CN113913465A - 一种携带有猪gmcsf分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用，采用杆状病毒表达系统表达猪肺炎支原体P97R1、P46和P42嵌合抗原蛋白(P97R1P46P42)，以及融合了分子佐剂GMCSF的重组抗原蛋白(P97R1P46P42‑GMCSF)，其中融合了分子佐剂的重组蛋白可以诱导产生更高的的体液免疫和细胞免疫水平，所以，GMCSF可以作为猪肺炎支原体相关疫苗产品的佐剂或免疫增强剂，有望为养猪业提供安全有效且操作简便的疫苗产品。

Description

一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单 位疫苗制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种疫苗制备方法及其应用，更具体一点，涉及一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,MPS)是由于感染猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia,Mhp)而引发的慢性呼吸道传染病，又称“猪气喘病”或“猪地方性肺炎(porcine enzootic pneumonia,PEP)”，仔猪感染偏多。临床上以哮喘、阵发性痉挛性咳嗽、食欲减退和肺部水肿为主要特征，最终导致窒息死亡。该病具有感染率高、传染性高的特点，猪肺炎支原体常会与多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、猪繁殖呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)和猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)等病原体协同感染，增加了相关疾病的严重性和潜在的持久性，使呼吸道疾病加重，继而引起呼吸系统疾病综合症(Porcine Respiratory DiseaseComplex,PRDC)，最终导致死亡率上升，给世界养猪业带来巨大的经济损失。
大量的研究表明，在猪肺炎支原体感染过程中，细胞膜上黏附因子抗原引发的免疫效应起关键性的作用。Mhp与猪呼吸道上皮细胞纤毛的特异性黏附是引起猪支原体肺炎的关键，而此黏附过程中是多种黏附因子共同作用的结果，现已发现的P97、P46和P42是三种起主要黏附功能的膜蛋白。
分子佐剂是一类可以调节细胞间相互作用，能够刺激免疫系统针对特定抗原产生更强保护效应的蛋白质或其他小分子化合物，其中包括细胞因子，共刺激分子，趋化因子，补体，凋亡分子和泛素以及其他正在研究的基因佐剂等。其中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，GMCSF)对造血系统有广泛的作用，能刺激粒细胞和巨噬细胞的增殖、分化及活化，增加造血功能；也可以增强中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及单核粒细胞的多种功能，增强免疫细胞吞噬细菌及杀灭癌细胞等免疫活力，是一种具有良好应用价值的分子佐剂。
发明内容
为了解决上述现有技术问题，同时提高重组抗原蛋白或者含有重组抗原蛋白的细胞悬液所诱导产生的免疫应答水平，本发明提供了一种猪肺炎支原体相关疫苗产品的免疫增强剂，有望为养猪业提供安全有效的疫苗等产品。本发明的技术特点是一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于其制备方法包括如下步骤：
步骤1)：获取目的基因的以及重组载体的构建；
步骤2)：重组杆状病毒基因组的制备；
步骤3)：应用杆状病毒表达系统表达目的蛋白；
步骤4)：目的蛋白的鉴定和纯化。
优选的，所述目的基因的获取以及重组载体的构建包括如下步骤：
(1.1)获取猪GMCSF的基因序列，对猪GMCSF的基因序列的外显子序列进行密码子优化，并同时在其N端添加GGPGS蛋白接头并对其进行化学合成，化学合成后的目的基因连接在pUC57载体的EcoR V酶切位点之间。重组质粒pFastBac Dual-P97R1P46P42保存在-80℃冰箱中，其表达的重组蛋白P97R1P46P42的N末端带有GP64蛋白的信号肽序列MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA；
(1.2)结合pFastBac Dual杆状病毒表达载体polyhedrin promoter下游的多克隆位点，利用PCR方法在GMCSF基因序列的前后两端引入Xba I和Hind III酶切位点，目的基因和载体经过双酶切后连接到载体pFastBac Dual-P97R1P46P42的Xba I和Hind III酶切位点之间，然后转化到E.coli TG1感受态细胞中，将鉴定成功后的重组载体命名为pFastBacDual-P97R1P46P42-GMCSF。
优选的，所述重组杆状病毒基因组的制备包括如下步骤：
