CN103819563A - 融合蛋白MBP-Eppin、蛋白Eppin及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“融合蛋白MBP-Eppin、蛋白Eppin及其制备方法”，属于生物技术领域。本发明构建了一个表达载体，在MBP与目标蛋白之间设置有凝血酶酶切位点He-Glu-Gly-Arg，使得蛋白Eppin以MBP融合蛋白MBP-Eppin的方式在胞内高效表达，可以大大提高表达产物的产量与可溶性。而又可以有效从MBP融合蛋白中释放出来。通过大量的实验，摸索得到最佳条件，从而使Eppin蛋白以高效、可溶的方式在大肠杆菌中表达。同时显示诱导后纯化的融合蛋白和酶切后的Eppin蛋白均有出现明显的免疫印迹条带。由此可见，重组Eppin蛋白具有良好的抗原性。

Description

融合蛋白MBP-Eppin、蛋白Eppin及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是步及融合蛋白MBP-Eppin、蛋白Eppin及其制备方法。

背景技术

当今人口爆炸和非计划妊娠是世界范围普遍现象，人口问题已成为影响人类生存、经济及环境可持续发展的重要因素，因此避孕节育成为全球研究热点。现行的避孕手段如宫内节育器、药物避孕主要针对女性，而男性的避孕手段基本局限于传统的阴茎套避孕，但都有其局限性，因此迫切需要开发一种更方便、安全、高效、价廉的避孕方法(O’Rand MG,WidgrenEE,Wang Z,et al.Eppin:an effective target for male contraception[J].Mol CellEndocrinol,2006,250(1-2):157-162.)。

研究发现人类附睾蛋白酶抑制剂－－Eppin，是男性免疫避孕的一个重要靶点，于2001年首次被发现（Richardson RT,Sivashanmugam P,Hall SH,et al.Cloning and sequencing of humanEppin:a novel family of protease inhibitors expressed in the epididymis and testis[J].Gene,2001,270(1-2):93-102.），编码Eppin的基因位于人类第20号染色体，翻译产物为一分泌型蛋白，共133个氨基酸，其第1-21个残基为信号肽。成熟蛋白含14个半胱氨酸，形成7对二硫键，经预测其结构含Kunitze和Wap型4个二硫键所构成的结构基序，该基因在睾丸及附睾中优势表达(Richardson RT,Sivashanmugam P,Hall SH,et al.Cloning and sequencing of human Eppin:a novelfamily of protease inhibitors expressed in the epididymis and testis[J].Gene,2001,270(1-2):93-102.Adam CLUSS,Hans LILJA and Ake LUNDWALL,et al.A locus on human chromosome20containsseveral genes expressing protease inhibitor domains with homology to whey acidicprotein[j].Biochemcal Society,2002,368:233-242.Perumal Sivashanmugam,Susan H,Hall,KatherineG,et al.Characterization of mouse Eppin and a gene cluster of similar protease inhibitors on mousechromosome2[J].Gene,2003,312:125-134.)。O’Rond等人的动物实验用重组Eppin免疫雄性狐猿，9只狐猿中的7只（78%）精子活动力下降且血液中出现较高滴度抗Eppin抗体，从而导致不孕；当免疫停止，7只狐猿中的5只（71%）恢复生育能力（O’Rand MG,Widgren EE,SivashanmugamP,et al.Reverible immunocontraception in male monkeys immunized witheppin[J].Science,2004,306(5699):1189-1190.）。王增军等人研究表明正常射精后精子表面及精浆中的Eppin与精囊的精子凝固蛋白Semenogelin(Sg)结合，从而不仅维持精液微环境，免受女性阴道环境的损伤，还调节前列腺分泌的丝氨酸蛋白激酶前列腺特异性抗原（PSA）水解其生理底物Sg(Wang Z,Zhang W,Feng N,et al.Molecular mechanism of epidymal protesase inhibitormodulating the liquefaction of human semen[J].Asian J Androl,2008,10(5):770-775.)，保证精子液化后获得足够动能，而Eppin抗体干扰了Eppin与Sg的结合，从而导致免疫性不育（WangZ,Widgren EE,Sivashanmugam P,et al.Association of eppin with semenogenlin on humanspermatozoa[J].Biology of reproduction,2005,72(5):1064-1070.王增军，附睾蛋白酶抑制剂Eppin的研究进展.中华男科学杂志[J]，2007,13（2):168-170.）。

