CN109776657B - 重组诺如病毒vlp颗粒和制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供诺如病毒GII.4亚型和GI.1亚型VP1蛋白的氨基酸序列、包含其的病毒颗粒、制备该病毒样颗粒的酵母表达系统及其制备方法、包含其的组合物或试剂盒、针对其的抗体以及这些产物的用途。

Description

重组诺如病毒VLP颗粒和制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及重组诺如病毒VLP颗粒和制备方法及其用途。具体而言，本发明涉及重组诺如病毒VLP颗粒、其表达系统、包含其的产品、其产生方法及用途。

背景技术

诺如病毒(Norovirus，NoV)是引起全球5岁以下儿童急性肠胃炎爆发的主要病原体之一(Lanata CF,Fischer‐Walker CL,Olascoaga AC,Torres CX,Aryee MJ,Black RE,Child Health Epidemiology Reference Group of the World Health O,Unicef:Globalcauses of diarrheal disease mortality in children<5years of age:a systematicreview.PloS one 2013,8(9):e72788)。全球每年死于诺如病毒感染的5岁以下儿童约为20万人(O'Ryan M,Vidal R,Del Canto F,Salazar JC,Montero D:Vaccines for viral andbacterial pathogens causing acute gastroenteritis:Part I:Overview,vaccinesfor enteric viruses and Vibrio cholerae.Hum Vaccin Immunother 2015,11(3):584‐600；Patel MM,Widdowson MA,Glass RI,Akazawa K,Vinje J,Parashar UD:Systematicliterature review of role of noroviruses in sporadic gastroenteritis.EmergInfect Dis 2008,14(8):1224‐1231)。

另一项研究表明，1990-2014年间，全球急性腹泻中18％(95％CI 17-20)的病例与诺如病毒感染相关，并且这一比例与年龄不相关(即各年龄段均为该比例)(Ahmed SM,HallAJ,Robinson AE,Verhoef L,Premkumar P,Parashar UD,Koopmans M,Lopman BA:Globalprevalence of norovirus in cases of gastroenteritis:a systematic review andmeta‐analysis.Lancet Infect Dis 2014,14(8):725‐730)。2012年以来，诺如病毒已成为我国其他感染性腹泻病暴发的优势病原体(60％‐96％)，尤其自2014年冬季起，诺如病毒感染暴发疫情大幅增加，2015年1月1日‐11月15日通过突发公共卫生事件管理系统已报告88起，显著高于历年水平，主要发生在中、小学校(廖巧红、冉陆、靳淼、崔生辉、袁俊、马会来、班海群、孙立梅、罗莉、刘娜、段招军、余宏杰:传染病专报2015年11月17日第3卷第37期)。2017年1-6月，北京市共接到报告诺如病毒急性胃肠炎聚集性疫情511起，涉及16个区，病例7406例，疫情主要发生在小学、幼儿园等集体单位。与2016年同期相比(48起)增长了9.63倍(北京市疾控中心7月份新闻通稿)。

诺如病毒(Norovirus，NoV)原名为诺瓦克样病毒，属于杯状病毒科(Caliciviridae family，Desselberger U,Goodfellow I:Noroviruses:a global causeof acute gastroenteritis.Lancet Infect Dis 2014,14(8):664‐665)的一个独立属——诺如病毒属(Norovirus)。

根据进化树系谱分析法，诺如病毒分为至少7个遗传组(Genogroups)，标记为GI～GVII，其中GI、GII和GIV感染人类。自上世纪90年代中期以来，GII.4型逐渐成为全球的优势流行毒株。

由于诺如病毒很难人工培养，迄今没有成功的诺如病毒体外培养系统(只有部分尝试，见Moore MD,Goulter RM,Jaykus LA:Human norovirus as a foodborne pathogen:challenges and developments.Annu Rev Food Sci Technol 2015,6:411‐433)，故开发针对该病毒的疫苗面临很多难题，例如无法在培养状态中繁殖该病毒，也无法在合适的AGE动物模型中繁殖该病毒；同时，至今仍然无法使用标准的病毒学技术(包括病毒减毒)或者进行体外中和分析。目前全球市场上并无任何针对诺如病毒上市的疫苗产品，仅有日本武田研究所的重组NoV病毒双价疫苗处于临床二期阶段。

日本武田研究所的诺如病毒疫苗开发采用1990年代初贝勒医学院的专门技术(Jiang X,Wang M,Graham DY,Estes MK:Expression,self‐assembly,and antigenicityof the Norwalk virus capsid protein.J Virol 1992,66(11):6527‐6532)，其基于近期科研人员的一个发现:诺如病毒的VP1体外表达后，可在后续的纯化中自组装呈病毒样颗粒，在形态结构和抗原性方面与野生病毒类似。因此，该技术采用基因工程和细胞培养技术的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)研制诺如病毒疫苗。在制备诺如病毒的VLP的过程中，日本武田研究所应用昆虫细胞表达系统，这种表达系统表达量较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本很高。