(2.1)将重组质粒pFastBac Dual-P97R1P46P42和pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中，经过蓝白斑筛选之后挑取重组DH10Bac菌斑，并进行杆状病毒基因组(Bacmid)的提取以及鉴定。
优选的，所述应用杆状病毒表达系统表达目的蛋白包括如下步骤：
(3.1)取生长良好的Sf9细胞4×106个，重悬于12mL Sf900培养基中，按照每孔2mL用量铺六孔板，混匀后28℃静置生长过夜；
(3.2)按照
Figure BDA0003267512700000031
6Transfection Reagent的使用说明将重组Bacmid转染到Sf9细胞中，于28℃静置培养3d，在第3d时观察细胞的发病状态并收集上清液作为P1代重组杆状病毒；
(3.3)将P1代重组杆状病毒按照0.5％的比例转接到细胞密度为2×106个/mL的生长良好的Sf9细胞中，培养72h后离心收集上清液得到P2代重组杆状病毒，然后再按照相同比例重复一次扩增得到P3代重组杆状病毒；
(3.4)将P3代重组杆状病按照5％比例接种到20mL细胞密度为4×106个/mL的生长良好的Sf9细胞中，培养72h，离心收集细胞沉淀，用PBS重悬细胞至终体积为5mL，然后于冰上超声破碎，结束后按1mL/份分装并立即冻存于-80℃冰箱中。
优选的，步骤(3.4)中对表达的重组蛋白采用Western Blot鉴定，其鉴定包括如下步骤：
(4.1)取步骤(3.4)中冻存的细胞悬液160μL，然后加入40μL 5×LoadingBuffer，加热煮沸10min后做12％SDS-PAGE；
(4.2)分别用重组蛋白rP97和rP42的兔多克隆抗体通过Western Blot方法来检测两种重组蛋白P97R1P46P42和P97R1P46P42-GMCSF。
优选的，步骤(2.1)具体如以下步骤：
(2.1.1)使用42℃热激法将两种重组质粒转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中，然后涂布在含有LB固体培养基上，该LB固体培养基中含有50μg/mL kanamycin，7μg/mLgentamicin，10μg/mL tetracycline，40μg/mL X-gal，40μg/mL IPTG；
(2.1.2)用牙签挑取多个白斑，然后再将其涂布在含有上述抗生素等物质的LB固体培养基中进行二轮筛选；
(2.1.3)挑取白斑，在LB液体培养基中培养12h；LB液体培养基含有50μg/mLkanamycin，7μg/mL gentamicin，10μg/mL tetracycline的抗生素；
(2.1.4)离心收集4到5mL菌液菌体，用杆状病毒穿梭载体Bacmid小量抽提试剂盒进行重组Bacmid的抽提，然后保存在-80℃冰箱中；
(2.1.5)用引物PpH_F：AACCATCTCGCAAATAAATAAG和Psv40_R：AAACCACAACTAGAATGCAGTG对重组Bacmid进行PCR扩增，以鉴定目的基因是否存在于杆状病毒基因组上；
(2.1.6)用通用引物M13(M13_F:CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG；M13_R:AGCGGATAACAATTTCACACAGG)对重组Bacmid进行PCR扩增，以鉴定是否目的基因已经整合到杆状病毒基因组的正确位点上。
本发明一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗的应用。
本发明一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的疫苗。
本发明一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的疫苗，所述疫苗包含重组蛋白P97R1P46P42和重组蛋白GMCSF。
本发明一种重组载体，含有如权利要求2所述的表达重组蛋白P97R1P46P42，所述表达重组蛋白P97R1P46P42的N末端带有GP64蛋白的信号肽序列MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA。
本发明一种重组载体，其特征在于，含有猪GMCSF基因序列。
本发明一种表达重组蛋白P97R1P46P42，其编码基因序列为SEQIDNO.1。
本发明一种表达重组蛋白GMCSF，其编码基因序列为SEQIDNO.2。
本发明一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗，包含重组蛋白P97R1P46P42和重组蛋白GMCSF。
有益效果：本发明应用杆状病毒表达系统表达猪肺炎支原体P97R1、P46和P42嵌合抗原蛋白(P97R1P46P42)，以及融合了分子佐剂GMCSF的重组抗原蛋白(P97R1P46P42-GMCSF)，其中融合了分子佐剂的重组蛋白可以诱导产生更高的的体液免疫和细胞免疫水平，所以，GMCSF可以作为猪肺炎支原体相关疫苗产品的佐剂或免疫增强剂，有望为养猪业提供安全有效且操作简便的疫苗产品。
