세포 활성에 대한 IMG 제형의 효과를 평가하기 위해, 셀 어플리케이션즈사(Cell Applications Inc.)로부터 입수 가능한 것과 같은 CADMEC 배양물을 다양한 제형, 즉 0.5 ㎍/mL의 전장 단백질(IMG-1로 명명됨), 0.5 ㎍/mL의 C-말단 단편(IMG-1L로 명명됨) 또는 0.5 ㎍/mL의 N-말단 단편(IMG-1s로 명명됨) 중 하나로 처리하였다. 처리된 배양물을 72시간 동안 성장시켰다. 72시간의 세포 성장 이후에, 100 μL의 세포 배양물을 10 μL의 12 mM MTT로 처리하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. MTT로 4시간 배양한 후, 결정을 가용화하기 위해 100 μL의 SDS-HCl 용액을 MTT 처리된 세포 배양물에 첨가하고, 추가로 4시간 동안 더 배양하였다. 그런 다음, 마이크로플레이트 흡수 분광 광도계(Microplate Absorbance Spectrophotometer, 바이오래드(BioRad)의 xMark™와 유사함)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 판독하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 72시간에 IMG-1 및 IMG-1L의 제형으로 처리한 세포에서 상대적인 광학 OD가 현저하게 증가(각각 164% 및 157%)한 반면, IMG-1S는 세포 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며 처리하지 않은 수치가 IMG-1S 제형과 비슷하였다. IMG-1L은 전장 단백질의 C-말단의 단편에 상응하는 반면, IMG-1S의 제형은 전장 단백질의 N-말단의 단편에 상응한다. 따라서, RPS2의 C-말단 및 이의 단편 및/또는 유사체는 전장 RPS2 단백질과 함께 치료적 가치가 있다.
예시적 IMG -1 제형
본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및/또는 서열번호 4 중 하나 이상에 상응하는 폴리펩티드, 펩티드 및/또는 유사체 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및/또는 서열번호 4에 상응하는 정제된 또는 합성 펩티드 또는 펩티드 유사체를 포함하는 본 발명의 제형은 당업자가 이용 가능한 방법에 따라 제형화될 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 제형은 서열번호 1-4 중 하나에 상응하는 RPS2 폴리펩티드 또는 유사체, 또는 이의 활성 펩티드 영역을 20 ㎍ 미만 및 최대 150 ㎍의 범위로 고체 투여 형태 또는 용액으로서 포함한다. 일 구현예에서, 제형은 0.05 내지 5 ㎍/L의 농도로 존재하는 펩티드를 포함하고; 다른 구현예에서, 제형은 0.1 내지 1 ㎍/L의 농도로 존재하는 펩티드를 포함하며; 또 다른 구현예에서, 제형은 경구용 제형의 경우 50-150 ㎍/kg의 농도로 그리고 정맥 주사용 제형의 경우 5-15 ㎍/kg의 농도로 존재하는 펩티드를 포함한다. 활성 성분의 농도 및 상응하는 투여량은 대상체의 체중, 투여 경로, 치료할 증상/장애 및 증상의 중증도에 따라 부분적으로 의존할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 제형은 세제, 계면활성제, 담즙산염, Ca2 + 킬레이트제, 지방산, 중간사슬 글리세리드, 아실카르니틴, 알카노일 콜린, N-아세틸화 α-아미노산, N-아세틸화 비-α-아미노산, 키토산, 점막 부착성 중합체 및 인지질 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 흡수 강화제를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 유용한 예시적 부형제는 완충액, 염, 계면활성제, 폴리올/이당류/다당류, 아미노산 및 산화방지제를 포함한다. pH 수치를 4.7 및 7.4 사이로 유지하는 예시적 완충액은 아세트산염, 구연산염, 히스티딘, 숙신산염, 인산염 및 하이드록시메틸아미노메탄(Tris)을 포함한다. 예시적 계면활성제는 폴리소르베이트 80(트윈 80), 폴리소르베이트 20(트윈 20) 및 폴록사머 188을 포함한다. 동결건조(냉동-건조) 제형은 폴리올/이당류/다당류(예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스, 트레할로오스 및 덱스트란 40) 중 하나 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있다. 당류는 동결건조 제형을 위한 벌크(bulk)를 제공하며, 이는 치료적 단백질에 대한 안정화제로서의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 염화나트륨(NaCl)은 단백질 제형와 함께 일반적으로 사용된다. 예시적 산화방지제는 아스코르브산, 메티오닌 및 에틸렌디아민 사초산(EDTA)을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 제형은 하나 이상의 친유성 모이어티에 의한 표면 변형을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약학적 제형은 하나 이상의 담체 분자의 농축액과 선택적으로 병용 투여되는 활성제를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 제형은 폴리아크릴산 또는 셀룰로오스 유도체를 포함하는 하나 이상의 합성 생체결합성(bioadhesive) 중합체를 추가로 포함한다. 폴리아크릴산계 중합체의 예로는 카보폴, 폴리카르보필, 폴리아크릴산(PAAc), 폴리아크릴레이트, 폴리(메틸비닐에테르-메타크릴산 공중합체), 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(알킬시아노아크릴레이트, 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트) 및 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 셀룰로오스 유도체는 카복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 및 메틸하이드록시에틸 셀룰로오스를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또한, 반자연적(seminatural) 생체결합성 중합체는 키토산, 및 구아, 크산탄, 폴리(비닐피롤리돈) 및 폴리(비닐 알코올)과 같은 다양한 검류를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 제형은 불수용성(water-insoluble) 중합체, 에틸 셀룰로오스(EC)를 포함하는 백킹 층(backing layer); 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트, 유드라짓 L100 또는 S100과 같은 장용성 pH-민감성 중합체를 포함하는 표면층(surface layer); 부착층(adhesive layer)을 포함하는 코팅층(coating layer); 및 백킹 층에 부착되는 셀룰로오스 막으로 이루어지는 펩티드-함유 층인 중층(middle layer)과 함께 장용성 캡슐 내 함유되는 적층 필름(layered film)을 갖는 활성제를 포함하는 위장관 점막 부착성 패치 시스템(gastrointestinal mucoadhesive patch system, GI-MAPS)을 추가로 포함한다. 경구 투여 후, 표면층은 표적으로 하는 장내 부위에서 용해되고, 소장벽에 부착되고, 점막에 부착되어 위장 점막의 표적 부위에 폐쇄된(closed) 공간이 생성된다. 그 결과, 활성제 및 흡수 촉진제는 모두 폐쇄된 공간 내에 공존하고, 고농도 구배가 시스템 내부와 소장세포 사이에 형성되어 펩티드의 흡수 향상에 기여한다.
