CN114213522A

CN114213522A - 一种大黄鱼TGF-β1重组蛋白及其应用

Info

Publication number: CN114213522A
Application number: CN202111632000.XA
Authority: CN
Inventors: 陈新华; 慕鹏飞; 李小峰
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-03-22

Abstract

本发明提供了一种大黄鱼转化生长因子‑β1重组蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明构建了高效表达大黄鱼TGF‑β1重组蛋白的大肠杆菌工程菌，利用该大肠杆菌工程菌产生的大黄鱼TGF‑β1重组蛋白，可抑制大黄鱼头肾巨噬细胞中炎症相关因子iNOS和TNFα的表达水平，并抑制巨噬细胞中炎症相关活性物质活性氧和一氧化氮的产生，降低大黄鱼的炎症反应，在作为消除炎症蛋白制剂中具有良好的应用前景。

Description

一种大黄鱼TGF-β1重组蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大黄鱼TGF-β1重组蛋白及其应用。

背景技术

转化生长因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）蛋白家族是TGF-β超家族成员，该家族蛋白是一类具有多效性的细胞因子。可参与调节淋巴细胞活化、增殖和分化，以及先天免疫细胞的发育和功能，促进血管生成和伤口愈合等。TGF-β家族主要由三个成员：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。其中TGF-β1主要由淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等产生，通过自分泌和旁分泌调节淋巴细胞的存活、增殖和分化。同时参与抑制天然杀伤细胞（Natural killer cells, NK）的成熟；抑制树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的成熟和抗原呈递能力，同时，DCs可通过整合素促进TGF-β1活化，诱导外周调节性T细胞（peripheral regulatory T cells，pTreg）的生成，抑制致病性Th17细胞（T helper 17cells）的分化；可以增强肥大细胞（Mast Cells）趋化性以及粘附特性从而促进伤口愈合和组织修复；促进M2巨噬细胞（Macrophages M2）活化以及粒细胞（Granulocytes）的趋化性和存活。TGF-β1通过上述功能来控制炎症反应的发生和消退。目前多种鱼类的TGF-β1已经被克隆并鉴定，但是其应用型研究仍比较欠缺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大黄鱼TGF-β1重组蛋白及其应用。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明首先提供了一种大黄鱼TGF-β1重组蛋白，所述大黄鱼TGF-β1重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示。

本发明还提供了一种上述的大黄鱼TGF-β1重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列克隆到含有融合蛋白标签NusA的大肠杆菌表达载体pET-43.1a中，将得到的重组质粒转化至大肠杆菌（E. coli）Rosetta（DE3）中得到基因工程菌，命名为Rosetta/pET-43.1a-TGF-β1；将Rosetta/pET-43.1a-TGF-β1接种至LB培养液中，于37℃条件下培养，待菌液OD₆₀₀值至0.6时，加入终浓度为0.5 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于37℃条件下诱导表达5 h，离心收集菌体，加入细菌裂解液重悬，破碎菌体后离心，然后纯化得到目标产物大黄鱼TGF-β1重组蛋白；其中，LB培养液配方为：1wt%蛋白胨+0.5wt%酵母抽提物+1wt%氯化钠+1 L ddH₂O，细菌裂解液配方为：50 mM pH8.0 Tris缓冲液+500 mM NaCl+5%甘油+10 mM DTT+(0.1-0.2) mM PMSF。