针对国内外针对诺如病毒的疫苗研发的匮乏与困境，发明人意欲提供一种成本低廉、表达产量高、生产周期短、操作简便，同时生物安全性高的诺如病毒VLP及其酵母VP1蛋白表达系统，其中主要的技术改进如下:

第一、采用不同的NoV病毒VP1蛋白。

本发明欲采用的野生型诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1和野生型诺如病毒GI.1亚型毒株KF039736.1不同于日本武田研究所采用的GI.1和GII.4的毒株，例如，日本武田研究所采用的GII.4的毒株VLP衣壳蛋白的氨基酸序列和野生型诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1的VLP衣壳蛋白的氨基酸序列的同一性为94％，不能认为是同一种GII.4亚型毒株。

第二、采用酵母表达系统。

酵母表达系统不但具有昆虫细胞表达系统的优点，而且还克服了其缺点，培养周期短、方法技术简单、可以密度生长、高效大量表达目的蛋白(部分因为具有高表达的AOX启动子)，且表达的目的蛋白较少发生过糖基化；同时，酵母表达系统还优于目前大规模制备病毒样颗粒的方法中通常使用的植物表达系统。

第三、安全表达NoV病毒VP1蛋白。

采用无需甲醇诱导的组成型表达方式来表达NoV病毒VP1蛋白，进一步减少了有害物质甲醇的残留，提高了产品的安全性，实现了安全表达NoV病毒VP1蛋白的关键技术突破。

第四、实现了VLP高效纯化。

利用毕赤酵母表达出的NoV病毒VP1蛋白能够自发形成VLP颗粒，之后采用简单快捷的两步分离纯化工艺即可获得高纯度和均一度的NoV病毒VLP颗粒，解决了同类产品生产技术中存在的多步分离纯化所带来的纯度差收率低的问题，实现了VLP高效纯化。

第五、研究得到最适合的佐剂。

发明人发现佐剂也是重组疫苗开发成功的关键因素之一:佐剂的种类，蛋白和佐剂的配比等，极大影响重组蛋白疫苗的免疫原性。佐剂的研究，除了需要提高抗原的免疫原性，还得保证佐剂的安全性。因此，发明人发现筛选并研究得到最适合的佐剂。

为此，发明人在VLP三维结构解析基础上进行表达载体的构建，解决了VLP蛋白表达量低、组装效率低、颗粒不均匀等问题；从蛋白质结构优化和分子设计入手实现了大量制备VLP的技术突破，所产生的VLP在动物体内可以产生高滴度的针对NoV GI.1和GII.4病毒的中和抗体。

发明内容

除非另外限定，本文中所用的全部术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义，在使用部分以下术语的定义时，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。本文给出的部分术语的定义仅是为了描述具体的实施方案，并非旨在限制。

一方面，本发明提供了一种分离的诺如病毒GII.4亚型毒株的VP1蛋白的氨基酸序列，或其片段或变体，以及另一种诺如病毒GI.1亚型毒株的VP1蛋白的氨基酸序列，或其片段或变体。

术语“诺如病毒”属于杯状病毒科(Caliciviridae family)的诺如病毒属(Norovirus)。诺如病毒直径约为26～35nm，无包膜，球形，呈二十面体对称，病毒直径约27～40nm，由90个VP1蛋白的二聚体(即180个VP1蛋白)构成衣壳。诺如病毒基因组是由一条线性单股正链RNA(+ssRNA)组成，长度约7.5～7.7kb，在基因的5’端有共价结合的病毒蛋白VPg，3’端有Poly(A)；共3个编码框(ORF)，其中ORF2(～1.6kb)和ORF3(～0.6kb)分别编码病毒颗粒主要衣壳蛋白VP1和次要衣壳蛋白VP2。VP1蛋白由衣壳区(S结构域)和突出区(P结构域)组成，其中衣壳区在二聚体形成和颗粒组装中起重要左右，突出区是抗原表位的主要区域(参见图7)。单独的VP1即可以自组装为T＝3的直径约38nm的VLP(180个VP1)或T＝1的直径约20nm的小颗粒(60个VP1)。

在一些实施方案中，本发明的诺如病毒对于人类或非人哺乳类物种是感染性的。在一些实施方案中，诺如病毒在人类中引起急性胃肠炎。

在一些实施方案中，本发明的诺如病毒的主要衣壳蛋白(VP1)组装成的VLP具有与相应的亲本野生诺如病毒几乎相同的免疫原性。

在一些实施方案中，本发明的诺如病毒GII.4亚型毒株是毒株KJ678151.1(GenBank登录号)；本发明的诺如病毒GI.1亚型毒株是毒株KF039736.1(GenBank登录号)。