附图说明
图1是本发明重组载体pFastBac Dual-P97R1P46P42序列示意图。
图2是本发明重组载体pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF序列示意图。
图3是本发明重组Bacmid的目的基因PCR鉴定结果图。
图4是本发明重组Bacmid的M13引物PCR鉴定结果图。
图5是本发明重组Bacmid-pFastBac Dual-P97R1P46P42转染后细胞病变结果图。
图6是本发明重组Bacmid-pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF转染后细胞病变结果图。
图7是本发明同一批Sf9细胞培养72h细胞状态观察图。
图8是本发明rP42兔多克隆抗体对重组蛋白P97R1P46P42和P97R1P46P42-GMCSF的Western Blot鉴定结果图。
图9是本发明rP97兔多克隆抗体对重组蛋白P97R1P46P42和P97R1P46P42-GMCSF的Western Blot鉴定结果图。
图10是本发明重组蛋白P97R1P46P42-GMCSF的镍离子亲和层析纯化后SDS-PAGE电泳结果图。
图11是本发明血清抗体对重组蛋白rP46的ELISA检测结果图。
图12是本发明血清抗体对重组蛋白rP97R1P46P42的ELISA检测结果图。
图13是本发明血清抗体对重组蛋白rP42的ELISA检测结果图。
图14是本发明重组蛋白对脾淋巴细胞的增殖刺激指数检测结果图。
图15是本发明免疫后第35和42d血清中IgG1和细胞因子IFN-γ，IL-4的含量检测结果图之一。
图16是本发明免疫后第35和42d血清中IgG1和细胞因子IFN-γ，IL-4的含量检测结果图之二。
图17是本发明免疫后第35和42d血清中IgG1和细胞因子IFN-γ，IL-4的含量检测结果图之三。
图3中：M：DL5000 DNA Marker；1：Bacmid-pFastBac Dual阴性对照；2：Bacmid-pFastBac Dual-P97R1P46P42目的基因扩增；3：Bacmid-pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF目的基因扩增；
图4中：M：DL10000 DNA Marker；1：Bacmid-pFastBac Dual阴性对照M13引物扩增结果；2：Bacmid-pFastBac Dual-P97R1P46P42 M13引物扩增结果；3：Bacmid-pFastBacDual-P97R1P46P42-GMCSFM13引物扩增结果；
图8中：M：蛋白分子量标准；1：重组蛋白P97R1P46P42鉴定结果；2：重组蛋白P97R1P46P42-GMCSF鉴定结果；
图9中：M：蛋白分子量标准；1：重组蛋白P97R1P46P42鉴定结果；2：重组蛋白P97R1P46P42-GMCSF鉴定结果；
图10中：M：蛋白分子量标准；1：表达重组蛋白P97R1P46P42-GMCSF的细胞破碎液；2：细胞破碎后上清液；3：柱结合流穿液；4：洗涤液1；5：洗涤液2；6：洗涤液3；7：洗涤液4；8：洗脱液1；9：洗脱液2；10：洗脱液3；
图11、12、13中：****表示差异极显著(P<0.0001)，在免疫后35和42d，P97R1P46P42-GMCSF免疫实验组针对重组蛋白rP97，rP42和rP97R1P46P42产生的抗体水平均高于P97R1P46P42实验组，显著性分析使用Two-way ANOVA。
图14中：****表示差异极显著(P<0.0001)，**表示差异相对显著(P<0.001)，显著性分析使用Two-way ANOVA。
图15、16、17中：****表示差异极显著(P<0.0001)，显著性分析使用Two-wayANOVA。
具体实施方式
以下结合说明书附图图1-17，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
1.1目的基因的获取以及重组载体的构建
在NCBI数据库中查找猪GMCSF的基因序列(登录号：NM214118)，对其外显子序列进行密码子优化，同时在其N端添加GGPGS蛋白接头并对其进行化学合成，化学合成后的目的基因连接在pUC57载体的EcoR V酶切位点之间。表达重组蛋白P97R1P46P42的质粒pFastBacDual-P97R1P46P42由实验室制备并保存在-80℃冰箱中，该重组蛋白的N末端带有GP64蛋白的信号肽序列(MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA)。