本发明还提供了上述一种TGF-β1重组蛋白在制备用于消除大黄鱼炎症的蛋白制剂中的应用。

本发明的显著优点在于：

1、本发明所提供的大黄鱼TGF-β1重组蛋白具有良好的消除大黄鱼炎症反应效果。

2、本发明利用工程菌表达大黄鱼TGF-β1重组蛋白，制备工艺简单，投入成本低廉，具有可观的经济效益。

附图说明

图1为大黄鱼TGF-β1重组蛋白的鉴定图。（A）诱导表达产物的SDS PAGE分析。M：标准蛋白分子量Marker；1：未经IPTG诱导的Rossetta/pET-43.1(a)全菌总蛋白；2：IPTG诱导后的Rossetta/pET-43.1(a)全菌总蛋白；3：未经IPTG诱导的Rossetta /pET-43.1(a)-TGF-β1全菌总蛋白；4：IPTG诱导后的Rossetta/pET-43.1(a)-TGF-β1全菌总蛋白；5：纯化后的大黄鱼TGF-β1重组蛋白。（B）诱导表达产物的Western-blotting 分析。M：标准蛋白分子量Marker；1：纯化后的大黄鱼TGF-β1重组蛋白。

图2为大黄鱼TGF-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞炎症反应的抑制作用。（A）大黄鱼TGF-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞总活性氧和一氧化氮水平的影响。（B）大黄鱼TGF-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞中部分炎症相关基因表达的影响。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

以下实施例中所用到的材料如下：

RNA提取试剂盒（LS1040）和cDNA第一链合成试剂盒（LS2052）购自Promega公司，胶回收试剂盒购自Omega公司，限制性内切酶购自Thermo Fisher公司，无缝拼接基因克隆试剂盒pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit购自北京全式金生物技术有限公司，活性氧检测试剂盒、一氧化氮检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

大肠杆菌表达载体pET-43.1a（含融合蛋白标签NusA）购自Novagen公司，E.coliRosetta (DE3)购自北京全式金生物技术有限公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

LB琼脂平板培养基配方为：1wt%蛋白胨+0.5wt%酵母抽提物+1wt%氯化钠+1.5wt%琼脂粉1 L ddH₂O。

LB培养液配方为：1wt%蛋白胨+0.5wt%酵母抽提物+1wt%氯化钠+1 L ddH₂O。

细菌裂解液配方为：50 mM pH8.0 Tris缓冲液+500 mM NaCl+5%甘油+10 mM DTT+(0.1-0.2) mM PMSF。

Ni柱平衡液配方为：50 mM pH8.0 Tris缓冲液+500 mM NaCl+10 mM Imidazole+5wt%甘油。

杂蛋白洗涤液配方为：50 mM pH8.0 Tris缓冲液+500 mM NaCl+30 mM Imidazole+5wt%甘油。

蛋白洗脱液配方为：50 mM pH8.0 Tris缓冲液+500 mM NaCl+500 mM Imidazole+5wt%甘油。

PBS缓冲液配方为：NaCl 8 g，KCl 0.24 g，Na₂HPO₄ 1.15 g，KH₂PO₄ 0.2 g，加入ddH₂O定容1 L。

实施例1 构建高效表达大黄鱼TGF-β1重组蛋白的大肠杆菌工程菌

1 目的基因的获取

参考RNA提取试剂盒说明书从大黄鱼脾脏提取总RNA，检测提取RNA的完整性及浓度，以提取的RNA为模板合成cDNA第一链，操作方法参考cDNA第一链合成试剂盒说明书。根据NCBI中公布的大黄鱼TGF-β1基因序列（登录号：XM_027280465.1）设计上下游引物扩增大黄鱼TGF-β1基因编码蛋白的成熟肽序列，所设计的引物序列如下：

TGF-β1-F（SEQ ID NO. 1）：

5’-AGAGTCCGGGAGCTCGTGGATCCTCCTCCACGGAGACAAAGGAC-3’，

TGF-β1-R（SEQ ID NO. 2）：

5’-AGCTGTGCGGCCGCAAGCTTTAGCTACACTTGCAAGACTTC-3’。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

扩增反应结束后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后将回收产物与pEASY Bluntsimple载体连接，转化至大肠杆菌Trans-T1后，在LB琼脂平板培养基（含终浓度100 ng/mL的氨苄青霉素抗生素）中培养18 h，挑取阳性克隆菌落，进行菌落PCR验证，并送至生物公司测序鉴定，得到PCR阳性克隆质粒，即含有大黄鱼TGF-β1基因，该基因具有SEQ ID NO.3所示的cDNA序列。