因此，Eppin有望成为人类有效可行性的避孕疫苗抗原靶点，但目前对于Eppin蛋白结构及生物学功能认识尚浅，Eppin抗体干扰Eppin与Sg结合而引起免疫避孕的机制还有待进一步深入研究。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明通过构建Eppin原核表达体系，经优化后成功获得可溶蛋白表达，经酶切可以得到目的蛋白Eppin，为深入研究相关免疫避孕机制奠定了坚实的基础。

融合蛋白，命名为MBP-Eppin，其特征在于，蛋白MBP与蛋白Eppin之间插入有thrombin酶切，在蛋白Eppin的羧基端插入有组氨酸标签。

编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

上述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）大肠杆菌表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)的制备：扩大培养表达菌株Rossetta12(DE3)，提取其中的pRARE2质粒，转化于表达菌株OrigamiB(DE3)，从含有15μg/ml卡那霉素、12.5μg/ml四环素、34μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上挑取单克隆菌落扩大培养后制成表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)，保存于-80℃；

（2）Eppin基因克隆和表达载体的构建：从Eppin菌种中提取DNA作为模板，PCR扩增，将PCR产物回收、酶切、连接后，克隆到pMALc原核表达载体上，筛选所获得的阳性克隆，扩大培养后提取质粒pMALc-Eppin，PCR验证，测序，

所述PCR扩增时引物为：上游引物S1:5’CGGGATCCCCTGGTCTGACTGAT3’;

下游引物S2:5’CTAGCTAGCGGGAAAGCGTTT ATT3’；

（3）融合蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒pMALc-Eppin转化表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)，扩大培养后将菌液接种于的表达培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.6，降温至22.5℃后按终浓度0.1mM加入IPTG诱导表达，22.5℃震荡培养过夜。离心，收集细菌沉淀，重悬于缓冲液1中，高压破碎菌，取诱导后上清液，

所述1升表达培养基的组成为15μg/ml卡那霉素+12.5μg/ml四环素+50μg/ml氨苄青霉素+34μg/ml氯霉素+10g蛋白胨+5g酵母+5g氯化钠+2g葡萄糖，其余为双蒸水；

所述缓冲液1为加入有500mM NaCl+20mM咪唑的50mM Tris-HCl，pH8.0。

所述制备方法还包括融合蛋白的纯化步骤，所述纯化步骤依次包括将上清液用Ni-NTA亲和层析柱纯化，和亲和层析柱的洗脱液于Superdex20016/60柱进行分子筛层析纯化。

所述Ni-NTA亲和层析柱进行纯化时用缓冲液1冲洗去其他蛋白后，用缓冲液2洗脱融合蛋白，所述缓冲液2为加入有500mM NaCl+20mM咪唑的50mM Tris-HCl，pH8.0。