结合pFastBac Dual杆状病毒表达载体polyhedrin promoter下游的多克隆位点，利用PCR方法在GMCSF基因序列的前后两端引入Xba I和Hind III酶切位点，目的基因经过双酶切后连接到载体pFastBac Dual-P97R1P46P42的Xba I和Hind III酶切位点之间，然后转化到E.coli TG1感受态细胞中，鉴定成功后的重组载体命名为pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF。重组蛋白P97R1P46P42的基因序列分别如SEQIDNO.1所示，重组蛋白GMCSF的基因序列如SEQIDNO.2所示，重组表达载体pFastBac Dual-P97R1P46P42示意图如图1所示；重组表达载体pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF的示意图如图2所示。
1.2重组杆状病毒基因组的制备
将重组质粒pFastBac Dual-P97R1P46P42和pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中，经过蓝白斑筛选之后挑取重组DH10Bac菌斑，并进行杆状病毒基因组(Bacmid)的提取以及鉴定，具体如以下步骤：
1)使用42℃热激法将两种重组质粒转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中，然后涂布在含有LB固体培养基上，该LB固体培养基中含有以下抗生素等添加物(50μg/mLkanamycin，7μg/mL gentamicin，10μg/mL tetracycline，40μg/mL X-gal，40μg/mL IPTG)。
2)用牙签挑取多个白斑，然后再将其涂布在含有上述抗生素等添加物的LB固体培养基中进行二轮筛选。
3)挑取白斑，在含有以下抗生素(50μg/mL kanamycin，7μg/mL gentamicin，10μg/mL tetracycline)的LB液体培养基中培养12h。
4)收集4到5mL菌液菌体，用杆状病毒穿梭载体Bacmid小量抽提试剂盒进行重组Bacmid的抽提，然后保存在-80℃冰箱中。
5)用引物PpH_F(AACCATCTCGCAAATAAATAAG)和Psv40_R(AAACCACAACTAGAATGCAGTG)对重组Bacmid进行PCR扩增，以鉴定目的基因是否存在于杆状病毒基因组上，结果如图3所示。
6)用通用引物M13对重组Bacmid进行PCR扩增，以鉴定是否目的基因已经整合到重组到杆状病毒基因组的正确位点上，结果如图4所示。
1.3应用杆状病毒表达系统表达目的蛋白
1)取生长良好的Sf9细胞4×106个，重悬于12mL Sf900培养基中，按照每孔2mL用量铺六孔板，混匀后28℃静置生长过夜。
2)按照
Figure BDA0003267512700000091
6Transfection Reagent的使用说明将重组Bacmid转染到Sf9细胞中，于28℃静置培养3d，在第d天时观察细胞的发病状态并收集上清液作为P1代重组杆状病毒，其中实验组和阴性对照组(加转染试剂，不加重组Bacmid)的细胞状态如图5、6、7所示，具体的：
A：重组Bacmid-pFastBac Dual-P97R1P46P42转染结果。
B：重组Bacmid-pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF转染结果。
C：同一批Sf9细胞培养72h细胞状态观察。
3)将P1代重组杆状病毒按照0.5％的比例转接到细胞密度为2×106个/mL的生长良好的Sf9细胞中，培养72h后离心收集上清液得到P2代重组杆状病毒，然后再按照相同比例重复一次扩增得到P3代重组杆状病毒。
4)将P3代重组杆状病按照5％比例接种到20mL细胞密度为4×106个/mL的生长良好的Sf9细胞中，培养72h，离心收集细胞沉淀，用PBS重悬细胞至终体积为5mL，然后于冰上超声破碎，结束后按1mL/份分装并立即冻存于-80℃冰箱中。
1.4 Western Blot鉴定
1)取上述冻存的细胞悬液160μL，然后加入40μL 5×Loading Buffer，加热煮沸10min后做12％SDS-PAGE。
2)分别用重组蛋白rP97和rP42的兔多克隆抗体通过Western Blot方法来检测两种重组蛋白P97R1P46P42和P97R1P46P42-GMCSF，结果显示，两种重组蛋白均可以被检测到，检测结果如图8(rP42兔多克隆抗体)和图9(rP97兔多克隆抗体)所示。
1.5重组蛋白的纯化
将表达重组蛋白的细胞悬液在冰上超声破碎，再在12000rpm条件下离心20min分离上清液，用0.45μm滤膜过滤后作为镍离子亲和层析纯化的样品，纯化步骤如下：
1)将镍离子亲和层析柱中的液体流下，用10倍柱体积的ddH2O清洗，用3倍柱体积的纯化洗涤液His Buffer A洗涤3次，再加入过滤后的上清液，在摇床震荡并冰浴结合2h以上，然后，流出柱内液体作为流穿液；
2)用5倍柱体积的纯化洗涤液His Buffer A洗涤4次，并且每次在摇床上冰浴震荡洗涤5min以除去杂蛋白；
3)用2倍柱体积的纯化洗脱液His Buffer B洗涤3次，在摇床上冰浴震荡10min以洗脱目的蛋白，并且收集纯化过程中产生的各个样品做12％SDS-PAGE，如图10所示。