2 表达大黄鱼TGF-β1重组蛋白的基因工程菌的构建

用限制性内切酶 Hind III和BamH I酶切含有融合蛋白标签NusA的大肠杆菌表达载体pET-43.1a并回收载体片段，随后使用全式金公司的pEASY-Uni Seamless Cloningand Assembly Kit试剂盒将取上述回收的TGF-β1目的片段连接到大肠杆菌表达载体pET-43.1a中，构建重组蛋白表达质粒pET-43.1a-TGF-β1，所有操作均参照试剂盒说明书进行。将重组蛋白表达质粒pET-43.1a-TGF-β1转化至E.coli Rosetta (DE3)中，涂布于含100ng/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上，37℃静置培养16 h，筛选含有重组蛋白表达质粒的菌，做PCR鉴定，并提取质粒做酶切鉴定，阳性克隆送至生物公司测序，证实该重组蛋白表达质粒pET-43.1a-TGF-β1中含有表达大黄鱼TGF-β1重组蛋白（SEQ ID NO.4）的基因序列TGF-β1-NusA（SEQ ID NO.5），得到表达大黄鱼TGF-β1重组蛋白的基因工程菌Rosetta/pET-43.1a-TGF-β1。

实施例2大黄鱼TGF-β1重组蛋白的表达与纯化

1 大黄鱼TGF-β1重组蛋白的表达分析

挑取实施例1获得的基因工程菌Rosetta/pET-43.1a-TGF-β1单菌落接种到LB培养液中，37℃，220 rpm震荡培养。待OD₆₀₀至0.6时，向菌液中加入终浓度为0.5 mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）于37℃条件下诱导表达5 h，离心收集菌体，加入细菌裂解液重悬，用超声破碎仪破碎，收集上清。使用SDS-PAGE分析培养上清中大黄鱼TGF-β1重组蛋白的表达及纯化情况。结果显示，在大肠杆菌Rosetta/pET-43.1a-TGF-β1工程菌体破碎后的上清中观察到分子量约为75 kDa目的条带，并纯化得到高纯度的TGF-β1重组蛋白（图1A）。

2 大黄鱼TGF-β1重组蛋白纯化

将上述经0.5 mM IPTG在37℃条件下诱导5 h后的大肠杆菌Rosetta/pET-43.1a-TGF-β1工程菌的菌液以6000g的条件在4℃下离心10 min以得到诱导后的工程菌菌体。按照菌体质量：缓冲液体积=1 g：5 mL的比例加入至细菌裂解液中，充分震荡重悬菌体，以看不到菌体沉淀为准。采用高压匀浆破碎的方法破碎细菌：高压破碎仪设定650 bar，4℃条件下破碎细菌，直至混合液变为澄清。将破碎后的混合液在8000g的条件下在4℃下离心10 min，直至细菌碎片完全沉积，收集上清溶液。向Ni亲和层析柱中加入Ni柱平衡液，平衡10 min，期间用移液枪吹打使平衡液充分接触Ni介质，然后使Ni柱平衡液自然流出，随后将上述获得的菌体破碎上清液加入平衡后的Ni柱，使上清液中的目的蛋白与Ni介质结合 2 h，然后使破碎上清液流出。再用20 mL杂蛋白洗涤液浸泡洗10 min以去除杂蛋白，重复清洗10次，至流出液无蛋白，用蛋白洗脱液进行洗脱目的蛋白。将纯化后的大黄鱼TGF-β1重组蛋白经PBS缓冲液于4℃透析3次，在12000g的条件下离心30 min，去除沉淀，即获得高纯度的大黄鱼TGF-β1重组蛋白（图1B）。

实施例3大黄鱼TGF-β1重组蛋白抑制巨噬细胞炎症反应功能

1 大黄鱼头肾巨噬细胞的提取

具体方法见参考文献（Mao K, Chen W, Mu Y, et al. Fish & shellfish immunology, 2018, 80: 180-190.）。