所述分子筛层析纯化时用缓冲液3洗脱，所述缓冲液3为加入有500mM NaCl的50mMTris-HCl，pH8.0。

蛋白Eppin的制备方法，包括如下步骤：

（1）获得上述融合蛋白MBP-Eppin，

（2）使用牛血清thrombin酶切，得到15kD左右的Eppin蛋白。

所述融合蛋白MBP-Eppin采用上述制备方法获得。

正确二硫键配对对于稳定蛋白质构象和保持蛋白质活性方面起着至关重要的作用，二硫键错误配对将引起多肽错误折叠从而发生不溶性聚集（许成刚，范晓军等人，二硫键的形成与蛋白质的氧化折叠[J].中国生物工程杂志，2008,28（6S）：259-264.J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔，分子克隆实验手册，3版，北京：科学出版社，2002：1224-1249.）。由于Eppin蛋白含有多达7对二硫键，如何解决二硫键正确形成问题是本研究的难点。在之前的报道中，Eppin多以包涵体形式表达（申子刚，陈正琼等人，人Eppin蛋白的基因克隆及原核表达[J].免疫学杂志.2009,25（6）：662-665.孙黎黎，易维京等人，人Eppin基因的原核表达及抗原性鉴定[J].中国男科学杂志，2010,24（4）：7-10.）。本发明曾尝试载体pET22b，希望利用其自带的原核分泌信号肽使Eppin以可溶形式分泌至大肠杆菌周质空间中，但结果仍得到包涵体表达。此外也曾尝试使用带有融合蛋白DSBc的载体pET40b，期望通过DSBc的二硫键异构酶活性改善Eppin蛋白的溶解性，避免形成包涵体，但仍并未见明显改善。在随后的优化过程中，我们又尝试了多种表达载体／宿主菌组合，如pMALc质粒与表达菌株Rossetta2(DE3)、OrigamiB(DE3)的组合；同时，我们还优化了超声破碎、细菌周质空间破碎与高压破碎等不同的蛋白释放方式。经过反复实验，尝试了多种表达系统与诱导／提取方法之后，终于获得可溶表达Eppin蛋白的最佳方案。其中的关键之处可以概括为以下3个方面：1、表达载体选择：pMALc质粒上提供的tac启动子与麦芽糖结合蛋白（MBP）基因使得目的基因以MBP融合的方式在胞内高效表达，通常可以大大提高表达产物的产量与可溶性。而MBP与目标蛋白之间的凝血酶酶切位点He-Glu-Gly-Arg又可以有效从MBP融合蛋白中释放出来。2、表达菌株的选择：Rossetta2菌株提供了7种与大肠杆菌稀有密码子对应的tRNA，可非常有效地改善由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达的情况；而OrigamiB菌株包含硫氧还蛋白还原酶和谷氧还蛋白还原酶的突变基因，造成细胞内形成氧化环境，有利于二硫键形成。在综合考虑以上两种表达菌株的优劣之后，制备了Rossetta2-OrigamiB(DE3)。实验证明该菌株对于改善重组Eppin蛋白的可溶性至关重要。3、IPTG浓度与诱导温度：高诱导物浓度与和高诱导温度都易引起细菌的生物合成系统过载，从而导致融合蛋白过快表达，来不及正确折叠而聚集形成包涵体。但IPTG浓度和温度过低则引起低水平表达或蛋白不表达，因此最佳的诱导剂浓度和生长速度是蛋白高效、有序表达的关键，本研究通过大量的实验，摸索得到最佳条件，从而使Eppin蛋白以高效、可溶的方式在大肠杆菌中表达。

附图说明

图1Eppin基因PCR产物电泳结果，

其中M)2000DNA标准量，1）Eppin聚合酶链式反应扩增产物，

图2重组表达质粒的PCR验证

其中M1）2000DNA标准量，1）Eppin聚合酶链式反应扩增产物，2)pMALc-Eppin利用聚合酶链式反应扩增Epppin，M2）15000DNA标准量，

图3Eppin蛋白诱导表达，

其中M1、M2)蛋白标准量1）诱导前pMALc载体沉淀，2）诱导前pMALc-Eppin沉淀，3）诱导后pMALc空载体沉淀，4）诱导后pMALc-Eppin沉淀，5）诱导后pMALc空载体上清，6）诱导后pMALc-Eppin上清，

图4Superdex200分子筛层析图谱，

图5重组Eppin蛋白纯化与酶切，

M)蛋白标准量，1）纯化的MBP-Eppin蛋白，2）纯化的MBP-Eppin蛋白酶切3h，3）MBP-Eppin纯化蛋白酶切16h，

图6重组Eppin蛋白Western Blot检测，

1）诱导前蛋白，2）纯化的MBP-Eppin蛋白，3）纯化的MBP-Eppin蛋白酶切后。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

1、材料与方法

1.1菌种和质粒大肠杆菌克隆菌株JM109和表达菌株Rossetta2(DE3)由本申请人的实验室保存、表达菌株OrigamiB(DE3)购自Novagen。质粒pMALc来源于LikeBio Biotech基因快速高效表达试剂盒。

1.2主要试剂和材料引物由上海生工公司合成；高保真Taq酶为Takara公司产品；T4DNA连接酶及限制性内切酶BamHI、NheI均购于New England Biolabs；凝胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自Omega公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、考马斯亮蓝染色液（常规法）为碧云天公司产品；蛋白分子标准量购自Thermo公司。Eppin多克隆抗体购于Santa Cruise，Eppin菌种保存于本实验室，可以对公众发放。

1.3大肠杆菌表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)的制作

扩大培养表达菌株Rossetta12(DE3)，提取其中的pRARE2质粒，转化于表达菌株OrigamiB(DE3)，从而改善了由于密码子使用频率不同而引起的真核蛋白低表达，从含有15μg/ml卡那霉素、12.5μg/ml四环素、34μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上挑取单克隆菌落扩大培养后制成表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)，保存于-80℃。