1.6免疫实验动物分组及免疫原制备
1)将24只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成以下四组：①PBS组；②P97R1P46P42免疫实验组；③P97R1P46P42-GMCSF免疫实验组；④商业疫苗组[支必宁，猪支原体肺炎活疫苗(168株)，兆丰华生物科技(南京)有限公司]。
2)用5mL注射器取上述-80℃冻存的1mL浓度为1mg/mL的纯化后重组蛋白或1mL细胞悬液，然后另一个5mL注射器取1mL弗式完全佐剂(初次免疫用)或弗式不完全佐剂(加强免疫用)，两个注射器之间用乳胶管连接，然后推注进行乳化，约30min后，将液体滴加到冷水面上，液滴不扩散则说明乳化完成，将乳化后的样品冰上保存，当天制备当天使用。将支必宁冻干粉疫苗用10mL专用稀释液稀释，然后按1mL/份分装保存在-20℃冰箱中。
1.7动物免疫实验
1)采用背部多点皮下注射方法，分别在第0、14和28d进行免疫，其中第0d为初次免疫，第14和28d为加强免疫。
PBS组每只小鼠注射200μL无菌PBS缓冲液；P97R1P46P42免疫实验组每只小鼠注射对应的200μL乳化后的P97R1P46P42重组蛋白或200μL乳化后的细胞悬液；P97R1P46P42-GMCSF免疫实验组每只小鼠注射对应的200μL乳化后的P97R1P46P42-GMCSF重组蛋白或200μL乳化后的细胞悬液；商业疫苗组每只小鼠注射100μL稀释液重悬的冻干粉疫苗。
2)第一次免疫后每隔7d则对小鼠进行尾部取血，离心分离血清后进行血清抗体水平检测，在初次免疫后第35和42d分别对每组3只小鼠分离脾淋巴细胞，然后做脾淋巴细胞增殖实验检测细胞免疫水平。体液免疫和细胞免疫的具体检测步骤如下：
(2.1)抗体水平检测
为了评估小鼠对于各种抗原所产生的体液免疫效应，采用间接ELISA法检测抗体水平。分别将抗原包被缓冲液稀释后rP46、rP42和rP97R1P46P42以1μg/mL浓度包板，ELISA封闭液封闭，分别孵育每隔7d采集分离的血清(抗体稀释液1:100稀释)，然后再孵育二抗，加显色液显色，其中上述每两步间均用ELISA洗涤液洗板4次，每次1min。最后加入ELISA终止液终止显色反应，检测450nm波长下的光密度(Optical density,OD)值。结果显示，P97R1P46P42-GMCSF免疫实验组所诱导产生的血清抗体水平均高于P97R1P46P42免疫实验组，说明分子佐剂GMCSF可以刺激机体产生更高水平的血清抗体，结果见图11～13。
(2.2)脾淋巴细胞增殖检测
为了评估小鼠对于各种抗原所产生的细胞免疫效应，使用小鼠淋巴细胞分离液(北京达科为生物技术有限公司)对免疫后35和42d的小鼠进行脾淋巴细胞分离，具体操作流程参见产品说明书。对分离后的各组脾淋巴细胞进行细胞计数，96孔板每孔加入100μL稀释至4×106个/mL的细胞悬液。37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞完全贴壁后，分别在每孔加入100μL稀释后的重组蛋白rP97R1P46P42(实验组，抗原工作浓度均为10μg/mL)，1640培养基(阴性对照组)与刀豆蛋白A(ConA，阳性对照组，工作浓度为10μg/mL)。将细胞放入CO2培养箱继续培养42h后每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h，弃尽细胞培养上清，每孔加入100μL DMSO，于振荡器上震荡混匀5min，最后检测490nm波长下的OD值，按照以下公式计算刺激指数(SI)，SI＝刺激孔OD-阴性对照孔OD平均值/ConA阳性对照组-阴性对照孔OD平均值。结果显示，与PBS组相比，重组蛋白P97R1P46P42和P97R1P46P42-GMCSF免疫后均能显著增加其脾淋巴细胞的刺激指数(P<0.0001或P<0.001)；且P97R1P46P42-GMCSF组显著高于P97R1P46P42组(P<0.0001)，说明分子佐剂GMCSF可以刺激机体产生更高水平的脾淋巴细胞增殖，结果见图14。
(2.3)细胞因子水平检测
参照试剂盒的使用说明(Mouse IgG1 ELISA Kit、Mouse IFN-γELISA Kit和Mouse IL-4ELISA Kit，)对免疫后第35和42d血清中IgG1以及细胞因子IFN-γ，IL-4的含量进行检测。结果显示，与对照组相比，重组蛋白P97R1P46P42和P97R1P46P42-GMCSF免疫后均能显著增加IgG1以及细胞因子IFN-γ、IL-4的水平(P<0.0001或P<0.001)；且P97R1P46P42-GMCSF组显著高于P97R1P46P42组(P<0.0001)，说明分子佐剂GMCSF可以刺激机体产生更高水平的脾淋巴细胞增殖，结果见图15～17。
综上所述，本发明应用杆状病毒表达系统表达猪肺炎支原体P97R1、P46和P42嵌合抗原蛋白(P97R1P46P42)以及融合了分子佐剂GMCSF的重组抗原蛋白(P97R1P46P42-GMCSF)，经镍柱纯化后重组蛋白或收集细胞并混合弗式佐剂乳化，然后免疫BALB/c小鼠，经实验检测证实GMCSF可以显著提高重组抗原蛋白诱导产生的体液免疫和细胞免疫反应，GMCSF可以作为猪肺炎支原体相关疫苗产品的分子免疫佐剂，有望为养猪业提供安全有效且操作简便的疫苗产品。
