CN110004169A

CN110004169A - 一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用

Info

Publication number: CN110004169A
Application number: CN201910287012.XA
Authority: CN
Inventors: 王会征; 兰玉彬; 韩鑫
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供一种按常规表达方法较难溶蛋白质Pl101的表达、纯化方法及其纯蛋白的应用。表达方法是选用pMAL表达载体，通过连接麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein，MBP）标签增加目标蛋白的溶解性，进而表达出可溶解重组蛋白。通过亲和层析纯化的方法获得重组纯蛋白MBP‑Pl101，蛋白酶切除麦芽糖结合蛋白标签，获得可溶性纯蛋白Pl101。对纯蛋白进行酶活测定及结晶性实验，结果表明经此方法表达、纯化出的纯蛋白Pl101具较高酶活性及结晶性。本发明方法快速、简便、有效地获得具生物学活性的目标蛋白，缩短了纯化流程，降低了纯化成本，为难溶蛋白尤其是有结晶等下游操作需求的蛋白表达、纯化提供了技术借鉴。

Description

一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供一种按常规表达方法较难溶蛋白质Pl101的表达、纯化方法及其纯蛋白的应用。具体地说，本发明涉及一种源于辣椒疫霉菌的果胶裂解酶Pl101通过pMAL表达载体表达、纯化方法，且所获纯蛋白Pl101具较高酶活性及结晶性。

背景技术

外源基因在原核细胞中表达时，尤其是在大肠杆菌中高效表达时，易形成由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，即包涵体。包涵体的形成是比较复杂的，主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等。功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型，而包涵体内的蛋白是非结晶、无定形的非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。

包涵体的形成对重组蛋白的纯化及酶活测定等下游生化实验的进行带来了很大的障碍，常规实验方法是将包涵体彻底溶解，通过6-8M盐酸胍或8-10M尿素等变性剂变复性的手段获得可溶性蛋白，而上述方法一个不容忽视的问题是蛋白质的收率较低或易造成蛋白的失活等，且纯化成本较高。一种快速、简便且有效纯化包涵体或难溶性蛋白的方法对开展蛋白质组学、酶学尤其是蛋白质晶体学等相关实验可提供有力的技术支持。

亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具，具有结合特异性高、洗脱条件温和、纯化倍数高等显著优点。然而常用的多聚组氨酸（6-His）、谷胱甘肽硫转酶（GST）等标签对包涵体蛋白、难溶蛋白的增溶效果较差，且通过变复性或添加增溶剂的方式不利于对所获纯蛋白开展蛋白质晶体学等相关实验。使用对难溶蛋白增溶效果较好的麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein，MBP）标签进行相关纯化利于开展蛋白结晶等下游实验。

果胶裂解酶（Pectate lyase，Pl）为辣椒疫霉菌（Photophthora capsici）等植物病原菌的重要细胞壁降解酶，属植物病原菌的关键致病因子，通过降解寄主细胞壁来增强病原菌对寄主的亲和力，从而引起致病。Pl能够降解植物细胞壁中的果胶，对病原菌侵染寄主植物具重要作用。研究发现，Pl对甲酯化的果胶分子亲和力较高，通过β-消除的方式裂解甲酯基的α-1，4糖苷键，生成在非还原末端的C4和C5位置有不饱和双键的半乳糖醛酸。对果胶裂解酶Pl的功能研究已成为分子植物病理学的热点科学问题。

蛋白质功能特性均通过其肽链上特异氨基酸功能基团实现完成，而蛋白质三级结构通过特异性折叠等形成的特定分子结构，决定了不同氨基酸残基的空间分布与结构位置，因此立足蛋白结构生物学研究，更易于探明Pl遗传本质与调控机理。而蛋白结构生物学研究的提前是获得目的蛋白晶体，即通过基因、表达纯化后获得纯蛋白进行结晶实验。

