CN103667331A

CN103667331A - 重组酶基因bet作为一种大肠杆菌异源蛋白表达融合标签的应用

Info

Publication number: CN103667331A
Application number: CN201310669870.3A
Authority: CN
Inventors: 尚广东; 凌文; 张青; 骆希; 杨瑶
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103667331B

Abstract

本发明涉及一种将来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为融合标签的方法。本方法是将来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为融合标签。将六个组氨酸、bet基因、TEV酶切位点和一段填充片段等元件的核苷酸序列克隆至大肠杆菌表达载体pET30a(+)，获得bet基因融合表达载体。待表达的目的基因可通过取代填充片段而与六个组氨酸标签和bet基因在读码框内融合，在大肠杆菌中经诱导而表达获得标签蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。融合表达可大大地提高目的蛋白的可溶性组份比例。

Description

重组酶基因bet作为一种大肠杆菌异源蛋白表达融合标签的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种利用新型的融合标签在大肠杆菌中表达异源蛋白的方法。

背景技术

异源基因在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达以获得足够量和高活性的蛋白是蛋白质药物、分子生物学以及生物化学研究的重要内容。获得高活性蛋白的前提之一是在大肠杆菌内表达的蛋白分泌至细胞间质，即以可溶性的形式存在。可溶性的蛋白经超声破碎后，即释放至缓冲液中，随后可通过亲和层析等方法加以纯化。可溶性的蛋白以正确的折叠形式存在而保持活性。然而许多蛋白，尤其是异源蛋白（如与大肠杆菌种属差别较大的生物尤其是真核生物的基因）常以不可溶性的形式呈现。不可溶性的蛋白存在于包涵体内，其分离纯化需要首先以强离子去污剂变性处理将蛋白从包涵体中释放出来，再以还原剂进行复性，还需透析以去除离子。这种变性和复性的过程不仅仅烦琐耗时，更不利的是损害蛋白的活性、降低蛋白的收率，并对后续的实验产生不良的影响。

有许多方法以提高蛋白可溶性组份占总蛋白的比例，其中将目的蛋白和标签蛋白的融合表达是提高目的蛋白可溶性组份的有效手段。已开发出了一系列融合表达标签，如麦芽糖结合蛋白（mMBP）、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、翻译起始因子（IF2-I）、氮源利用物质A（NusA）、谷胱甘肽转移酶（GST）、伴侣蛋白GroEL、伴侣蛋白DnaK和启动因子（TF）等。但目前的融合标签种类还不足，由于蛋白的特殊性，没有一种通用的融合标签能解决提高所有的异源蛋白的可溶性问题。常常有目的基因难以实现可溶性表达的情形。因此开发新型的表达方式对蛋白质药物的开发以及基础研究均有着重要意义。

发明内容

为了解决现有技术手段的不足，提供更多的融合标签用于目的蛋白的表达。

本发明公开了来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为异源基因在大肠杆菌内进行蛋白表达的融合标签的用途。

本发明构建了以来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为异源基因在大肠杆菌内进行蛋白表达的融合标签的融合蛋白表达载体。即将六个组氨酸序列、bet基因、烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEV）酶切位点和一段填充片段等元件的核苷酸序列融合后，克隆至大肠杆菌表达载体pET30a(+)，获得了bet基因融合表达载体pLS2723。待表达的目的基因可通过取代填充片段而与六个组氨酸标签和bet基因在读码框内融合。重组克隆转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)后，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达标签蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。

在填充片段的5′端设计有NcoI和BamHI酶切位点，3′端保留原载体pET30a(+)上的HindIII、NotI和XhoI酶切位点。外源基因可以选择5′端和3′端酶切位点来进行克隆。由于BsaI和AflIII与NcoI为同尾酶，BglII和BamHI为同尾酶，SaII和XhoI同尾酶，故如外源DNA片段中含有填充片段两侧的酶切位点，也可通过设计同尾酶的酶切位点进行克隆。所纯化的蛋白的可利用6个组氨酸标签以Ni-NTA树脂亲和层析进行分离纯化，纯化的蛋白可以使用专一性很强的TEV蛋白酶酶切使得目的蛋白和Beta标签进行分离。高活性的TEV蛋白酶可以在实验室自制，这就大大地降低了蛋白表达和纯化的成本。此后，可再经过Ni-NTA树脂亲和层析，含6个组氨酸标签的Beta标签蛋白和Ni-NTA树脂结合，而目的蛋白不结合而洗脱。

优选实施例中选择的是来源于猪肾细胞的肾素结合蛋白基因pRnBP和来源于聚胞藻Synechocystis sp.PCC6803的slr1975基因，这两个基因单独表达时不可溶性蛋白占总蛋白的比例极少。而与Beta的融合表达后，可溶性均得以大大提高。pRnBP和Slr1975的生物化学活性均为N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶，此酶是酶法催化合成抗流感引物扎那米韦的关键中间体，高表达量的酶将使得大规模和高产的酶法催化更加简便和快捷。