2 大黄鱼TGF-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞总活性氧和一氧化氮水平的影响

将新鲜提取的大黄鱼头肾巨噬细胞接种至6孔细胞培养板中，每孔2 mL（细胞密度为1 × 10⁶ cells/mL）。实验分为4组，每组3个平行。PBS组，每孔加20 μL的PBS缓冲液；LPS组，每孔加入20 μL 4 mg/mL的LPS溶液（以PBS缓冲液为溶剂）；LPS+NusA组，每孔加入20 μL4 mg/mL的LPS溶液（以PBS缓冲液为溶剂）和2 μL 100 μg/mL的NusA蛋白溶液（以PBS缓冲液为溶剂）；LPS+TGF-β1组，每孔加入20 μL 4 mg/mL的LPS溶液（以PBS缓冲液为溶剂）和 2 μL100 μg/mL的大黄鱼TGF-β1重组蛋白溶液（以PBS缓冲液为溶剂）。在28℃条件下共同孵育24h，使用活性氧检测试剂盒和一氧化氮检测试剂盒分别测定大黄鱼头肾巨噬细胞细胞内总活性氧和一氧化氮水平。结果显示，LPS可显著诱导大黄鱼巨噬细胞产生活性氧（图2A）和一氧化氮（图2B）；LPS处理组和LPS+NusA处理组巨噬细胞中的活性氧和一氧化氮水平无显著差异；与LPS+NusA处理组相比，LPS+TGF-β1处理组的大黄鱼头肾巨噬细胞中的总活性氧和一氧化氮的浓度均显著降低，分别为对照组的42%和44%。

3 大黄鱼TGF-β1重组蛋白对大黄鱼头肾巨噬细胞中部分炎症相关基因表达的影响

将新鲜提取的大黄鱼头肾巨噬细胞接种至细胞培养板中，每孔2 mL（细胞密度为1× 10⁶ cells/mL）。实验分为2组，每组3个平行。LPS+NusA组，每孔加入20 μL 4 mg/mL的LPS溶液（以PBS缓冲液为溶剂）和 2 μL 100 μg/mL的NusA蛋白溶液（以PBS缓冲液为溶剂）；LPS+TGF-β1组，每孔加入20 μL 4 mg/mL的LPS溶液（以PBS缓冲液为溶剂）和 2 μL 100 μg/mL的大黄鱼TGF-β1重组蛋白溶液（以PBS缓冲液为溶剂）。于处理后6、12和24 h收集细胞。参考RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，检测提取RNA的完整性及浓度，以提取的RNA为模板合成cDNA第一链，操作方法参考cDNA 第一链合成试剂盒说明书。本研究所用TNF-α基因和iNOS基因的序列信息均由NCBI数据库查询获得，设计荧光定量引物：

TNF-α-F（SEQ ID NO.6）：5’-GGGAAAACGCCTCACACCT-3’，

TNF-α-R（SEQ ID NO.7）：5’-GGCGTTGTACCAACCCTGT-3’；

iNOS-F（SEQ ID NO.8）：5’-CAGGTCTTACAGTAATCCGTCG-3’，

iNOS-R（SEQ ID NO.9）：5’-AAAACCGCCTTGAGATGTTG-3’；

内参基因为β-actin，计引荧光定量引物：

β-actin-F（SEQ ID NO.10）：5’-GACCTGACAGACTACCTCATG-3’,

β-actin-R（SEQ ID NO.11）：5’-AGTTGAAGGTGGTCTCGTGGA-3’。

使用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR分析。荧光定量PCR总反应体系为20 μL，包括SYBR Green II 10 μL，基因特异性荧光定量引物（浓度为10 μM）TNF-α-F/R或者iNOS-F/R各0.2 μL，cDNA模板1 μL, 无核酸酶水8.6 μL。反应条件为：94℃预变性5min；接着94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复40个循环。采用 2^−ΔΔCt法计算基因的相对表达量。结果显示：与LPS+NusA组相比，LPS+TGF-β1处理组的大黄鱼头肾巨噬细胞中iNOS基因的表达水平显著被抑制（图2C）；处理6 h时，与LPS+NusA组相比，LPS+TGF-β1处理组的大黄鱼头肾巨噬细胞中TNF-α基因的表达水平显著被抑制（图2D）。

