CN109207502B

CN109207502B - 猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型重组蛋白及制备二联疫苗

Info

Publication number: CN109207502B
Application number: CN201811179696.3A
Authority: CN
Inventors: 何玉龙; 陶宇; 舒建洪; 陈健; 吴月红; 杨芳
Original assignee: Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2038-10-10
Also published as: CN109207502A

Abstract

本发明涉及疫苗技术领域，尤其是涉及一种猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型重组蛋白及其制备的二联基因工程疫苗和应用。一种猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型二联基因工程疫苗，其特征在于，所述疫苗包含Mhp P97R1‑P46‑P42重组蛋白和PCV2 Cap重组蛋白。所述Mhp P97R1‑P46‑P42重组蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述PCV2 Cap重组蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。上述二联基因工程疫苗能有效防控猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型，具有良好的应用前景。

Description

猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型重组蛋白及制备二联疫苗

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，尤其是涉及一种猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型重组蛋白及其制备的二联基因工程疫苗和应用。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine，MPS)是由于感染猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia，Mhp)而引发的慢性呼吸道传染病，又称“猪气喘病”或“猪地方性肺炎(porcine enzootic pneumonia，PEP)”。仔猪感染偏多，临床上以哮喘、阵发性痉挛性咳嗽、食欲减退和肺部水肿为主要特征，最终导致窒息死亡。该病具有感染率高、传染性高的特点。猪肺炎支原体常会与多杀性巴氏杆菌(P. multocida)、猪繁殖呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)和猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)等病原体协同感染，增加了相关疾病的严重性和潜在的持久性，使呼吸道疾病加重，继而引起呼吸系统疾病综合症 (Porcine Respiratory DiseaseComplex，PRDC)，最终导致死亡率上升，给世界养猪业带来巨大的经济损失。大量的研究表明，在猪肺炎支原体感染过程中，细胞膜上黏附因子抗原引发的免疫效应起关键性的作用。Mhp与猪呼吸道上皮细胞纤毛的特异性黏附是引起猪支原体肺炎的关键。而此黏附过程中是多种黏附因子共同作用的结果，现已发现的P97、P46和P42是三种起主要黏附功能的膜蛋白。

猪圆环病毒2型感染是由猪圆环病毒2型（PCV2）所引起的一系列疾病的总称。PCV2感染后猪群免疫功能下降，且可并发或继发细菌或病毒感染。PCV2可以引起断奶仔猪发生衰竭及死亡。PCV2基因组为环状、单链DNA，全长1767-1768 bp，含有11个ORFs，分别命名为ORF1-ORF11。研究表明，ORF2编码病毒的核衣壳蛋白（Cap）是其主要的免疫原，能诱导中和抗体的产生，对猪圆环病毒的诊断和疫苗研究有较大的意义，同时也是研制基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。

本研究通过原核表达Mhp的P97R1、P46和P42的嵌合蛋白，以及PCV2的Cap蛋白，蛋白纯化后1:1混合免疫BALB/c小鼠，经体液免疫和细胞免疫相关实验检测证实效果免疫效果显著。此混合蛋白可以作为控制Mhp和PCV2的二联基因工程疫苗使用。

发明内容

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白，其特征在于，其编码基因序列与SEQ ID NO.1具有大于90%的同一性，或大于92%的同一性，或大于95%的同一性，或大于96%的同一性，或大于97%的同一性，或大于98%的同一性，或大于99%的同一性；优选如SEQ ID NO.1所示。

一种PCV2 Cap重组蛋白，其特征在于，其编码基因序列与SEQ ID NO.2具有大于90%的同一性，或大于92%的同一性，或大于95%的同一性，或大于96%的同一性，或大于97%的同一性，或大于98%的同一性，或大于99%的同一性；优选如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，其特征在于，含有上述Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白的编码基因；优选是pET32a-P97R1-P46-P42。

一种重组载体，其特征在于，含有上述PCV2 Cap重组蛋白的编码基因；优选是pET32a-Cap。

一种猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型二联基因工程疫苗，其特征在于，所述疫苗包含Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白和PCV2 Cap重组蛋白；或包含含有Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白的编码基因的重组载体和包含含有PCV2 Cap重组蛋白的编码基因的重组载体。