SEQ ID NO.1
ATGGTGTCAGCCATCGTGTTGTACGTTCTGTTGGCCGCCGCTGCCCATTCAGCTTTTGCTGAAGGCAAGCGCGAGGAAGTCGACAAGAAGGTGAAGGAGCTGGACAACAAGATCAAGGGAATCCTGCCTCAGCCTCCCGCTGCTAAGCCTGAGGCTGCCAAGCCAGTGGCTGCCAAGCCTGAAGCTGCCAAGCCCGTCGCTGCCAAGCCAGAGGCTGCCAAGCCTGTGGCTGCCAAGCCCGAAGCTGCCAAGCCAGTCGCTGCCAAACCAGAAGCCGCTAAACCTGAGGCCGCCAAGCCAGTCGCTACCAACACTAACACCAACACTGGTTTCTCTCTGACCAACAAGCCTAAGGAGGACTACTTCCCTATGGCTTTCTCCTACAAGCTGGAGTACACCGACGAAAACAAGCTGAGCCTGAAGACTCCCGAGATCAACGTGTTCCTGGAACTGGGTGGCTCAGGCCAGGACTACAACGACAAGGCTAAGACCTTCATCAAGGACGGAGACCAGAACATGACTATCTACAAGCCAGACAAGGTCCTGGGCAAGGTGGCCGTCGAAGTGCTGCGCGTGCTGATCGCTAAGAAGAACAAGGCCTCCCGTAGCGAAGTCGAGAACGAACTGAAGGCTAAGCTGCCTAACATCTCCTTCAAGTACGACAACCAGACCTACAAGGTGCAGGGCAAGAACATCAACACCATCCTGGTCTCTCCAGTCATCGTGACTAAGGCTAACGTGGACAACCCTGACGCCGGAGGTTCAGGAATCGAGGCTGCCCCAAGGGGACTGCCTCAGATCGAAGTCTCTTTCTCAATCGACGTGAACGGTATCACCACTGTCTCCGCTAAGGACAAGAAGACTGGCAAGGAGCAGACCATCACTATCAAGAACACCTCTACTCTGTCAGAGGAAGAGATCAACAAGATGATCCAGGAGGCTGAAGAGAACAGGGAAGCCGACGCTCTGAAGAAGGACAAGATCGAGACCACTGTGAGAGCCGAAGGACTGATCAACCAGCTGGAGAAGAGCATCACCGACCAGGGTGAAAAGATCGACCCTAAGCAGAAGGAGCTGCTGGAAAAGCAGATCCAGGAGCTGAAGGACCTGCTGAAGGAAGAGAAGACTGACGAGCTGAAGCTGAAGCTGGACCAGATCGAAGCTGCTGCTCAATCTTTCGCTCAGGCTACTGCTCAGCAGGCTAACACTTCCGAGAGCGACCCCAAGGCTGACGACAGCAACACCATCGACGCCGAAATCAAGCAGGAC
SEQ ID NO.2
TCTAGAGGTGGCCCTGGATCCTGGCTGCAGAACCTGCTGCTGCTGGGAACCGTGGTCTGCTCCATCAGCGCTCCTACCAGGCCTCCCTCTCCCGTGACTAGACCATGGCAGCACGTCGACGCTATCAAGGAGGCCCTGTCCCTGCTGAACAACAGCAACGACACCGCTGCCGTGATGAACGAAACTGTCGACGTGGTCTGCGAGATGTTCGACCCACAGGAACCTACCTGCGTGCAGACTCGCCTGAACCTGTACAAGCAGGGACTGCGCGGTTCCCTGACCCGTCTGAAGAGCCCACTGACTCTGCTGGCCAAGCACTACGAGCAGCACTGCCCTCTGACCGAGGAAACTTCTTGCGAAACCCAGTCAATCACTTTCAAGTCTTTCAAGGACTCACTGAACAAGTTCCTGTTCACTATCCCTTTCGACTGCTGGGGTCCCGTCAAGAAGCACC ACCACCACCACCACTAA
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
发明名称：
一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用
第一申请人：浙江洪晟生物科技股份有限公司
第二申请人：浙江理工大学
SEQ ID NO.1