蛋白表达应用领域广泛，前景广阔，本发明所述的载体可广泛运用与目的基因的表达和通过目的蛋白的可溶性，可应用于工业化生产蛋白质药物以及分子生物学、生物化学和遗传学等基础研究领域。

附图说明

图1是7624个碱基对的bet基因作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体pLS2723的质粒限制性酶切图谱。其中：

219-235是T7启动子序列；

310-327是编码6个组氨酸位点的核苷酸序列；

328-1110是bet基因的开放阅读框序列；

1111-1131是TEV蛋白酶的酶切位点序列，以S表示；

1144-2677是填充片段序列，目的基因取代填充片段后克隆至表达载体；

2699-2716是6个组氨酸位点的核苷酸序列；

2769-2787是T7终止子序列；

2867-3322是单链DNA的功能区域序列；

3415-4230是卡那霉素抗性基因kan的开放阅读框序列；

4325-4940是质粒复制子区域序列；

6370-7452是编码调控蛋白基因的开放阅读框lacI的序列。

NcoI，BamHI，HindIII，NotI和XhoI等用于克隆外源基因的位点以粗体表示，其他的SphI，ClaI，XbaI等为常规标识的限制性酶切位点，括号内的数字表示限制性酶切位点在质粒上的位置。

图2是pRnBP基因表达以及pRnBP基因与bet基因融合表达的SDS-PAGE

（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）图谱。其中：

1.蛋白质分子量标准，大小分别为116.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，25.0kDa，18.4kDa，14.4kDa；

2.pRnBP基因表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLS2314诱导表达的总蛋白；

3.pRnBP基因表达菌株E.coli BL21(DE3)/pL2314诱导表达的可溶性蛋白；

4.pRnBP基因与bet基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLS2375诱导表达的总蛋白；

5.pRnBP基因与bet基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLS2375诱导表达的可溶性蛋白。

图3是slr1975基因表达以及slr1975基因与bet基因融合表达的SDS-PAGE图谱。其中：

2.slr1975基因表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLS2315诱导表达的总蛋白；

3.slr1975基因表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLS2315诱导表达的可溶性蛋白；

4.slr1975基因与bet基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLS2377诱导表达的总蛋白；

6.slr1975基因与bet基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)/pLS2377诱导表达的可溶性蛋白。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：

1.E.coli DH10B。基因克隆宿主菌。基因型：F^-mcrAΔ(mrr-sdRMS-crBC)80lacZΔM15ΔlacX74deoR recA1araD139Δara,leu)697galU galKrpsL endA1nupG。文献：LifeTechnologies,Inc.Focus(1990)12,19。购自美国Invitrogen公司。

2.E.coli BL21(DE3)。蛋白表达宿主菌。基因型：B F^-dcm ompT hsdS(r_B ^-m_B ^-)galλ(DE3)。购自美国Stratagen公司。

3.pBluescript KS(-)。文献：Alting-Mees,M.A.and Short,J.M.(1989)pBluescript II:genemapping vectors.Nucleic Acids Res,17,9494。购自美国Novagen公司。

4.pET30a。大肠杆菌表达载体。购自美国Novagen公司。

实施例

实施例1.pRnBP表达载体的构建和在大肠杆菌的诱导表达

设计引物PR1：5′-GGGGGATCCATGGAGAAGGAGCGCGAAAC-3′，（SEQ ID NO.1），PR2：5′-GGGAAGCTTCTAGGCGAGGCGGCTCAGCAG-3′，（SEQ ID NO.2），引入的BamHI和HindIII酶切位点以下划线表示。以猪肾细胞的mRNA为模板，PR1和PR2逆转录PCR扩增得到1266bp的猪的肾素结合蛋白基因pRnBP。DNA片段以BamHI和HindIII酶切后，与大肠杆菌表达载体pET30a(+)的BamHI和HindIII酶切的载体于16℃连接，连接产物转化E.coli DH10B的感受态细胞，在30μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选重组克隆。重组克隆经酶切和测序验证其序列正确后，命名为pLS2314。pLS2314转化E.coli BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，His-hRnBP表达的蛋白大小为53.1kDa，与预期相符，但BandScan分析蛋白的可溶性比例在5%以下，SDS-PAGE的结果见图2。

实施例2.slr1975表达载体的构建和在大肠杆菌的诱导表达

设计引物SL1：5′-GGGGGATCCATGATTGCCCATCGCCGTCAG-3′，（SEQ ID NO.3），SL2：5′-GGGAAGCTTTTAACTAACCGGAAGTTGGAG-3′，（SEQ ID NO.4），引入的BamHI和HindIII酶切位点以下划线表示。以聚胞藻Synechocystis sp.PCC6803的基因组DNA（来源自德国University of Rostock的Martin Hagemann教授）为模板，PCR扩增得到1176bp的slr1975基因。DNA片段以BamHI和HindIII酶切后，按照上述的克隆方法，克隆至pET30a(+)的BamHI和HindIII位点，经酶切和测序正确，获得重组克隆pLS2315。pLS2315转化E.coliBL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，His-Slr1975表达的蛋白大小为51.0kDa，与预期相符，但BandScan分析蛋白的可溶性比例在10%以下，SDS-PAGE的结果见图3。