其中一些实施例，所述Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白的编码基因序列与SEQ IDNO.1具有大于90%的同一性，或大于92%的同一性，或大于95%的同一性，或大于96%的同一性，或大于97%的同一性，或大于98%的同一性，或大于99%的同一性；优选如SEQ ID NO.1所示。

其中一些实施例，所述PCV2 Cap重组蛋白的编码基因序列与SEQ ID NO.2具有大于90%的同一性，或大于92%的同一性，或大于95%的同一性，或大于96%的同一性，或大于97%的同一性，或大于98%的同一性，或大于99%的同一性；优选如SEQ ID NO.2所示。

其中一些实施例，所述疫苗还包含疫苗佐剂，如兽医学可接受的水性佐剂或油性佐剂。优选的，水性佐剂包括但不限于铝盐系列佐剂、Montanide IMS系列佐剂或MontanideGEL系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、细胞因子类佐剂、核酸及其衍生物类佐剂、卵磷脂类佐剂。所述Montanide IMS系列佐剂包括1313VG、251C VG、2215VG；所述Montanide GEL系列佐剂为GEL 01PR或Montanide PET GEL A；所述水包油性系列佐剂包括MF59、MontanideISA15A VG等；所述细胞因子类佐剂包括白介素(IL-1、IL-2、IL-4、IL-12)，干扰素(IFN-γ、IFN-α、IFN-β)等；所述核酸及其衍生物类佐剂包括免疫刺激序列DNA(CpG DNA)或CpG寡聚脱氧核苷酸等。进一步优选的，水性佐剂优选方式涉及为IMS1313N VG、IMS2215VG、Gel01、卡波姆、氢氧化铝胶的一种或几种的组合物。其中一些实施例，所述疫苗包含弗式完全佐剂和/或弗式不完全佐剂。

其中一些实施例，所述佐剂的浓度范围是从5~50％V/V，优选20~30％V/V，进一步优选25% V/V。

其中一些实施例，所述油性佐剂包括但不限于白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油性佐剂既可以是天然来源，也可以是经过人工合成获得的。

其中一些实施例，所述疫苗还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山梨醇单油酸酯(TWEE系列)，司盘(SPAN)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括但不限于，例如福尔马林、β-丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。

本发明还提供一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

构建含有上述重组蛋白的表达载体；

重组蛋白的表达。

其中一些实施例，上述制备方法还包括对表达系统表达重组蛋白的纯化的步骤。

其中一些实施例，上述制备方法还包括在构建表达载体前对目的基因的获取步骤。

其中一些实施例，上述制备方法的具体步骤为：

将获取的目的基因酶切后连接入pET32a载体，转入克隆菌，获得重组载体pET32a-P97R1-P46-P42或pET32a-Cap；

上述重组载体分别转入表达菌中，诱导表达目的蛋白。

其中一些实施例，克隆菌优选TG1克隆菌，表达菌优选BL21 DE3表达菌。

本发明还提供了上述重组蛋白、上述重组载体、上述疫苗在制备治疗、诊断猪支原体肺炎和/或猪圆环病毒2型药物中的应用。

本发明具有以下有益的效果：通过原核表达系统制备的Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白与PCV2 Cap重组蛋白1:1混合后免疫小鼠，通过检测免疫后抗体产生水平和脾淋巴细胞增殖情况证实，采用本方法制备的Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白与PCV2 Cap重组蛋白1:1混合后可以作为有效防控猪支原体肺炎和猪圆环病毒2 型二联基因工程疫苗使用。

附图说明

图1是pET32a-P97R1-P46-P42构建示意图。

图2是pET32a-Cap构建示意图。

图3是纯化后Mhp P97-P46-P42重组蛋白SDS-PAGE电泳图。

图4是纯化后PCV2 Cap重组蛋白SDS-PAGE电泳图。

图5是Mhp P97-P46-P42重组蛋白的His抗体Western Blot鉴定。

图6是PCV2 Cap重组蛋白的His抗体Western Blot鉴定。

图7是Mhp P97-P46-P42重组蛋白的P97、P46和P42多抗Western Blot鉴定。

图8是PCV2 Cap重组蛋白的Cap多抗Western Blot鉴定。

图9是Mhp 168株和PCV2 ZJ/C株为抗原的ELISA检测结果。注：***表示差异极显著（P<0.001）。

图10是免疫后各组小鼠脾淋巴细胞增殖指数检测。注：NS表示差异不显著（P>0.05）；***表示差异极显著（P<0.001）。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明所述技术方案中，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均购自商业渠道。