ATGGTGTCAGCCATCGTGTTGTACGTTCTGTTGGCCGCCGCTGCCCATTCAGCTTTTGCTGAAGGCAAGCGCGAGGAAGTCGACAAGAAGGTGAAGGAGCTGGACAACAAGATCAAGGGAATCCTGCCTCAGCCTCCCGCTGCTAAGCCTGAGGCTGCCAAGCCAGTGGCTGCCAAGCCTGAAGCTGCCAAGCCCGTCGCTGCCAAGCCAGAGGCTGCCAAGCCTGTGGCTGCCAAGCCCGAAGCTGCCAAGCCAGTCGCTGCCAAACCAGAAGCCGCTAAACCTGAGGCCGCCAAGCCAGTCGCTACCAACACTAACACCAACACTGGTTTCTCTCTGACCAACAAGCCTAAGGAGGACTACTTCCCTATGGCTTTCTCCTACAAGCTGGAGTACACCGACGAAAACAAGCTGAGCCTGAAGACTCCCGAGATCAACGTGTTCCTGGAACTGGGTGGCTCAGGCCAGGACTACAACGACAAGGCTAAGACCTTCATCAAGGACGGAGACCAGAACATGACTATCTACAAGCCAGACAAGGTCCTGGGCAAGGTGGCCGTCGAAGTGCTGCGCGTGCTGATCGCTAAGAAGAACAAGGCCTCCCGTAGCGAAGTCGAGAACGAACTGAAGGCTAAGCTGCCTAACATCTCCTTCAAGTACGACAACCAGACCTACAAGGTGCAGGGCAAGAACATCAACACCATCCTGGTCTCTCCAGTCATCGTGACTAAGGCTAACGTGGACAACCCTGACGCCGGAGGTTCAGGAATCGAGGCTGCCCCAAGGGGACTGCCTCAGATCGAAGTCTCTTTCTCAATCGACGTGAACGGTATCACCACTGTCTCCGCTAAGGACAAGAAGACTGGCAAGGAGCAGACCATCACTATCAAGAACACCTCTACTCTGTCAGAGGAAGAGATCAACAAGATGATCCAGGAGGCTGAAGAGAACAGGGAAGCCGACGCTCTGAAGAAGGACAAGATCGAGACCACTGTGAGAGCCGAAGGACTGATCAACCAGCTGGAGAAGAGCATCACCGACCAGGGTGAAAAGATCGACCCTAAGCAGAAGGAGCTGCTGGAAAAGCAGATCCAGGAGCTGAAGGACCTGCTGAAGGAAGAGAAGACTGACGAGCTGAAGCTGAAGCTGGACCAGATCGAAGCTGCTGCTCAATCTTTCGCTCAGGCTACTGCTCAGCAGGCTAACACTTCCGAGAGCGACCCCAAGGCTGACGACAGCAACACCATCGACGCCGAAATCAAGCAGGAC
SEQ ID NO.2
TCTAGAGGTGGCCCTGGATCCTGGCTGCAGAACCTGCTGCTGCTGGGAACCGTGGTCTGCTCCATCAGCGCTCCTACCAGGCCTCCCTCTCCCGTGACTAGACCATGGCAGCACGTCGACGCTATCAAGGAGGCCCTGTCCCTGCTGAACAACAGCAACGACACCGCTGCCGTGATGAACGAAACTGTCGACGTGGTCTGCGAGATGTTCGACCCACAGGAACCTACCTGCGTGCAGACTCGCCTGAACCTGTACAAGCAGGGACTGCGCGGTTCCCTGACCCGTCTGAAGAGCCCACTGACTCTGCTGGCCAAGCACTACGAGCAGCACTGCCCTCTGACCGAGGAAACTTCTTGCGAAACCCAGTCAATCACTTTCAAGTCTTTCAAGGACTCACTGAACAAGTTCCTGTTCACTATCCCTTTCGACTGCTGGGGTCCCGTCAAGAAGCACCACCACCACCACCACTAA

Claims (10)

1.一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于其制备方法包括如下步骤：
步骤1)：获取目的基因的以及重组载体的构建；
步骤2)：重组杆状病毒基因组的制备；
步骤3)：应用杆状病毒表达系统表达目的蛋白；
步骤4)：目的蛋白的鉴定和纯化。
2.根据权利要求1所述的一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于：
所述目的基因的获取以及重组载体的构建包括如下步骤：
(1.1)获取猪GMCSF基因序列，对猪GMCSF基因序列的外显子序列进行密码子优化，并同时在其N端添加GGPGS蛋白接头并对其进行化学合成，化学合成后的目的基因连接在pUC57载体的EcoR V酶切位点之间，表达重组蛋白P97R1P46P42的质粒pFastBac Dual-P97R1P46P42保存在-80℃冰箱中；
(1.2)结合pFastBac Dual杆状病毒表达载体polyhedrin promoter下游的多克隆位点，利用PCR方法在GMCSF基因序列的前后两端引入Xba I和Hind III酶切位点，目的基因和载体经过双酶切后连接到载体pFastBac Dual-P97R1P46P42的Xba I和Hind III酶切位点之间，然后转化到E.coli TG1感受态细胞中，将鉴定成功后的重组载体命名为pFastBacDual-P97R1P46P42-GMCSF。