对Pl开展晶体学研究的一个前提是获得目标基因及其纯蛋白，本发明即是在前期研究基础上，对克隆自辣椒疫霉菌的一个Pl基因Pl101进行了原核表达，在尝试了几种常规表达载体（pET-28a、pET-22b等）均为包涵体蛋白不利于下游纯化实验后，摸索到一种快速、简便、有效地获得目标蛋白Pl101可溶性表达及纯化的方法，即选用pMAL表达载体，通过连接麦芽糖结合蛋白标签增加目标蛋白的溶解性，进而表达出可溶解重组蛋白。通过亲和层析纯化的方法获得重组纯蛋白MBP-Pl101，蛋白酶切除麦芽糖结合蛋白标签，获得可溶性纯蛋白Pl101。并对纯蛋白Pl101进行了酶活性及结晶性实验等，证明通过本方法获得的纯蛋白具较高酶活性及良好结晶性，对相关蛋白开展酶学、晶体学、结构生物学等研究提供了技术支持与借鉴。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用，以解决相关技术问题。该方法可快速、简便、有效地纯化难溶蛋白且通过该方法所获纯蛋白具较高酶活性及结晶性，解决了难溶蛋白难纯化或纯化得率低、纯化后蛋白无活性或活性低、无结晶性或结晶性能差的技术问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法及其应用，难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法包括有下列步骤：

A：将按常规方法表达为难溶蛋白的靶基因Pl101构建pMAL-p4X原核表达体系，转化大肠杆菌（表达菌株E. coli BL21 (DE3) pLysS）诱导表达出融合蛋白MBP-Pl101，确定的融合蛋白MBP-Pl101诱导表达条件为：诱导温度16℃，诱导剂IPTG终浓度为1mM/L，诱导时间16h；融合蛋白含一个编码麦芽糖MBP（分子量约42kDa）的malE标签基因，为亲和层析所用；

B：实验证明表达出的融合蛋白MBP-Pl101在常规缓冲液A（10mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇）中即可溶，选用淀粉树脂（Amylose Resin）凝胶介质进行亲和层析纯化，并对洗杂液、洗脱液进行不同条件的优化，经实验确定的两种洗杂液分别为缓冲液B（10mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，0.5%(v/v)吐温-20）、C（10mMTris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，1%(v/v) triton-100），洗脱液为缓冲液D（110mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，10mM麦芽糖），洗脱获得重组纯蛋白MBP-Pl101；

C：重组纯蛋白MBP-Pl101用人鼻病毒3C蛋白酶（目标蛋白与酶质量比50：1）将亲和标签麦芽糖结合蛋白MBP切除获得Pl101纯蛋白，纯蛋白经透析袋4℃低温透析的方法将最终缓冲液替换为缓冲液A（10mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇），Pl101纯蛋白经Western blotting杂交验证。

所述纯蛋白Pl101采用底物聚半乳糖醛酸反应法测定的酶活性为860U/mg。

所述纯蛋白Pl101采用气相扩散、坐滴法测定其具良好的结晶性能。

所述融合蛋白MBP-Pl101纯化（菌液破碎、亲和层析挂柱、洗杂、洗脱、透析等）时间以控制在12h以内为宜，以防时间过长蛋白沉淀或变性。

所述融合蛋白MBP-Pl101酶切后所得纯蛋白Pl101体外酶活性测定及结晶实验等以酶切后立即使用为宜，不建议使用冷冻蛋白或长时间放置后蛋白，以免目标蛋白切除MBP标签后影响蛋白活性或结晶性。

所述缓冲液用试剂等在纯化过程纯度等级为分析纯即可，不影响蛋白纯化流程及下游活性实验等。

所述缓冲液用试剂等在结晶过程纯度等级应为超纯等级，否则可能影响蛋白的结晶。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：（1）与常规难溶蛋白纯化需借助包涵体蛋白变复性纯化手段相比，本发明借助pMAL表达载体通过连接麦芽糖结合蛋白标签MBP增加目标蛋白的溶解性，进而快速、简便表达出可溶解重组蛋白；（2）本发明蛋白纯化全程所用试剂为常规试剂，价格低且易获取，全程所用时间较短，较常规难溶蛋白（包涵体）纯化更快速、简便；（3）经本发明方法纯化所得纯蛋白具较高蛋白酶活性及良好结晶性，解决了难溶蛋白难纯化或纯化得率低、纯化后蛋白无活性或活性低、无结晶性等常见技术问题，值得推广与应用。

