CN115926000A - 一种猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白及其在疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪丹毒rSpaA‑Fc融合蛋白及其在疫苗中的应用。通过对猪丹毒保护性抗原蛋白SpaA进行设计，得到一个融合蛋白序列，该蛋白序列兼具猪丹毒血清1a型与猪丹毒血清2型抗原蛋白，同时融合有Thelper和IgGFc序列。将该序列按照大肠杆菌密码子进行优化，得到猪丹毒rSpaA‑Fc融合蛋白序列；经载体构建、转化、诱导表达、包涵体纯化获得rSpaA‑Fc融合蛋白；用该融合蛋白与佐剂Gel‑02制成疫苗免疫仔猪能够更早诱导高水平的体液免疫和细胞免疫，提高对猪丹毒血清1a和2型强毒攻击的保护。

Description

一种猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白及其在疫苗中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白及其在疫苗制备中的应用。

背景技术

猪源红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，俗称猪丹毒杆菌，是丹毒丝菌科丹毒丝菌属的一种兼性厌氧的革兰氏阳性的纤细小杆菌，可引起猪及其他动物的丹毒病。猪丹毒是一种急性、热性传染病，其临诊特征主要为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。猪丹毒杆菌有多种血清型，大多数由其中的血清1a型和2型引起。

目前，该病在世界上大多数国家都有分布，呈散发或流行性发生，给养猪业造成了很大的经济损失，也给人体健康带来威胁。猪丹毒与猪瘟、猪肺疫并称为中国养猪业的三大传染病，造成严重的经济损失。预防猪丹毒最有效的方法是进行疫苗接种，目前市场上使用的疫苗主要是猪丹毒灭活菌苗和弱毒活菌苗，但在这两种疫苗中，弱毒菌株存在毒力返强的问题，而灭活疫苗存在灭活不彻底及免疫力低的问题。因此，研制新型亚单位疫苗是猪丹毒疫苗研究的主要方向，基因工程亚单位疫苗虽具有生物安全性高，操作简单，成本低等特点，但是其不能诱导细胞免疫是其制约因素，同时目前针对猪丹毒的新型亚单位疫苗设计主要是针对某一个基因型的SpaA蛋白(如申请号201910442887.2、申请号202011366261.7专利所示)，因此亟待对现有技术进行升级，提高抗体水平、免疫覆盖率和保护率。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明专利设计了一种猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白，同时制备含有该融合蛋白的亚单位疫苗产品，弥补现有技术的不足。

首先本发明公开了一种猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白，所述猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述猪丹毒rSpaA-Fc蛋白氨基酸序列由如SEQ ID NO:3所示的信号肽序列、如SEQID NO:4所示的T helper序列、如SEQ ID NO:5所示的猪丹毒血清1a SpaA保护性抗原第一序列、如SEQ ID NO:6所示的linker1第一序列、如SEQ ID NO:7所示的猪丹毒血清2SpaA保护性抗原第一序列、如SEQ ID NO:8所述的猪丹毒血清1a SpaA保护性抗原第二序列、如SEQID NO:6所示的linker1第二序列、如SEQ ID NO:9所示的猪丹毒血清2SpaA保护性抗原第二序列、如SEQ ID NO:10所示的猪丹毒血清1a SpaA保护性抗原第三序列、如SEQ ID NO:11所示的linker2序列、如SEQ ID NO:12所示的Fc序列以及如SEQ ID NO:13所示的6his标签序列首尾连接而成。

编码该猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；该基因按照大肠杆菌密码子偏好性进行了基因优化。

本发明的猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白用于制备猪丹毒亚单位疫苗和诊断试剂。

相比于现有技术，本发明设计的猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白制备的亚单位疫苗具有能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，抗体水平高，对猪丹毒基因1a和2型攻毒保护率高等特点，为生产上制备猪丹毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。

附图说明

图1实施例4采用ELISA测定猪血清中γ-干扰素的检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明实施列中所使用的试剂均为市售产品。