以上结果表明，大黄鱼TGF-β1重组蛋白可通过抑制活性氧和一氧化氮的产生，抑制炎症相关基因的表达来抑制大黄鱼炎症反应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种大黄鱼TGF-β1重组蛋白及其应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtccggg agctcgtgga tcctcctcca cggagacaaa ggac 44

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agctgtgcgg ccgcaagctt tagctacact tgcaagactt c 41

<210> 3

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccacggaga caaaggacac ctgtacagcc cagacagaga cctgctgtgt gaggagcttg 60

tacatcgact tcaggaaaga tctgggctgg aaatggatac acaagccaac gggatacctt 120

gccaattact gcatggggtc ctgcacctac atctggaata ctgaaaacaa atattctcag 180

attttggcct tgtataagca tcacaaccca ggagcctctg cccagccctg ctgtgtcccc 240

caggcactgg agccactgcc aatcctctac tacgtgggca ggcaacacaa ggtggagcag 300

ctgtccaata tgagcgtgaa gtcttgcaag tgtagc 336

<210> 4

<211> 666

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Asn Lys Glu Ile Leu Ala Val Val Glu Ala Val Ser Asn Glu Lys

1 5 10 15

Ala Leu Pro Arg Glu Lys Ile Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ala Leu Ala

20 25 30

Thr Ala Thr Lys Lys Lys Tyr Glu Gln Glu Ile Asp Val Arg Val Gln

35 40 45

Ile Asp Arg Lys Ser Gly Asp Phe Asp Thr Phe Arg Arg Trp Leu Val

50 55 60

Val Asp Glu Val Thr Gln Pro Thr Lys Glu Ile Thr Leu Glu Ala Ala

65 70 75 80

Arg Tyr Glu Asp Glu Ser Leu Asn Leu Gly Asp Tyr Val Glu Asp Gln

85 90 95

Ile Glu Ser Val Thr Phe Asp Arg Ile Thr Thr Gln Thr Ala Lys Gln

100 105 110

Val Ile Val Gln Lys Val Arg Glu Ala Glu Arg Ala Met Val Val Asp

115 120 125

Gln Phe Arg Glu His Glu Gly Glu Ile Ile Thr Gly Val Val Lys Lys

130 135 140

Val Asn Arg Asp Asn Ile Ser Leu Asp Leu Gly Asn Asn Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Ile Leu Arg Glu Asp Met Leu Pro Arg Glu Asn Phe Arg Pro Gly

165 170 175

Asp Arg Val Arg Gly Val Leu Tyr Ser Val Arg Pro Glu Ala Arg Gly

180 185 190

Ala Gln Leu Phe Val Thr Arg Ser Lys Pro Glu Met Leu Ile Glu Leu

195 200 205

Phe Arg Ile Glu Val Pro Glu Ile Gly Glu Glu Val Ile Glu Ile Lys

210 215 220

Ala Ala Ala Arg Asp Pro Gly Ser Arg Ala Lys Ile Ala Val Lys Thr

225 230 235 240

Asn Asp Lys Arg Ile Asp Pro Val Gly Ala Cys Val Gly Met Arg Gly

245 250 255

Ala Arg Val Gln Ala Val Ser Thr Glu Leu Gly Gly Glu Arg Ile Asp

260 265 270

Ile Val Leu Trp Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Val Ile Asn Ala Met