附图说明

图1.pMAL体系原核表达融合蛋白MBP-Pl101与亲和层析纯化

图中M：标准蛋白Marker；1：融合蛋白MBP-Pl101诱导前；2：融合蛋白MBP-Pl101 IPTG诱导后；3：亲和层析纯化后所得融合蛋白MBP-Pl101。箭头所示为86kDa融合蛋白MBP-Pl101，包含一个42kDa的MBP蛋白和44kDa的Pl101。

图2.蛋白酶切后所得纯蛋白Pl101与验证

图中(A) M：标准蛋白Marker；1：纯蛋白Pl101；(B) Western blotting杂交验证纯蛋白Pl101。

图3.纯蛋白Pl101初始蛋白晶体。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细说明。

本发明所提供的实施例，除特殊说明外，均按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989），或Draper，J 等（Blackwell 科学出版社，1988）所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。具体如下：

Pl101基因表达

Pl101基因为本研究室从辣椒疫霉菌菌株SD33上克隆获得。提取表达载体pMAL-p4X质粒备用；经PCR扩增后的Pl101基因通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收后待用。

将基因和载体质粒进行双酶切，酶切体系为：

Pl101基因 10-20mg pMAL质粒 10-20mg

10×Buffer 10μL 10×Buffer 10μL

BamHI 4μL BamHI 4μL

EcoRI 4μL EcoRI 4μL

MQ to 100μL MQ to 100μL

Total 100μL Total 100μL

混合后于37℃水浴酶切4h以上，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收，待用。

基因和载体进行连接转化：

酶切后pMAL 1-3μL

酶切后Pl101基因 5-7μL

Solution I 1μL

Total 10μL

于16℃水浴连接反应 4h后进行转化。

转化步骤：

取连接产物10μL加入到100μL DH5α感受态细胞中，放入42℃水浴中热激90sec，快速放入冰水中2min；加入800μL不含抗生素LB培养基，37℃水浴1h以上；12000转/分离心2min，吸弃大部分上清培养基，剩余约100μL吹打悬浮沉淀；涂布含有氨苄抗生素的LB琼脂平板，倒置平板37℃培养过夜。

重组质粒鉴定：

从每一个培养平板上分别挑出五个菌落，接入5ml的LB培养基中，培养过夜，提取质粒备用。

PCR鉴定：取1μL质粒按前述基因扩增体系和步骤进行PCR，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。

双酶切鉴定：按前述载体双酶切体系和步骤，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。

测序鉴定：将PCR扩增产物和阳性菌落扩大培养后提取的质粒送测序公司测序检测。

目的蛋白试表达：

将阳性重组质粒转化表达宿主BL21(DE3)，涂于氨苄（100mg/L）抗性平板。具体表达流程为：

(1)从LB平板上分别挑取5个单克隆菌落，接入含5ml LB（氨苄抗性50mg/L）的15ml离心管中，于37℃震荡培养OD值至0.6-0.8之间。

(2)每一个试管各取500μL菌液和15％的甘油1：1(v/v)混合后装至灭菌冻存管中，零下80℃保存。

(3)每一个试管中取500μL菌液，做为诱导前对照。

(4)每一个试管中加入5μL IPTG（终浓度为1mM/L），37℃ 200rpm诱导表达4h。

(5)诱导结束后分别取500μL的菌液，与诱导前菌液12000rpm共离心2min。

(6)弃掉上清，分别加入10μL 5×样品缓冲液，于100℃加热5min变性，上样前12000 rpm离心5min。

(7)15％SDS-PAGE 电泳分析表达结果。

蛋白表达条件优化：

在确定蛋白正常重组表达后，继续优化高效表达条件，在温度、诱导剂剂量、时间等进行优化筛选，确定重组蛋白MBP-Pl101最佳表达条件为：诱导温度16℃，诱导剂IPTG终浓度为1mM/L，诱导时间16h。

重组蛋白纯化

挑取阳性克隆，接种至含50mg/L氨苄霉素的10ml LB培养基中，37℃震荡培养过夜至OD600=0.6-0.8，然后按1：100接种至含50mg/L氨苄霉素的1L LB培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.6-0.8。按照前述优化的表达条件进行，即冷却至16℃后，添加IPTG至1mM/L，培养16h，然后5000 rpm离心6min收集菌体，待用。