3.根据权利要求1所述的一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于：
所述重组杆状病毒基因组的制备包括如下步骤：
(2.1)将重组质粒pFastBac Dual-P97R1P46P42和pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中，经过蓝白斑筛选之后挑取重组DH10Bac菌斑，并进行杆状病毒基因组(Bacmid)的提取以及鉴定。
4.根据权利要求1所述的一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于：
所述应用杆状病毒表达系统表达目的蛋白包括如下步骤：
(3.1)取生长良好的Sf9细胞4×106个，重悬于12mL Sf900培养基中，按照每孔2mL用量铺六孔板，混匀后28℃静置生长过夜；
(3.2)按照FuG
Figure FDA0003267512690000021
6Transfection Reagent的使用说明将重组Bacmid转染到Sf9细胞中，于28℃静置培养3天，在第3天时观察细胞的发病状态并收集上清液作为P1代重组杆状病毒；
(3.3)将P1代重组杆状病毒按照0.5％的比例转接到细胞密度为4×106个/mL的生长良好的Sf9细胞中，培养72h后离心收集上清液得到P2代重组杆状病毒，然后再按照相同比例重复一次扩增得到P3代重组杆状病毒；
(3.4)将P3代重组杆状病按照5％比例接种到20mL细胞密度为2×106个/mL的生长良好的Sf9细胞中，培养72h，离心收集细胞沉淀，用PBS重悬细胞至终体积为5mL，然后于冰上超声破碎，结束后按1mL/份分装并立即冻存于-80℃冰箱中。
5.根据权利要求4所述的一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于：
步骤(3.4)中对表达的重组蛋白采用Western Blot鉴定，其鉴定包括如下步骤：
(4.1)取步骤(3.4)中冻存的细胞悬液160μL，然后加入40μL 5×Loading Buffer，加热煮沸10min后做12％SDS-PAGE；
(4.2)分别用重组蛋白rP97和rP42的兔多克隆抗体通过Western Blot方法来检测两种重组蛋白P97R1P46P42和P97R1P46P42-GMCSF。
6.根据权利要求3所述的一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于：步骤(2.1)具体如以下步骤：
(2.1.1)使用42℃热激法将两种重组质粒转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中，然后涂布在含有LB固体培养基上，该LB固体培养基中含有50μg/mL kanamycin，7μg/mLgentamicin，10μg/mL tetracycline，40μg/mL X-gal，40μg/mL IPTG；
(2.1.2)用牙签挑取多个白斑，然后再将其涂布在含有上述抗生素等物质的LB固体培养基中进行二轮筛选；
(2.1.3)挑取白斑，在LB液体培养基中培养12h；LB液体培养基含有50μg/mLkanamycin，7μg/mL gentamicin，10μg/mL tetracycline的抗生素；
(2.1.4)离心收集4到5mL菌液菌体，用杆状病毒穿梭载体Bacmid小量抽提试剂盒进行重组Bacmid的抽提，然后保存在-80℃冰箱中；
(2.1.5)用引物PpH_F：AACCATCTCGCAAATAAATAAG和Psv40_R：AAACCACAACTAGAATGCAGTG对重组Bacmid进行PCR扩增，以鉴定目的基因是否存在于杆状病毒基因组上；
(2.1.6)用通用引物M13对重组Bacmid进行PCR扩增，以鉴定是否目的基因已经整合到杆状病毒基因组的正确位点上。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-6任一项所述的疫苗，所述疫苗包含重组蛋白P97R1P46P42和重组蛋白GMCSF。
8.一种重组载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的表达重组蛋白P97R1P46P42，所述表达重组蛋白P97R1P46P42的N末端带有GP64蛋白的信号肽序列MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA。
9.一种重组载体，其特征在于，含有猪GMCSF基因序列。
10.一种重组蛋白，其特征在于，包含重组蛋白P97R1P46P42和重组蛋白GMCSF，重组蛋白P97R1P46P42的编码基因序列为SEQ ID NO.1，重组蛋白GMCSF的编码基因序列为SEQ IDNO.2。
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