275 280 285

Ala Pro Ala Asp Val Ala Ser Ile Val Val Asp Glu Asp Lys His Thr

290 295 300

Met Asp Ile Ala Val Glu Ala Gly Asn Leu Ala Gln Ala Ile Gly Arg

305 310 315 320

Asn Gly Gln Asn Val Arg Leu Ala Ser Gln Leu Ser Gly Trp Glu Leu

325 330 335

Asn Val Met Thr Val Asp Asp Leu Gln Ala Lys His Gln Ala Glu Ala

340 345 350

His Ala Ala Ile Asp Thr Phe Thr Lys Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asp

355 360 365

Phe Ala Thr Val Leu Val Glu Glu Gly Phe Ser Thr Leu Glu Glu Leu

370 375 380

Ala Tyr Val Pro Met Lys Glu Leu Leu Glu Ile Glu Gly Leu Asp Glu

385 390 395 400

Pro Thr Val Glu Ala Leu Arg Glu Arg Ala Lys Asn Ala Leu Ala Thr

405 410 415

Ile Ala Gln Ala Gln Glu Glu Ser Leu Gly Asp Asn Lys Pro Ala Asp

420 425 430

Asp Leu Leu Asn Leu Glu Gly Val Asp Arg Asp Leu Ala Phe Lys Leu

435 440 445

Ala Ala Arg Gly Val Cys Thr Leu Glu Asp Leu Ala Glu Gln Gly Ile

450 455 460

Asp Asp Leu Ala Asp Ile Glu Gly Leu Thr Asp Glu Lys Ala Gly Ala

465 470 475 480

Leu Ile Met Ala Ala Arg Asn Ile Cys Trp Phe Gly Asp Glu Ala Thr

485 490 495

Ser Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Lys Glu Thr

500 505 510

Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Pro Pro Thr

515 520 525

Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Gly Ser Gly Thr Ile Asp Asp Asp

530 535 540

Asp Lys Ser Pro Gly Ala Arg Gly Ser Ser Ser Thr Glu Thr Lys Asp

545 550 555 560

Thr Cys Thr Ala Gln Thr Glu Thr Cys Cys Val Arg Ser Leu Tyr Ile

565 570 575

Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Lys Pro Thr Gly

580 585 590

Tyr Leu Ala Asn Tyr Cys Met Gly Ser Cys Thr Tyr Ile Trp Asn Thr

595 600 605

Glu Asn Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ala Leu Tyr Lys His His Asn Pro

610 615 620

Gly Ala Ser Ala Gln Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu

625 630 635 640

Pro Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Gln His Lys Val Glu Gln Leu Ser

645 650 655

Asn Met Ser Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser

660 665

<210> 5

<211> 2001

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaacaaag aaattttggc tgtagttgaa gccgtatcca atgaaaaggc gctacctcgc 60