本发明所述技术方案提及的一些试剂配方：

Amp存储液：100 mg/mL的Amp水溶液；

IPTG存储液：240 mg/mL的IPTG水溶液；

PBS溶液：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na₂HPO₄，0.24 g KH₂PO₄溶于ddH₂O定容至1L；

纯化洗涤液：20 mM Tris，200 mM NaCl，25 mM 咪唑，10% 甘油，加ddH₂O溶解，pH调至8.0，定容至1 L，0.45 μm滤膜过滤除杂质；

纯化洗脱液：20 mM Tris，200 mM NaCl，500 mM 咪唑，10% 甘油，加ddH₂O溶解，pH调至8.0，定容至1 L，0.45 μm滤膜过滤除杂质；

抗原包被缓冲液：1.59 g Na₂CO₃，2.93 g NaHCO₃，ddH₂O定容至1 L；

ELISA洗涤液：0.05% Tween-20的PBS溶液；

ELISA封闭液：5%脱脂奶粉，5%BSA的PBS溶液；

ELISA抗体稀释液：2%脱脂奶粉，1%BSA的PBS溶液；

ELISA终止液：2 M H₂SO₄。

实施例1

目的基因的获取及表达载体的构建

在NCBI数据库中查找山东株PCV2 Cap基因序列（登录号：KY656098.1）去掉核定位信号肽，对剩余的核酸序列进行原核表达系统密码子优化。同样的方法查找Mhp168株（登录号：CP002274.1）的P97R1（MHP168_110）、P46（MHP168_522）和P42（MHP168_069）基因序列，对其进行密码子优化。结合pET32a表达载体多克隆位点和基因序列选择适当的酶切位点和连接肽序列，化学合成如下两条序列：①NcoⅠ-P97R1-GGSG-P46-GGSG-P42-XhoⅠ；②KpnⅠ-Cap-XhoⅠ。

利用分子生物学方法将上述合成的两条序列分别双酶切后连接入pET32a载体中，转入TG1克隆菌，筛选鉴定后获得的重组载体分别命名为pET32a-P97R1-P46-P42和pET32a-Cap。

以上所述两条融合基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，分别密码子优化后化学合成，构建的pET32a-P97R1-P46-P42和pET32a-Cap重组载体示意图分别如图1和图2所示。

实施例2

目的蛋白的表达纯化

将pET32a-P97R1-P46-P42和pET32a-Cap分别转入BL21 DE3表达菌中，进行诱导表达与纯化。两种蛋白的获得与操作方法相同，具体如以下步骤：

①蛋白表达：向LB培养基中按1：100比例接入重组表达菌，加入终浓度为1 mM Amp抗生素，37℃，220 rpm摇菌3-4 h，再加入终浓度为1 mM IPTG诱导，16℃，220 rpm诱导过夜培养。

②菌体破碎：收集诱导过夜的培养的菌液，4000 rpm离心40 min获得菌体；用适量无菌PBS溶液重悬洗涤，12000 rpm，4℃离心10 min弃上清；用少量预冷的纯化洗涤液重悬菌体，放入超声破碎仪破碎，条件为超3 s停5 s，冰浴超声15 min；最后12000 rpm，4℃离心15 min取上清液。

③蛋白纯化：将获得的上清液加入预处理好的镍柱中，结合2 h；用预冷的纯化洗涤液洗涤杂蛋白4次，每次10 min；用预冷的纯化洗脱液洗脱目的蛋白3次，每次15 min。最后收集所有的洗脱液，即目的蛋白。

实施例3

目的蛋白的鉴定、浓缩及定量分析

将纯化后的P97-P46-P42与Cap分别制样后，用12%的SDS-PAGE胶电泳，考马斯亮蓝染色，脱色，结果如图3和图4。使用His抗体进行Western Blot鉴定，结果如图5和图6。

在上述鉴定的基础上，利用10 kDa超滤管分别对两种蛋白进行浓缩、除盐处理后，BCA法定量两种蛋白，最终调整蛋白浓度至1 mg/mL。

实施例4

重组蛋白的抗原性检测

分别用rP97、rP46、rP42以及Cap蛋白的兔多抗通过Western Blot方法来检测重组蛋白的抗原性。结果显示，嵌合蛋白P97-P46-P42能被上述三种抗体分别检测到，如图7；Cap蛋白能被Cap抗体检测到，如图8。