1.4Eppin基因克隆和表达载体的构建

为了将扩增的Eppin克隆片段插入载体的特定位置，在PCR特异性的引物两端分别加入BamH I、Nhe I的酶切位点和相应的保护碱基。根据NCBI上提供的人Eppin cDNA序列（如SEQ ID NO1），设计上下游引物。上游引物S1:5’CGG GAT CCC CTG GTC TGA CTG AT3’;下游引物S2:5’CTA GCT AGC GGG AAA GCG TTT ATT3’。PCR的反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸1min扩增35个循环，72℃延伸10min。反应结束后进行电泳，并用BamHI、NheI分别酶切PCR产物和pMALc质粒，将回收的目的片段与pMALc大片段用T4DNA链接酶4℃连接过夜。转化于克隆菌株JM109，从含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取单克隆菌落行扩大培养后提取质粒，送Invitrogen公司测序(英峻公司）

1.5融合蛋白的诱导表达

测序正确的重组质粒转化到表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)。扩大培养后取2ml菌液接种于1L的表达培养基（含15μg/ml卡那霉素、12.5μg/ml四环素、50μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素）中，37℃震荡培养至OD值为0.6，降温至22.5℃后按终浓度0.1mM加入IPTG诱导表达，22.5℃震荡培养过夜。于4℃，8500×g离心10min，收集细菌沉淀，重悬于200ml含50mM Tris-HCl，pH8.0,，500mM NaCl，20mM咪唑的缓冲液中，高压破碎菌，取诱导前后上清液，以浓度为12%的分离胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)。

1.6融合蛋白的纯化

1.6.1Ni-NTA亲和层析纯化取步骤5收集的上清液，利用重组表达载体在Eppin羧基端插入的组氨酸标签，用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，使带有暴露的6×His的融合蛋白结合于固化的Ni树脂。用50mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑的缓冲液冲洗去其他蛋白后，用含200mM咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。于4℃，5000×g离心30min，以1:6体积行浓缩后上样于Superdex20016/60柱（GE Healthcare）进行分子筛层析。

1.6.2分子筛层析纯化取Ni-NTA亲和层析收集洗脱峰后的上清，收集洗脱峰。用BCA法测定纯化前后蛋白浓度。

1.7重组Eppin蛋白的酶切及质谱分析

将纯化后的蛋白以0.04mg/ml的浓度加入Thrombin酶，4℃酶切16h过夜，以15%的分离胶行SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色后切下蛋白条带送第三军医大学中心实验室行质谱分析。

1.8重组Eppin蛋白的Western印迹分析

将重组Eppin蛋白及酶切后的蛋白进行SDS电泳，凝胶浓度为12%。电泳后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，以诱导前的重组菌蛋白作为阴性对照，进行Western blot印迹分析。一抗为兔抗人Eppin（1:5000稀释），二抗为辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔（1:10000稀释），采用ECL化学发光法显影。

2、结果

2.1Eppin基因的克隆及表达载体的构建

从本实验室保存Eppin菌种中提取DNA作为模板，PCR扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可见一约300bp左右的条带，大小与理论预测相符（图1）。将PCR产物回收、酶切、连接后，克隆到pMALc原核表达载体上，筛选所获得的阳性克隆，扩大培养后提取质粒，取少量重组质粒进行PCR验证，得到PCR产物与原Eppin菌种PCR产物大小一致的片段，表明Eppin基因已插入载体质粒(图2)。DNA测序结果也与GenBank报告的基因序列完全一致，表达载体构建成功。其序列见SEQ ID NO1。

2.2重组Eppin蛋白的诱导表达。

重组质粒pMALc-Eppin转化表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)，将细菌培养体积扩大至1L，0.4mM IPTG诱导表达，22.5℃培养16-24h，取诱导前、诱导后沉淀、诱导后上清，以空载体为阴性对照，经SDS-PAGE分析，结果显示诱导后上清在57kD左右处有明显诱导表达条带出现，蛋白相对分子质量与理论预测值相符，其中包含42kD大小的MBP融合蛋白。为重组质粒蛋白表达的可溶性蛋白（图3）。