诺如病毒GI.1亚型的毒株是全球和中国最保守的毒株，由此，该毒株的免疫原性在绝大多数的诺如病毒中均存在，故针对这样的毒株的增强动物免疫反应的组合物可以预防绝大多数的诺如病毒感染。

诺如病毒GII.4亚型的毒株是2012年以来亚洲的流行毒株，由此，该毒株的免疫原性在亚洲近几年暴发的诺如病毒中均存在，故针对这样的毒株的增强动物免疫反应的组合物可以预防亚洲近几年暴发的诺如病毒感染。

术语“片段”是指全长核苷酸序列或氨基酸序列中的一部分。

术语“变体”、“变体序列”或“突变体”可以互换使用，是指与亲本核苷酸序列或氨基酸序列具有一定程度的核苷酸/氨基酸序列同一性的核苷酸序列或氨基酸序列。变体序列类似于亲本序列，但在其核苷酸序列或氨基酸序列中具有至少一个或几个或多个取代、缺失或插入，使得它们与亲本核苷酸序列或氨基酸序列不同。另外，变体可以保留亲本核苷酸序列或氨基酸序列的功能特征或活性，例如，保持亲本核苷酸序列或氨基酸序列的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的生物活性。“变体”包括自然界中本身就存在的天然变体、通过自然过程获得的天然变体，以及通过人工方法获得的人工变体。

术语“本发明的氨基酸序列”、“本发明的另一种氨基酸序列”与“本发明的诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1的VP1蛋白的氨基酸序列”和/或“本发明的诺如病毒GI.1亚型毒株KF039736.1的VP1蛋白的氨基酸序列”及其变体可以互换使用。

另一方面，本发明提供一种分离的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列(也称为“本发明的氨基酸序列”)，包含下述序列之一或由下述序列之一组成:

(1)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

(2)由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；

(4)在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的一处或多处具有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列，优选所述一处或多处氨基酸的氨基酸取代是一处或多处保守氨基酸的取代；和

(5)其核苷酸序列因遗传密码子的简并性而不同于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列如下：

ATGAAGATGGGCGTCGAGGTGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAACAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCCATTGCGGCACCTGTAGCGGGCCAACAAAATGTAATTGACCCCTGGATTAGAAATAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTTACAGTATCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAAATACTATGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATTTAAATCCCTACCTATCCCATTTGGCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATTCTCGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGAAAGGTCATATTTGCAGCAGTCCCACCAAATTTTCCAACTGAAGGCTTGAGCCCCAGCCAGGTCACTATGTTCCCCCATATAGTAGTAGATGTTAGGCAACTAGAACCTGTGTTGATTCCCTTACCCGATGTTAGGAATAATTTCTACCATTACAATCAATCAAATGACCCCACCATTAAGTTGATAGTAATGTTGTATACACCACTTAGGGCTAATAATGCTGGGGATGATGTCTTCACAGTTTCTTGCCGAGTTCTCACGAGACCATCCCCCGATTTTGATTTCATATTTCTAGTGCCACCCACAGTTGAGTCAAGAACTAAACCATTCTCTGTCCCAGTTTTAACTGTTGAGGAGATGACCAATTCAAGATTCCCCACTCCTTTGGAAAAGTTGTTCACGGGTCCCAGCAGTGCCTTTGTTGTTCAACCACAAAACGGTAGGTGCACGACTGATGGCGTGCTCCTAGGCACCACCCAACTGTCTCCTGTCAACATCTGCACCTTCAGAGGAGATGTCACCCATATCACAGGTAGTCGTAACTACACAATGAATTTGGCTTCTCAAAATTGGAGCAATTATGACCCAACAGAAGAAATCCCAGCCCCTCTAGGAACTCCAGATTTCGTGGGGAAGATTCAAGGCGTGCTCACCCAAACCACAAGGACAGATGGCTCAACACGCGGCCACAAAGCCACAGTGTACACTGGGAGCGCCGACTTTGCTCCAAAACTGGGCAGAGTTCAATTTGAAACTGACACAGACCATGATTTTGAAACTAACCAAAACACAAAATTCACCCCAGTTGGTGTCATCCAAGATGGTAGCACCACCCACCGAAATGAACCCCAACAGTGGGTGCTCCCAAGTTACTCAGGCAGAAATACTCCTAATGTGCATCTGGCCCCCGCTGTAGCCCCCACTTTTCCGGGTGAGCAACTTCTCTTCTTCAGATCCACCATGCCCGGATGCAGCGGGTACCCCAACATGGATTTGGACTGTCTGCTCCCCCAGGAATGGGTGCAGTACTTCTACCAAGAGGCAGCCCCAGCACAATCTGATGTGGCTCTGCTAAGATTTGTGAATCCAGACACAGGTAGGGTTTTGTTTGAGTGTAAGCTTCATAATCAGGCTATGTTACAGTGGCTCACACTGGCCAACATGATTTGGTTATCCCCCCCAATGGTTATTTTAGGTtTTGATTCCTGGGTCAACCAGTTTTACACGCTTGCCCCCATGGGAAATGGAACGGGGCGTAGACGTGCACTATAA

SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列如下：

MKMASSDANPSDGSAANLVPEVNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKVIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIVVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVESRTKPFSVPVLTVEEMTNSRFPTPLEKLFTGPSSAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNTCTFRGDVTHITGSRNYTMNLASQNWSNYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGVLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFAPKLGRVQFETDTDHDFETNQNTKFTPVGVIQDGSTTERNEPQQWVLPSYSGRNTPNVHLAPAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMDLDCLLPQEWVQYFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLEKSGYVTVAETGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRAL

在一个优选的实施方案中，本发明的分离的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列是在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中包含至多5处氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列。

在进一步优选的实施方案中，本发明的分离的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列是在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中包含至多5处保守氨基酸的取代的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，本发明的分离的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列来源于诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1。

另一方面，本发明提供另一种分离的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列(也称为“本发明的(另一种)氨基酸序列”)，包含下述序列之一或由下述序列之一组成：

(1)如SEQID NO：4所示的氨基酸序列；

(2)由SEQID NO：2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(3)与SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；

(4)在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中的一处或多处具有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列，优选所述一处或多处氨基酸的氨基酸取代是一处或多处保守氨基酸的取代；和

(5)其核苷酸序列因遗传密码子的简并性而不同于SEQID NO：2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列如下：

ATGATGATGGCGTCTAAGGACGCTACATCAAGCGTGGATGGCGCTAGTGGCGCTGGTCAGTTGGTACCGGAGGTTAATGCTTCTGACCCTCTTGCAATGGATCCTGTAGCAGGTTCTTCGACAGCAGTCGCGACTGCTGGACAAGTTAATCCTATTGATCCCTGGATAATTAATAATTTTGTGCAAGCCCCCCAAGGTGAATTTACTATTTCCCCAAATAATACCCCCGGTGATGTTTTGTTTGATTTGAGTTTGGGTCCCCATCTTAATCCTTTCTTGCTCCATCTATCACAAATGTATAATGGTTGGGTTGGTAACATGAGAGTCAGGATTATGCTAGCTGGTAATGCCTTTACTGCGGGGAAGATAATAGTTTCCTGCATACCCCCTGGTTTTGGTTCACATAATCTTACTATAGCACAAGCAACTCTCTTTCCACATGTGATTGCTGATGTTAGGACTCTAGACCCCATTGAGGTGCCTTTGGAAGATGTTAGGAATGTTCTCTTTCATAATAATGATAGAAATCAACAAACCATGCGCCTTGTGTGCATGCTGTACACCCCCCTCCGCACTGGTGGTGGTACTGGTGATTCTTTTGTAGTTGCAGGGCGAGTTATGACTTGCCCCAGTCCTGATTTTAATTTCTTGTTTTTAGTCCCTCCTACGGTGGAGCAGAAAACCAGGCCCTTCACACTCCCAAATCTGCCATTGAGTTCTCTGTCTAACTCACGTGCCCCTCTCCCAATCAGTAGTATGGGCATTTCCCCAGACAATGTCCAGAGTGTGCAGTTCCAAAATGGTCGGTGTACTCTGGATGGCCGCCTGGTTGGCACCACCCCAGTTTCATTGTCACATGTTGCCAAGATAAGAGGGACCTCCAATGGCACTGTAATCAACCTTACTGAATTGGATGGCACACCCTTTCACCCTTTTGAGGGCCCTGCCCCCATTGGGTTTCCAGACCTCGGTGGTTGTGATTGGCATATCAATATGACACAGTTTGGCCATTCTAGCCAGACCCAGTATGATGTAGACACCACCCCTGACACTTTTGTCCCCCATCTTGGTTCAATTCAGGCAAATGGCATTGGCAGTGGTAATTATGTTGGTGTTCTTAGCTGGATTTCCCCCCCATCACACCCGTCTGGCTCCCAAGTTGACCTTTGGAAGATCCCCAATTATGGGTCAAGTATTACGGAGGCAACACATCTAGCCCCTTCTGTATACCCCCCTGGTTTCGGAGAGGTATTGGTCTTTTTCATGTCAAAAATGCCAGGTCCTGGTGCTTATAATTTGCCCTGTCTATTACCACAAGAGTACATTTCACATCTTGCTAGTGAACAAGCCCCTACTGTAGGTGAGGCTGCCCTGCTCCACTATGTTGACCCTGATACCGGTCGGAATCTTGGGGAATTCAAAGCATACCCTGATGGTTTCCTCACTTGTGTCCCCAATGGGGCTAGCTCGGGTCCACAACAGCTGCCGATCAATGGGGTCTTTGTCTTTGTTTCATGGGTGTCCAGATTTTATCAATTAAAGCCTGTGGGAACTGCCAGCTCGGCAAGAGGTAGGCTTGGTCTGCGCCGATAA

SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列如下：

MMASKDATSSVDGASGAGQLVPEVNASDPLAMDPVAGSSTAVATAGQVNPIDPWIINNFVQAPQGEFTISPNNTPGDVLFDLSLGPHLNPFLLHLSQMYNGWVGNMRVRIMLAGNAFTAGKIIVSCIPPGFGSHNLTIAQATLFPHVIADVRTLDPIEVPLEDVRNVLFEHNNDRNQQTMRLVCMLYTPLRTGGGTGDSFVVAGRVMTCPSPDFNFLFLVPPTVEQKTRPFTLPNLPLSSLSNSRAPLPISSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVGTTPVSLSHVAKIRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHTNMTQFGHSSQTQYDVDTTPDTFVPHLGSIQANGIGSGNYVGVLSWISPPSHPSGSQVDLWKIPNYGSSITEATHLAPSVYPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHLASEQAPTVGEAALLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTASSARGRLGLRR

在一个优选的实施方案中，本发明另一种分离的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列是在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中包含至多5处氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列。

在进一步优选的实施方案中，本发明另一种分离的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列是在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中包含至多5处保守氨基酸的取代的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，本发明另一种分离的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列来源于诺如病毒GI.1亚型毒株KF039736.1。

相对于对照/参照氨基酸序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将一条氨基酸序列进行比对(并在必要时导入空位，任何保守取代不视为相同的序列)，以获取最大百分比序列同一性时，该条氨基酸序列中，与对照/参照多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目除以其总的氨基酸残基数目，得到的商(以百分比表示)。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。

当在本申请中提到序列同一性的百分比时，若未另外特别指出，这些百分比相对于较长序列的全长计算。相对于较长序列的全长计算适用于核酸序列和多肽序列两者。

术语“一处或多处氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入”优选为不超过10处(即，至多10处)、不超过9处、不超过8处、不超过7处、不超过6处、不超过5处、不超过4处、不超过3处、不超过2处、不超过1处氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入。

术语“保守取代/置换”是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代/置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代/置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代/置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代/置换。示例性的保守取代/置换如下表A所示:

表A

另一方面，本发明提供一种病毒样颗粒(VLP)，包含具有本发明的氨基酸序列的VP1蛋白，该VLP保留诺如病毒衣壳蛋白的真实构象，但是缺乏感染性遗传物质。故这样的VLP可以模拟诺如病毒与细胞受体的功能相互作用，由此引发适宜的宿主免疫应答，但是缺乏完整诺如病毒繁殖或引起感染的能力。

术语“本发明的病毒样颗粒”、“本发明的VLP”、“病毒样颗粒”和“VLP”可以互换使用，是指自诺如病毒的衣壳蛋白编码序列生成的，包含与感染性诺如病毒颗粒相似或几乎相同的抗原特征的病毒样颗粒、其碎片、聚集物或部分。

在一些实施方案中，本发明的VLP具有野生型诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1或野生型诺如病毒GI.1亚型毒株KF039736.1的形态结构。

在一个优选的实施方案中，该VLP是单价的，包含90个一种本发明的氨基酸序列形成的VP1二聚体或者90个另一种本发明的氨基酸序列形成的VP1二聚体；或者该VLP是二价的，包含90个一种本发明的氨基酸序列形成的VP1二聚体和另一种本发明的氨基酸序列形成的VP1二聚体，优选包含45个一种本发明的氨基酸序列形成的VP1二聚体和45个另一种本发明的氨基酸序列形成的VP1二聚体；所述VLP的粒径与野生型病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1或野生型诺如病毒GI.1亚型毒株KF039736.1一致。

在进一步优选的实施方案中，该VLP粒径为40-60nm(由DLS测定，优选为45-55nm)或在电镜下为约38nm。

在一个优选的实施方案中，该VLP保留野生型诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1或野生型诺如病毒GI.1亚型毒株KF039736.1的VP1蛋白形成VLP颗粒的能力及其免疫原性。