gagaagattt tcgaagcatt ggaaagcgcg ctggcgacag caacaaagaa aaaatatgaa 120

caagagatcg acgtccgcgt acagatcgat cgcaaaagcg gtgattttga cactttccgt 180

cgctggttag ttgttgatga agtcacccag ccgaccaagg aaatcaccct tgaagccgca 240

cgttatgaag atgaaagcct gaacctgggc gattacgttg aagatcagat tgagtctgtt 300

acctttgacc gtatcactac ccagacggca aaacaggtta tcgtgcagaa agtgcgtgaa 360

gccgaacgtg cgatggtggt tgatcagttc cgtgaacacg aaggtgaaat catcaccggc 420

gtggtgaaaa aagtaaaccg cgacaacatc tctctggatc tgggcaacaa cgctgaagcc 480

gtgatcctgc gcgaagatat gctgccgcgt gaaaacttcc gccctggcga ccgcgttcgt 540

ggcgtgctct attccgttcg cccggaagcg cgtggcgcgc aactgttcgt cactcgttcc 600

aagccggaaa tgctgatcga actgttccgt attgaagtgc cagaaatcgg cgaagaagtg 660

attgaaatta aagcagcggc tcgcgatccg ggttctcgtg cgaaaatcgc ggtgaaaacc 720

aacgataaac gtatcgatcc ggtaggtgct tgcgtaggta tgcgtggcgc gcgtgttcag 780

gcggtgtcta ctgaactggg tggcgagcgt atcgatatcg tcctgtggga tgataacccg 840

gcgcagttcg tgattaacgc aatggcaccg gcagacgttg cttctatcgt ggtggatgaa 900

gataaacaca ccatggacat cgccgttgaa gccggtaatc tggcgcaggc gattggccgt 960

aacggtcaga acgtgcgtct ggcttcgcaa ctgagcggtt gggaactcaa cgtgatgacc 1020

gttgacgacc tgcaagctaa gcatcaggcg gaagcgcacg cagcgatcga caccttcacc 1080

aaatatctcg acatcgacga agacttcgcg actgttctgg tagaagaagg cttctcgacg 1140

ctggaagaat tggcctatgt gccgatgaaa gagctgttgg aaatcgaagg ccttgatgag 1200

ccgaccgttg aagcactgcg cgagcgtgct aaaaatgcac tggccaccat tgcacaggcc 1260

caggaagaaa gcctcggtga taacaaaccg gctgacgatc tgctgaacct tgaaggggta 1320

gatctgattt ggcattcaaa ctggccgccc gtggcgtttg tacgctggaa gatctcgccg 1380

aacagggcat tgatgatctg gctgatatcg aagggttgac cgacgaaaaa gccggagcac 1440

tgattatggc tgcccgtaat atttgctggt tcggtgacga agcgactagt ggttctggtc 1500

atcaccatca ccatcactcc gcgggtaaag aaaccgctgc tgcgaaattt gaacgccagc 1560

acatggactc gccaccgcca actggtctgg tcccccgggg cagcgcgggt tctggtacga 1620

ttgatgacga cgacaagagt ccgggagctc gtggatcctc ctccacggag acaaaggaca 1680

cctgtacagc ccagacagag acctgctgtg tgaggagctt gtacatcgac ttcaggaaag 1740

atctgggctg gaaatggata cacaagccaa cgggatacct tgccaattac tgcatggggt 1800

cctgcaccta catctggaat actgaaaaca aatattctca gattttggcc ttgtataagc 1860

atcacaaccc aggagcctct gcccagccct gctgtgtccc ccaggcactg gagccactgc 1920

caatcctcta ctacgtgggc aggcaacaca aggtggagca gctgtccaat atgagcgtga 1980

agtcttgcaa gtgtagctaa a 2001

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gggaaaacgc ctcacacct 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcgttgtac caaccctgt 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caggtcttac agtaatccgt cg 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaaaccgcct tgagatgttg 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacctgacag actacctcat g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agttgaaggt ggtctcgtgg a 21

Claims

1.一种大黄鱼TGF-β1重组蛋白，其特征在于：所述大黄鱼TGF-β1重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

2.一种如权利要求1所述的大黄鱼TGF-β1重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列克隆到含有融合蛋白标签NusA的大肠杆菌表达载体pET-43.1a中，将得到的重组质粒转化至大肠杆菌（E. coli）Rosetta（DE3）中得到基因工程菌，命名为Rosetta/pET-43.1a-TGF-β1；将Rosetta/pET-43.1a-TGF-β1接种至LB培养液中，于37℃条件下培养，待菌液OD₆₀₀值至0.6时，加入终浓度为0.5 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于37℃条件下诱导表达5 h，离心收集菌体，加入细菌裂解液重悬，破碎菌体后离心，然后纯化得到目标产物大黄鱼TGF-β1重组蛋白；其中，LB培养液配方为：1wt%蛋白胨+0.5wt%酵母抽提物+1wt%氯化钠+1 L ddH₂O，细菌裂解液配方为：50 mM pH8.0 Tris缓冲液+500 mM NaCl+5%甘油+10 mM DTT+(0.1-0.2) mM PMSF。

3.如权利要求1所述的TGF-β1重组蛋白在制备用于消除大黄鱼炎症的蛋白制剂中的应用。