实验证明表达出的融合蛋白MBP-Pl101在常规缓冲液A（10mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇）中即可溶（图1），选用淀粉树脂（Amylose Resin）凝胶介质进行亲和层析纯化。具体纯化流程为：

(1)菌液破碎。取重组蛋白MBP-Pl101菌液50 ml，加入缓冲液A（10mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇）进行菌液破碎。菌液在超声波破碎仪冰水浴下于300W条件下超声30min（超声3s间歇3s）后，15000 rpm离心20min，吸取上清待用，上清液进行SDS-PAGE分析，确定目的蛋白以可溶的方式存在于上清液中。

(2)亲和层析挂柱。取3ml淀粉树脂（Amylose Resin）凝胶介质加至纯化柱中，用缓冲液A冲洗2-5个柱体积，将菌液超声破碎离心后的上清液过纯化柱3次以上，再进行洗杂。

(3)洗杂。先用基本缓冲液A洗杂200ml左右，然后依次用缓冲液B（10mM Tris-HClpH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，0.5%(v/v)吐温-20）、C（10mM Tris-HCl pH7.5，150mMNaCl，5mM β-巯基乙醇，1%(v/v) triton-100）分别洗杂100ml左右。

(4)洗脱。用缓冲液D（110mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，10mM麦芽糖）洗脱10ml左右，SDS-PAGE分析结果显示蛋白纯度达90%以上，获得重组纯蛋白MBP-Pl101（图1）。蛋白浓度用Bradford方法测定，测定蛋白浓度为0.621mg/ml。

(5)酶切。重组纯蛋白MBP-Pl101用人鼻病毒3C蛋白酶（目标蛋白与酶质量比50：1，即10ml重组蛋白需用0.124mg蛋白酶）将亲和标签麦芽糖结合蛋白MBP切除，重新过淀粉树脂凝胶亲和层析柱，酶切下的麦芽糖结合蛋白MBP挂在柱子上，流穿液即为Pl101纯蛋白（图2），纯蛋白经透析袋4℃低温透析的方法将最终缓冲液替换为缓冲液A（10mM Tris-HClpH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇），Pl101纯蛋白经Western blotting杂交验证（图2）。

纯蛋白酶活测定

对所获纯蛋白Pl101进行体外酶活性测定，采用的是底物聚半乳糖醛酸反应法，具体步骤为：取纯蛋白Pl101 20ul加入980ul反应体系中（含0.2% (v/v)聚半乳糖醛酸、100mMTris-HCl pH8.5，1mM CaCl₂），在40℃下反应10min；加入250ul 50mM HCl终止反应；通过紫外分光光度计检测232nm 波长下吸光值的变化测得的最终酶活为860U/mg。

纯蛋白结晶实验

对获得的纯蛋白Pl101进行浓缩，终浓度在2.5mg/ml左右，采用气相扩散、坐滴法进行蛋白结晶实验，选用Hampton Research试剂盒Crystal ScreenⅠ和Ⅱ、PEG/Ion Screen TM、Salt RxTM1等进行晶体生长条件初筛，筛选适宜Pl101晶体生长的蛋白浓度梯度、pH值、温度因子等，最终在16℃，100mM HEPES pH7.5，10%(w/v) PEG6000，5%(v/v) 2-甲基-2，4戊二醇结晶条件下获得Pl101初始蛋白晶体（图3）。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以显示和描述本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点，所属领域的普通技术人员应当了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用，包括：

一种难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法及其应用，其特征在于，难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法包括有下列步骤：

2.根据权利要求1所述的一种难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法及其应用，其特征在于：所述纯蛋白Pl101采用底物聚半乳糖醛酸反应法测定的酶活性为860U/mg。

3.根据权利要求1所述的一种难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法及其应用，其特征在于：所述纯蛋白Pl101采用气相扩散、坐滴法进行蛋白结晶实验，在100mM HEPES pH7.5，10%(w/v) PEG6000，5%(v/v) 2-甲基-2，4戊二醇结晶条件下获得Pl101初始蛋白晶体。