实施例5

动物免疫实验

将24只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成以下四组：①PBS组；②Mhp疫苗免疫组（瑞倍适-旺，哈药集团生物疫苗有限公司）③PCV2疫苗免疫组（圆净诺，浙江诗华诺倍威生物技术有限公司）④重组蛋白免疫组。采用皮下注射途径，分别在第0、14和28 d进行免疫，PBS组每只小鼠注射200 μL PBS，Mhp疫苗免疫组每只小鼠注射100 μL“瑞倍适-旺” 疫苗，PCV2疫苗免疫组每只小鼠注射100 μL“圆净诺”疫苗，重组蛋白免疫组每只小鼠注射200 μL混合物（组成为：50 μL 1 mg/mL的重组P97-P46-P42蛋白、50 μL 1 mg/mL重组Cap蛋白和100 μL佐剂，其中首次免疫使用弗式完全佐剂，第二和第三次免疫使用弗式不完全佐剂）。分别在第一次免疫后14 和28 d进行尾部取血，在35和42 d分别对每组3只小鼠进行内眦取血和分离脾淋巴细胞。具体检测步骤如下：

（1）抗体水平检测：为了评估小鼠对于各种抗原所产生的体液免疫效应，采用间接ELISA法检测抗体水平。分别将抗原包被缓冲液稀释后rP97、rP46、rP42和Cap蛋白以1 μg/mL浓度包板，ELISA封闭液封闭，分别孵育以上四个时间段采集分离的血清（抗体稀释液1:100稀释），然后再孵育二抗，加显色液显色，其中上述每两步间均用ELISA洗涤液洗板4次，每次1 min。最后加入ELISA终止液终止显色反应，检测450 nm波长下的光密度（Opticaldensity, OD）值。结果显示，重组蛋白疫苗组小鼠的血清针对rP97、rP46、rP42和Cap四种抗原均能表现出显著的特异性IgG反应，说明上述重组蛋白混合免疫后能激发小鼠体内产生特异性的体液免疫效应。

（2）对于Mhp与PCV2野生株的免疫能力：为了检测小鼠血清对于支原体和PCV2野生病毒株的反应能力，同样采用间接ELISA法进行检测。分别用Mhp 168株和PCV2 ZJ/C株作为抗原，分别用抗原包被缓冲液稀释至100 μg/mL包板。后续检测步骤参照上述（1）的步骤，最后检测450 nm波长下的OD值。结果如图9所示。两种商品化疫苗免疫组与重组蛋白免疫组的小鼠对于Mhp 168株和PCV2 ZJ/C株均能产生特异性的IgG反应，但随着免疫时间的增加，重组蛋白免疫组表现出更显著的效果。

（3）脾淋巴细胞增殖检测：为了评估小鼠对于各种抗原所产生的细胞免疫效应，使用小鼠淋巴细胞分离液（北京达科为生物技术有限公司）对免疫后35 d和42 d的小鼠进行脾淋巴细胞分离，具体操作流程参见产品说明书。对分离后的各组脾淋巴细胞进行细胞计数，96孔板每孔加入100 μL稀释至4×10⁶个/mL的细胞悬液。37℃ 5% CO₂培养箱中培养至细胞完全贴壁后，分别在每孔加入100 μL稀释后的混合抗原（rP97，rP46，rP42和Cap的混合物，其中四种抗原终浓度均为10 μg/mL），RPMI-1640培养基与阳性对照（刀豆蛋白A，终浓度为10 μg/mL）。将细胞放入CO₂培养箱继续培养42 h后每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h，弃尽细胞培养上清，每孔加入100 μL DMSO，于振荡器上震荡混匀5 min，最后检测490 nm波长下的OD值，按照以下公式计算刺激指数（SI），SI=刺激孔OD平均值/未刺激孔OD平均值。结果如图10所示。重组蛋白疫苗免疫组的小鼠相比较于其他各对照组，对于相应抗原的刺激均能表现出较高的刺激指数，说明上述重组蛋白混合免疫后能激发小鼠体内产生特异性的细胞免疫效应。