在进一步优选的实施方案中，该VLP能够诱导中和抗体的产生。

另一方面，本发明提供一种用于在酵母细胞中表达的核苷酸序列(也称为“本发明的用于在酵母细胞中表达的核苷酸序列”)，包含下述核苷酸序列之一或由下述核苷酸序列之一组成:

(1)如SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或其互补序列；

(2)编码本发明的氨基酸序列的核苷酸序列；

(3)核苷酸序列，其在严格杂交条件下与(1)或(2)所述的核苷酸序列杂交且编码具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4活性的氨基酸序列，其中所述严格杂交条件参见Sambrook等人，1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Nolan C.编著,New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press；以及

(4)其核苷酸序列因遗传密码子的简并性而不同于SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列的核苷酸序列。

这种用于在酵母细胞中表达的核苷酸序列可以不同于上述编码本发明的氨基酸序列的核苷酸序列，因为这种用于在酵母细胞中表达的核苷酸序列是针对宿主细胞及表达载体，进行了密码子优化的核苷酸序列，并任选加入了适当的修饰，例如内切酶的酶切位点、纯化tag、分泌肽等。

其中，SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列如下:

ATGAAGATGGCTTCTTCTGACGCTAACCCATCTGACGGTTCTGCTGCTAACTTGGTTCCAGAAGTTAACAACGAAGTTATGGCTTTGGAACCAGTTGTTGGTGCTGCTATCGCTGCTCCAGTTGCTGGTCAACAAAACGTTATCGACCCATGGATCAGAAACAACTTCGTTCAAGCTCCAGGTGGTGAATTTACTGTTTCTCCAAGAAACGCTCCAGGTGAAATCTTGTGGTCTGCTCCATTGGGTCCAGACTTGAACCCATACTTGTCTCACTTGGCTAGAATGTACAACGGTTACGCGGGTGGCTTCGAAGTTCAAGTTATCTTGGCTGGTAACGCTTTCACTGCTGGTAAGGTTATCTTCGCTGCTGTTCCACCAAACTTTCCAACTGAAGGCTTGTCTCCATCTCAGGTTACTATGTTCCCACACATCGTTGTTGACGTTAGACAATTGGAACCAGTTTTGATCCCATTGCCAGACGTTAGAAACAACTTCTACCACTACAACCAATCTAACGACCCAACTATCAAGTTGATCGCTATGTTGTACACTCCATTGAGAGCTAACAACGCTGGTGACGACGTTTTCACTGTTTCTTGTAGAGTTTTGACTAGACCATCTCCAGACTTCGACTTCATCTTCTTGGTTCCACCAACTGTTGAATCTAGAACTAAGCCATTCTCTGTTCCAGTTTTGACTGTTGAAGAAATGACTAACTCTAGATTCCCAACTCCATTGGAAAAGTTGTTCACTGGTCCATCTTCTGCTTTCGTTGTTCAACCACAAAACGGTAGATGTACTACTGACGGTGTTTTGTTGGGTACTACTCAATTGTCTCCAGTTAACATCTGTACTTTCAGAGGTGACGTTACTCACATCACTGGTTCTAGAAACTACACTATGAACTTGGCTTCTCAAAACTGGTCTAACTACGACCCAACTGAAGAAATCCCAGCTCCATTGGGTACTCCAGACTTCGTTGGTAAGATCCAAGGTGTTTTGACTCAAACTACTAGAACTGACGGTTCTACTAGAGGTCACAAGGCTACTGTTTACACTGGTTCTGCTGACTTCGCTCCAAAGTTGGGTAGAGTTCAATTCGAAACTGACACTGACCACGACTTCGAAACTAACCAAAACACTAAGTTCACTCCAGTTGGTGTTATCCAAGACGGTTCTACTACTCACAGAAACGAACCACAACAATGGGTTTTGCCATCTTACTCTGGTAGAAACACTCCAAACGTTCACTTGGCTCCAGCTGTTGCGCCCACATTCCCAGGTGAACAGTTGTTGTTCTTCAGATCTACTATGCCAGGTTGTTCTGGTTACCCAAACATGGACTTGGACTGTTTGTTGCCACAAGAATGGGTTCAATACTTCTACCAAGAAGCTGCTCCAGCTCAATCTGACGTTGCTTTGTTGAGATTCGTTAACCCAGACACTGGTAGAGTTTTGTTCGAATGTAAGTTGCACAAGTCTGGTTACGTTACTGTTGCTCACACTGGTCAACACGACTTGGTTATCCCACCAAACGGTTACTTCAGATTCGACTCTTGGGTTAACCAATTCTACACTTTGGCTCCAATGGGTAACGGTACTGGTAGAAGAAGAGCTTTGTAA

SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列如下：

ATGATGATGGCTTCTAAGGACGCTACTTCTTCTGTTGACGGTGCTTCTGGTGCTGGTCAATTGGTTCCAGAAGTTAACGCTTCTGACCCATTGGCTATGGACCCAGTTGCTGGTTCTTCTACTGCTGTTGCTACTGCTGGTCAAGTTAACCCAATCGACCCATGGATCATCAACAACTTCGTTCAAGCTCCACAAGGTGAATTTACTATCTCTCCAAACAACACTCCAGGTGACGTTTTGTTCGACTTGTCTTTGGGTCCACACTTGAACCCATTCTTGTTGCACTTGTCTCAAATGTACAACGGTTGGGTTGGTAACATGAGAGTTAGAATCATGTTGGCTGGTAACGCTTTCACTGCTGGTAAGATCATCGTTTCTTGTATCCCACCAGGTTTCGGTTCTCACAACTTGACTATCGCTCAAGCTACTTTGTTCCCACACGTTATCGCTGACGTTAGAACTTTGGACCCAATCGAAGTTCCATTGGAAGACGTTAGAAACGTTTTGTTCCACAACAACGACAGAAACCAACAAACTATGAGATTGGTTTGTATGTTGTACACTCCATTGAGAACTGGTGGTGGTACTGGTGACTCTTTCGTTGTTGCTGGTAGAGTTATGACTTGTCCATCTCCAGACTTCAACTTCTTGTTCTTGGTTCCACCAACTGTTGAACAAAAGACTAGACCATTCACTTTGCCAAACTTGCCATTGTCTTCTTTGTCTAACTCTAGAGCTCCATTGCCAATCTCTTCTATGGGTATCTCTCCAGACAACGTTCAATCTGTTCAATTCCAAAACGGTAGATGTACTTTGGACGGTAGATTGGTTGGTACTACTCCAGTTTCTTTGTCTCACGTTGCTAAGATCAGAGGTACTTCTAACGGTACTGTTATCAACTTGACTGAATTGGACGGTACTCCATTCCACCCATTCGAGGGTCCAGCTCCAATCGGTTTCCCAGACTTGGGTGGTTGTGACTGGCACATCAACATGACTCAATTCGGTCACTCTTCTCAAACTCAATACGACGTTGACACTACTCCAGACACTTTCGTTCCACACTTGGGTTCTATCCAAGCTAACGGTATCGGTTCTGGTAACTACGTTGGTGTTTTGTCTTGGATCTCTCCACCATCTCACCCATCTGGTTCTCAAGTTGACTTGTGGAAGATCCCAAACTACGGTTCTTCTATCACTGAAGCTACTCACTTGGCTCCATCTGTTTACCCACCAGGTTTCGGTGAAGTTTTGGTTTTCTTCATGTCTAAGATGCCAGGTCCAGGTGCTTACAACTTGCCATGTTTGTTGCCACAAGAATACATCTCTCACTTGGCTTCTGAACAAGCTCCAACTGTTGGTGAAGCTGCTTTGTTGCACTACGTTGACCCAGACACTGGTAGAAACTTGGGTGAATTTAAGGCTTACCCAGACGGTTTCTTGACTTGTGTTCCAAACGGTGCTTCTTCTGGTCCACAACAATTGCCAATCAACGGTGTTTTCGTTTTCGTTTCTTGGGTTTCTAGATTCTACCAATTGAAGCCAGTTGGTACTGCTTCTTCTGCTAGAGGTAGATTGGGTTTGAGAAGATAA

在一个优选的实施方案中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供诺如病毒VP1病毒样颗粒的酵母表达系统(也称为“本发明的酵母表达系统”)，至少包括:(1)编码本发明的氨基酸序列的核苷酸序列，或上述用于在酵母细胞中表达的核苷酸序列；(2)质粒表达载体(也称为“本发明的质粒表达载体”)；和(3)酵母细胞(也称为“本发明的酵母细胞”)。

在一些实施方案中，本发明的酵母表达系统还包括宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明的酵母表达系统中的质粒表达载体包含诺如病毒的衣壳蛋白编码序列。

在一个优选的实施方案中，本发明的质粒表达载体将包含上述用于在酵母细胞中表达的核苷酸序列，或编码本发明的氨基酸序列(优选SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列)的核苷酸序列。

在进一步优选的实施方案中，本发明的质粒表达载体包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列优选进行了密码子优化及相应的修饰，以更好的表达本发明的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，本发明的质粒表达载体是组成型质粒表达载体。

在进一步优选的实施方案中，本发明的质粒表达载体是组成型质粒表达载体pGAPZαA。

在一些实施方案中，本发明的酵母表达系统中的宿主细胞(也称为“本发明的宿主细胞”)是用于大量扩增本发明的质粒表达载体的宿主细胞，其可以是任何本领域已知的合适宿主细胞，包括真核宿主细胞和原核宿主细胞。