2.3重组Eppin蛋白的纯化

高压破碎后得到195ml上清，经过Ni-NTA亲和层析柱，用200mM咪唑洗脱，得到18ml纯化蛋白，浓缩为3ml后经过分子筛提纯，分子筛于51.63体积处出现峰值（图4）,收峰体积约6.28ml。经SDS-PAGE分析，结果显示在57kD左右处有浓度较高的目的蛋白（图5）。

2.4重组Eppin蛋白的酶切及Eppin蛋白的质谱分析。

经过纯化的蛋白使用牛血清thrombin(Sigma)酶切，以0.04mg/ml的浓度下分别于4℃酶切3h与16h过夜，行SDS-PAGES电泳分析，可见40kD左右的MBP与15kD左右的Eppin蛋白条带（图5）。切下Eppin蛋白条带送第三军医大学中心实验室进行肽质量指纹图谱分析，证实为Eppin蛋白（表1）。蛋白MBP、蛋白Eppin、蛋白MBP-Eppin序列见SEQ面礼ID NO1、2、3。

表1肽质量指纹图谱分析表

2.5重组Eppin蛋白及酶切后蛋白的Western Blot检测。

分别以未诱导的重组菌蛋白、诱导后纯化的融合蛋白及进行酶切后的融合蛋白进行Western印迹检测。结果显示诱导后纯化的融合蛋白和酶切后的Eppin蛋白均有出现明显的免疫印迹条带（图6）。由此可见，重组Eppin蛋白具有良好的抗原性。

Claims (8)

1.融合蛋白，命名为MBP-Eppin，其特征在于，蛋白MBP与蛋白Eppin之间插入有thrombin酶切，在蛋白Eppin的羧基端插入有组氨酸标签。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）大肠杆菌表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)的制备：扩大培养表达菌株Rossetta12(DE3)，提取其中的pRARE2质粒，转化于表达菌株OrigamiB(DE3)，从含有15μg/ml卡那霉素、12.5μg/ml四环素、34μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上挑取单克隆菌落扩大培养后制成表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)，保存于-80℃；

（2）Eppin基因克隆和表达载体的构建：从Eppin菌种中提取DNA作为模板，PCR扩增，将PCR产物回收、酶切、连接后，克隆到pMALc原核表达载体上，筛选所获得的阳性克隆，扩大培养后提取质粒pMALc-Eppin，PCR验证，测序，

所述PCR扩增时引物为：上游引物S1:5’CGGGATCCCCTGGTCTGACTGAT3’;

下游引物S2:5’CTAGCTAGCGGGAAAGCGTTT ATT3’；

（3）融合蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒pMALc-Eppin转化表达菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)，扩大培养后将菌液接种于的表达培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.6，降温至22.5℃后按终浓度0.1mM加入IPTG诱导表达，22.5℃震荡培养过夜。离心，收集细菌沉淀，重悬于缓冲液1中，高压破碎菌，取诱导后上清液，

所述1升表达培养基的组成为15μg/ml卡那霉素+12.5μg/ml四环素+50μg/ml氨苄青霉素+34μg/ml氯霉素+10g蛋白胨+5g酵母+5g氯化钠+2g葡萄糖，其余部分是双蒸水；

所述缓冲液1为加入有500mM NaCl+20mM咪唑的50mM Tris-HCl，pH8.0。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白的制备方法，所述制备方法还包括融合蛋白的纯化步骤，所述纯化步骤依次包括将上清液用Ni-NTA亲和层析柱纯化，和亲和层析柱的洗脱液于Superdex20016/60柱进行分子筛层析纯化。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白的制备方法，所述Ni-NTA亲和层析柱进行纯化时用缓冲液1冲洗去其他蛋白后，用缓冲液2洗脱融合蛋白，所述缓冲液2为加入有500mMNaCl+20mM咪唑的50mM Tris-HCl，pH8.0。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白的制备方法，所述分子筛层析纯化时用缓冲液3洗脱，所述缓冲液3为加入有500mM NaCl的50mM Tris-HCl，pH8.0。

7.蛋白Eppin的制备方法，包括如下步骤：

（1）获得权利要求1所述的融合蛋白MBP-Eppin，

（2）使用牛血清thrombin酶切，得到15kD左右的Eppin蛋白。

8.根据权利要求7所述的制备方法，所述融合蛋白MBP-Eppin采用权利要求3-6所述的制备方法获得。

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