상술된 임의의 구현예와 관련하여 설명된 특징은 상이한 구현예 간에 상호 교환적으로 적용 가능할 수 있음이 당업계의 기술자에게 명백할 것이다. 상술된 구현예는 본 발명의 다양한 특징을 예시하기 위한 예시이다.
본 명세서의 설명 및 청구범위에 걸쳐, 단어 "포함하다"와 "함유하다" 및 이들의 변형은 "포함하지만, 이에 한정되지 않음"을 의미하는 것으로, 이들은 다른 모이어티, 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제시고자 하는 것이 아니다(그리고 배제하지 않는다). 본 명세서의 설명 및 청구범위에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단수는 복수를 포함한다. 특히, 부정 관사가 사용되는 경우, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 명세서는 단수형뿐만 아니라 복수성도 고려하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 특정 양태, 구현예 또는 실시예와 함께 기술된 특징, 정수, 특성, 화합물, 화학적 모이어티 또는 그룹은 서로 양립할 수 없는 경우가 아닌 한, 본 설명에 기술된 임의의 다른 양태, 구현예 또는 실시예에 적용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. (임의의 첨부된 청구범위, 요약서 및 도면을 포함하는) 본 명세서에 개시된 모든 특징 및/또는 그렇게 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는, 이러한 특징 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 발명은 임의의 전술한 구현예의 세부 사항으로 한정되지 않는다. 본 발명은 (임의의 첨부된 청구범위, 요약서 및 도면을 포함하는) 본 명세서에 개시된 특징 중 임의의 신규한 특징 또는 임의의 신규한 조합에까지, 또는 그렇게 개시된 임의의 방법 또는 공정의 단계 중 임의의 신규한 단계 또는 임의의 신규한 조합에까지 확장된다.
독자의 관심은 본 출원과 관련하여 본 명세서와 동시에 또는 이전에 제출되고 본 명세서와 함께 공중 열람에 공개되는 모든 논문 및 문서로 향하며, 그러한 모든 논문 및 문서의 내용은 본 설명에 참조로 포함된다.
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Claims (21)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 치료학적 유효량의 서열번호 1 또는 2에 따른 펩티드를 포함하는 제형으로서, 치료학적 유효량은 대상체에서 혈당 수치를 200mg/dL 미만으로 낮추기에 충분한 양인 것인 제형.
  6. 제5항에 있어서,
    제형은 경구용 약학적 제형인 것인 제형.
  7. 제5항에 있어서,
    제형은 약학적 비경구용 제형인 것인 제형.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    제형은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 약학적으로 허용 가능한 희석제, 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것인 제형.
  9. 제5항에 있어서,
    제형은 수성(aqueous) 약학적 제형인 것인 제형.
  10. 제9항에 있어서,
    펩티드는 0.05 내지 5 ㎍/L의 농도로 존재하는 것인 제형.
  11. 제9항에 있어서,
    펩티드는 0.1 내지 1 ㎍/L의 농도로 존재하는 것인 제형.
  12. 제9항에 있어서,
    수성 약학적 제형은 완충액, 선택적으로 생리학적 pH를 갖는 완충액을 포함하는 것인 제형.
  13. 제12항에 있어서,
    완충액은 인산완충식염수인 것인 제형.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제5항에 있어서,
    간 포도당 생성의 감소, 또는 콜레스테롤 수치의 감소, 또는 글루카곤 수치의 감소, 또는 인슐린 저항의 감소, 또는 혈압의 감소를 제공하는 데 사용하기 위한 제형.
  18. 제5항에 있어서,
    고혈당증, 또는 고콜레스테롤혈증, 또는 고혈압, 또는 대사 증후군 중 적어도 하나를 치료하는데 사용하기 위한 제형.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제5항의 제형을 포함하는 대상체에서 당뇨병, 또는 고혈당증, 또는 고콜레스테롤혈증, 또는 고혈압 중 적어도 하나를 치료하기 위한 약학적 조성물.
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