序列表

<110> 杭州洪桥中科基因技术有限公司

浙江理工大学

<120> 猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型重组蛋白及制备二联疫苗

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccatgggaag gtaaaagaga agaagtagat aaaaaagtta aagaattaga taataaaata 60

aaaggtatat tacctcagcc cccagcagct aaacctgaag cagcaaaacc agtagcagct 120

aaacctgaag cagcaaaacc agtagcagct aaacctgaag cagcaaaacc agtagcagct 180

aaacctgaag cagcaaaacc agtagcggct aaacctgaag cagctaaacc tgaagcagcc 240

aaaccagttg ctactaatac taatactaat actggctttt cacttacaaa taaaccaaaa 300

gaagactatt tcccaatggc ttttagttat aaattagaat atactgacga aaataaatta 360

agcctaaaaa caccggaaat taatgtattt ttagaactag gtggttcagg tcaagattat 420

aatgataaag ccaaaacttt tatcaaagac ggcgatcaaa atatgacaat ttataaacct 480

gataaagttt taggaaaagt tgctgttgaa gttcttcggg ttttaattgc aaagaaaaat 540

aaagcatcta gatcagaagt cgaaaacgaa ctaaaagcaa agctaccaaa tatttcattt 600

aaatatgata atcaaacata taaagtacaa ggtaaaaata ttaatacaat tttagtaagt 660

ccagtaattg ttacaaaagc taatgttgat aatcctgatg ccggtggttc aggtattgaa 720

gctgctccac gaggtcttcc ccagattgaa gttagctttt caattgatgt caacgggatt 780

acaacggttt cagcaaaaga taaaaaaacc ggcaaagaac aaacaattac aattaaaaat 840

acatcaactt tatcagaaga agaaattaat aagatgattc aggaagccga agaaaatcgt 900

gaagctgatg ctcttaaaaa agacaaaatc gagacaacag ttcgtgctga agggcttatt 960

aatcaacttg agaaatcaat aactgatcaa ggtgaaaaaa ttgatccaaa acaaaaagaa 1020

ttacttgaaa aacaaattca agaattaaaa gatcttctaa aagaagaaaa aactgacgaa 1080

ttaaaattaa aattagacca aattgaagca gctgcccaat cttttgcgca ggcaaccgcg 1140

cagcaagcaa atacatctga atctgatcca aaagctgatg attcaaacac aattgatgct 1200

gaaatcaagc aggattgact cgag 1224

<210> 2

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaccaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtcaagaaa 60

accacagtca gaacgccctc ctggaaggtg gacatgatga gattcaatat taatgacttt 120

cttcccccag gagggggctc aaaccccctc tctgtgccct ttgaatacta cagaataaga 180

aaggttaagg ttgaattctg gccctgctcc ccgatcaccc agggtgacag gggagtgggc 240

tccagtgctg ttattctaga tgataacttt gtaacaaagg ccacagccct cacctatgac 300

ccctatgtaa actactcctc ccgccatacc ataacccagc ccttctccta ccactcccgg 360

tactttaccc ccaaacctgt cctagattcc actattgatt acttccaacc caacaacaaa 420

agaaatcaac tctggctgag actacaaact actggaaatg tagaccacgt aggcctcggc 480

actgcgttcg aaaacagtat atacgaccag gaatacaata tccgggtaac catgtatgta 540

caattcagag aatttaatct taaagacccc ccacttaacc ctaagggatc c 591

Claims

1.一种猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型二联基因工程疫苗，其特征在于，所述疫苗包含Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白和PCV2 Cap重组蛋白；或包含含有Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白的编码基因的重组载体和包含含有PCV2 Cap重组蛋白的编码基因的重组载体。

2.如权利要求1所述的二联基因工程疫苗，其特征在于，所述Mhp P97R1-P46-P42重组蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述PCV2 Cap重组蛋白的编码基因序列如SEQID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的二联基因工程疫苗，其特征在于，所述重组载体为pET32a-P97R1-P46-P42或pET32a-Cap。

4.如权利要求1-3任一所述的二联基因工程疫苗，其特征在于，还包括疫苗佐剂、助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂中的一种或几种。

5.权利要求1-4任一所述的疫苗在制备治疗、诊断猪支原体肺炎和/或猪圆环病毒2型药物中的应用。