本发明试剂、菌株和质粒来源名单如下：

本发明所用感受态细胞BL21购自于北京擎科生物科技有限公司

培养基购自于上海源叶生物科技有限公司；

Gel02佐剂购自于赛彼科(上海)特殊化学品有限公司；

IFN-γ细胞因子检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；

96孔酶标板购自康宁公司；

pET28a载体购自金斯瑞生物科技股份有限公司。

实施例1

rSpaA-Fc序列合成及重组质粒构建

根据NCBI报道的猪丹毒血清2型菌株C43311(GenBank:EF635597.1)和猪丹毒血清1a型菌株LA150627(GenBank:KU214211.1)抗原猪丹毒SpaA序列，合成仅具有血清1a型抗原特征的SpaA-DC1蛋白的序列、仅含有血清2型抗原特征的SpaA-DC2蛋白的序列以及兼具猪丹毒血清1a型与血清2型抗原蛋白的rSpaA-Fc融合蛋白的序列(SEQ ID NO:1)；SpaA-DC1和SpaA-DC2序列的大小为1239个碱基；rSpaA-Fc序列含有2238个碱基；序列合成并连接至pET28a载体BamHI和EcoRI酶切位点之间，构建原核表达载体pET28a-SpaA-DC1、pET28a-SpaA-DC2以及pET28a-rSpaA-Fc。

实施例2

表达菌株构建及蛋白诱导表达和纯化

SpaA-DC1蛋白、SpaA-DC2蛋白以及rSpaA-Fc融合蛋白制备的方法包括以下步骤：1)BL21感受态细胞转化和阳性表达菌株鉴定；2)阳性菌株培养和蛋白诱导表达；3)包涵体纯化。

1)BL21感受态细胞转化和阳性表达菌株鉴定

将阳性质粒转化BL21感受态细胞，转化后挑取单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养，8000r/min离心5min，收集菌体后，用沸水浴煮5min，12000r/min离心3min离心取上清进行PCR鉴定,鉴定正确后扩大培养。

2)阳性菌株培养和蛋白诱导表达

将PCR检测阳性的菌株分别接种150mL TB培养基中，37℃摇床培养至OD600＝0.6,加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导4h,培养物离心后用1/10体积的PBS重悬，进行超声破碎，离心收获上清和沉淀进行蛋白鉴定。

3)包涵体纯化

将沉淀按1:10(w：v)加入冷的洗涤液(20mM Tris,2mM EDTA,1％Trixon 100,1％Tween 20,0.5M Urea,pH8.2)中，搅拌20分钟。2～8℃，12000r/min离心25分钟，弃上清，取沉淀。重复一次(洗涤2～4小时去除膜碎片和膜蛋白)。所得沉淀再用50mmol/L Tris-HCl洗1次，相同离心条件，离心弃去上清，所得的沉淀即为洗涤后的包涵体。

将洗涤后的包涵体沉淀按1:10(w：v)加入包涵体变性溶解液(50mM Tris,8MUrea,5mM GSH,pH8.2)重悬，于室温搅拌30～60分钟以充分溶解，2～8℃，12000r/min离心15分钟，弃沉淀取上清，将上清缓慢匀速加入7倍体积的PBS溶液，2～8℃过夜复性，离心将上清过0.22μm滤膜除菌，即为复性的蛋白抗原液。将洗涤后的包涵体沉淀按1:10(w：v)加入包涵体变性溶解液重悬，于室温搅拌30～60分钟以充分溶解，2～8℃，12000r/min离心15分钟，弃沉淀取上清，将上清缓慢匀速加入7倍体积的PBS溶液，2～8℃过夜复性，离心将上清过0.22μm滤膜除菌，即为复性的蛋白抗原液。

实施例3

疫苗制备

1)灭活：取复性的蛋白抗原液加入1mol/L的BEI溶液，使其终浓度为0.005mol/L，边加边搅拌，混合均匀，37℃灭活24小时。灭活结束后，加入过滤除菌的2mol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液，使其终浓度为0.005mol/L，充分搅拌均匀，37℃反应1小时终止灭活。置2～8℃保存。

2)半成品检验：无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验；蛋白含量测定按SDS法检测蛋白含量；灭活检验观察无菌落生长，判灭活检验合格。