实施例3.bet为融合标签的融合表达载体的构建

设计引物STF1：5′-GAAGGATCCTCACAGGCTTCCGACGACCTC-3′，（SEQ ID NO.5），STF2：5′-GAAAAGCTTGCTTCCGCCAGGCCCTCGACC-3′，（SEQ ID NO.6），引入的BamHI和HindIII酶切位点以下划线表示。以Streptomyces peucetius ATCC29050基因组DNA为模板，PCR扩增出阿霉素生物合成基因簇dnrI和dnrI基因区域（GenBank登录号M80237）的1560bpDNA片段。DNA片段以BamHI和HindIII酶切后，按照上述的克隆方法，克隆至pBluescriptKS(-)的BamHI和HindIII位点，经酶切和测序正确，获得重组克隆pLS2321。pLS2321用作填充片段载体。

设计引物R471F：5′-GGGGAATTCATATGCACCATCATCATCATCACATGAGTACTGCACTCGCAACGC-3′，（SEQ ID NO.7），EcoRI和NdeI酶切位点以下划线表示，编码6个组氨酸的核苷酸序列以斜体表示；R471R：5′-GAAGGATCC CATGGCGCCCTGAAAATAAAGATTCTCTGCTGCCACCTTCTGCTCTGC-3′，（SEQ ID NO.8），BamHI和NcoI酶切位点以下划线表示，编码TEV酶切位点的核苷酸序列以斜体表示。以lambda噬菌体的基因组DNA（购自大连宝生物生物技术公司）为模板，PCR扩增得到0.8kb的含6个组氨酸碱基、bet基因和TEV酶切位点DNA片段。DNA片段以EcoRI和BamHI酶切后，同上方法克隆至pBluescript KS(-)的EcoRI和BamHI酶切位点，经酶切和测序正确，获得重组克隆pLS2372。

pLS2372以NdeI和BamHI酶切后，分离0.8kb的DNA片段；pLS2321以BamHI和HindIII酶切后，分离1.5kb的DNA片段。两个DNA片段和以NdeI和HindIII酶切并经碱性磷酸酯酶处理的pET30a(+)提高三片段连接，经酶切正确，获得重组克隆pLS2373。pLS2373即为含6个组氨酸碱基、bet基因和填充片段（这三个元件在读码框内融合）以及填充片段的克隆载体。

实施例4.bet-pRnBP融合表达载体的构建及融合表达

pLS2314以BamHI和HindIII酶切后，分离1.2kb的pRnBP基因片段，与6.1kb pLS2373以BamHI和HindIII酶切的载体相连，转化E.coli DH10B，重组克隆经酶切验证正确后，获得bet-pRnBP融合表达载体pLS2775。pLS2375转化E.coli BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，His-Beta-pRnBP表达的蛋白大小为79.6kDa，与预期相符，SDS-PAGE的结果见图2。BandScan分析可溶性蛋白比例在80%以上，可见pRnBP和融合标签Beta融合表达后，可溶性蛋白的比例得到了显著的提高。

实施例5.bet-slr1975融合表达载体的构建及融合表达

pLS2315以BamHI和HindIII酶切后，分离1.2kb的pRnBP基因片段，与6.1kb pLS2373以BamHI和HindIII酶切的载体相连，转化E.coli DH10B，重组克隆经酶切验证正确后，获得bet-pRnBP融合表达载体pLS2777。pLS2377转化E.coli BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，His-Beta-Slr1975表达的蛋白大小为77.4kDa，与预期相符，SDS-PAGE的结果见图3。BandScan分析可溶性蛋白比例在70%以上，可见Slr1975和融合标签Beta融合表达后，可溶性蛋白的比例显著提高。

从这两个实施例可见，Beta可作为一个非常好的标签来进行融合蛋白的表达来使用。

Claims

1.来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为异源基因在大肠杆菌内进行蛋白表达的融合标签的用途。

2.一种在大肠杆菌内进行蛋白表达方法，其特征在于，以来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为融合标签；具体是将六个组氨酸、bet基因、TEV酶切位点和一段填充片段元件的核苷酸序列融合后，克隆至大肠杆菌表达载体pET30a(+)，获得bet基因融合表达载体pLS2723；待表达的目的基因通过取代填充片段而与六个组氨酸和bet基因在读码框内融合；重组克隆转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)后，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达标签蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。

3.一种用于权利要求1所述用途的融合表达载体，是将六个组氨酸、bet基因、TEV酶切位点和填充片段克隆至大肠杆菌表达载体pET30a(+)而获得。