3)疫苗成品制备：将上述半成品稀释至浓度为22mg/ml，与佐剂按9:1混合，参考标准流程制成疫苗备用。

4)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

5)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

实施例4

1)免疫试验

筛选40头3-4周龄健康长白猪(猪丹毒抗体抗原均阴性，圆环抗原、非洲猪瘟抗原、蓝耳抗原均阴性)进行免疫试验，初免后3周(21天)加强免疫一次。采用颈部肌肉注射。实验共分4组(G1组抗原成分为SpaA-DC1，共10头；G2抗原成分SpaA-DC2，共10头；G3组抗原成分为SpaA-Fc，共10头；G4组为阴性对照组，共10头)。初次免疫后21天以及加强免疫后14天分别采血并分离血清；采血完成后分别进行攻毒，每组随机挑选出5头用猪丹毒Ery-1a强毒株攻毒，5头用猪丹毒Ery-2型强毒株进行攻毒。所用毒株由北京鼎持生物技术有限公司分离并提供，攻毒剂量为2×10⁸CFU/头份，攻毒途径为静脉注射，连续观察14日，记录发病及死亡情况。

(1)初次免疫21天及2免后14天采集全血后分离血清，使用间接Elisa法测定猪丹毒抗体水平变化。

(2)初次免疫21天及2免后14天分别进行猪丹毒抗体水平测定(S/P≥0.4即为抗体阳性)，结果如表1所示，

表1

通过表1记录结果可以看出，一免抗体水平结果显示G3组均为猪丹毒抗体阳性，G1组和G2组部分抗体阳性，并且G3组抗体水平明显高于G1和G2组；二免14天数据显示三个免疫组均为抗体阳性，G3组抗体水平更高。

(3)使用Ery-1a强毒株做为攻毒菌株进行攻毒，攻毒后仔猪发病和死亡统计结果如表2所示，表2

通过表2统计数据可以看出，G4组3头死亡，2头发病，G1组与G3组全部保护，G2组3头发病，数据显示G1组与G3组疫苗都能够抵御Ery-1a毒株的攻击，G4组3头死亡，2头发病。

(4)使用Ery-2做为攻毒菌株进行攻毒，攻毒后仔猪发病和死亡统计结果如表3所示，表3

通过表3统计数据可以看出，G2和G3组全部保护，G1组2头发病，G4组2头死亡3头发病，结果表明在面对血清2型毒株攻击时，G2组和G3组的保护效果更好。

(5)采用ELISA测定猪血清中干扰素-γ的含量，结果如图1所示。图1结果显示：G3组高于G1组和G2组，且差异显著，G1组和G2组水平相当。

综上所述，本发明提供了一种猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白的表达基因所编码的猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白，其作为主要抗原成分所制备的亚单位疫苗免疫仔猪后，能够诱导仔猪产生较高的抗体水平，且抗体产生时间早；同时提供对猪丹毒血清1a和2型强毒株的攻毒保护；能够诱导仔猪产生较高的干扰素-γ。

上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。

Claims (6)

1.一种猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的rSpaA-Fc蛋白氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白，其特征在于，所述猪丹毒rSpaA-Fc蛋白氨基酸序列由如SEQ ID NO:3所示的信号肽序列、如SEQ ID NO:4所示的Thelper序列、如SEQ ID NO:5所示的猪丹毒血清1aSpaA保护性抗原第一序列、如SEQ ID NO:6所示的linker1第一序列、如SEQ ID NO:7所示的猪丹毒血清2SpaA保护性抗原第一序列、如SEQ IDNO:8所述的猪丹毒血清1aSpaA保护性抗原第二序列、如SEQ ID NO:6所示的linker1第二序列、如SEQ ID NO:9所示的猪丹毒血清2SpaA保护性抗原第二序列、如SEQ ID NO:10所示的猪丹毒血清1aSpaA保护性抗原第三序列、如SEQ ID NO:11所示的linker2序列、如SEQ IDNO:12所示的Fc序列以及如SEQ ID NO:13所示的6his标签序列首尾连接而成。

3.一种表达如权利要求1所述的猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白的基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的表达猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白的基因，其特征在于，所述表达猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白的基因按照大肠杆菌密码子偏好性进行基因优化。

5.权利要求1所述的猪丹毒猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白在制备疫苗或诊断试剂中的应用。

6.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗是使用权利要求1所述的猪丹毒猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白作为抗原制备的。

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