在一个优选的实施方案中，该宿主细胞是大肠杆菌细胞。

在进一步优选的实施方案中，该宿主细胞是大肠杆菌DH5α细胞。

在一些实施方案中，本发明的酵母表达系统中的酵母细胞是假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、汉逊酵母属(Hanseaula)和毕赤酵母属(Pichia)物种。

在一个优选的实施方案中，该甲醇酵母细胞是毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核生物表达系统的许多优点:蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不但如此，毕赤酵母表达系统的操作和培养方法与大肠杆菌表达系统同样简单、方便、快捷。与昆虫细胞或哺乳动物等其他真核表达系统相比，毕赤酵母表达系统周期更短、代价更低，且表达水平更高。即便与同样属于酵母菌的酿酒酵母酵母相比，毕赤酵母外源蛋白表达水平仍然是后者的十倍甚至百倍，这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

毕赤酵母属于需氧型生物，对氧气的要求较高，在大规模发酵时应密切关注其通气量，在摇瓶培养时应注意培养基体积不超过摇瓶总体积的1/5，且瓶口宜用透气性好的封口膜进行封口。毕赤酵母适宜的生长温度是28～30℃，温度超过32℃对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。

在进一步优选的实施方案中，该毕赤酵母细胞是毕赤酵母X33(Pichia pastorisX33)细胞。

X33菌株可以在酵母基本培养基YPD培养基中生长，也可以在扩增培养基BMGY培养基和表达用培养基BMMY培养基中生长，其表达方式可以为胞内表达和胞外表达，取决于被表达蛋白N端是否有信号肽。X33毕赤酵母菌株被推荐用来表达含有Zeocin抗性的重组载体质粒，例如pPICZ A,B,C等诱导表达载体和pGAPZ A,B,C等组成型表达载体，在筛选X33重组转化菌株时，Zeocin抗生素的工作浓度时100μg/ml。

术语“载体”是指能够将核酸序列转移至靶细胞的载体。例如，载体可以包含能够在靶细胞中表达的编码核苷酸序列。在本发明中，“载体”通常是指能够引导目的基因表达并且可用于将目的基因转移到靶细胞中的任何核酸构建体。因此，该术语包括构建载体和表达载体，以及整合载体。

本发明中因为VP1蛋白表达所用的pGAPZαA载体的启动子为组成型表达启动子，因此无需添加甲醇诱导，仅使用BMGY培养基即可获得目的蛋白。这样避免了甲醇的残留及其对终产物无法避免的污染，使得本发明得到的病毒样颗粒在用于医药用途时更为安全。

另一方面，本发明提供了一种制备诺如病毒VP1病毒样颗粒的方法，包括在表达本发明的氨基酸序列的编码核苷酸序列、本发明的用于在酵母细胞中表达的核苷酸序列和本发明的病毒样颗粒的条件下，培养本发明的酵母细胞。

在一个优选的实施方案中，本发明制备诺如病毒VP1病毒样颗粒的方法包括以下步骤:

步骤(1)获得本发明的氨基酸序列的编码核苷酸序列(也称为“本发明的核苷酸序 列”):其中本发明的氨基酸序列优选为野生型诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1的VP1蛋白的氨基酸序列，或其片段或变体，或者野生型诺如病毒GI.1亚型毒株KF039736.1的VP1蛋白的氨基酸序列，或其片段或变体，更优选的，本发明的氨基酸序列包含氨基酸序列SEQ IDNO:3-4，或由氨基酸序列SEQ ID NO:3-4组成。

进一步优选本发明的核苷酸序列包含核苷酸序列SEQ ID NO:1-2，或由核苷酸序列SEQ ID NO:1-2组成。

最优选地，将用于导入本发明的质粒表达载体的NoV-VP1-GII.4基因(也称为“本发明的NoV-VP1-GII.4基因”)的核苷酸序列SEQ ID NO:1进行修饰，得到优化后的核苷酸序列SEQ ID NO:5，其任选可以包括两端的酶切位点以及5’端的GAAACGATGNN的Kozak序列(该序列被报导认为可以将目的蛋白在毕赤酵母中的表达量提高2～3倍)和3’端的终止密码子。

最优选地，将用于导入本发明的质粒表达载体的NoV-VP1-GI.1基因(也称为“本发明的NoV-VP1-GI.1基因”)的核苷酸序列SEQ ID NO:2进行修饰，得到优化后的核苷酸序列SEQ ID NO:6，其任选可以包括两端的酶切位点以及5’端的GAAACGATGNN的Kozak序列(该序列被报导认为可以将目的蛋白在毕赤酵母中的表达量提高2～3倍)和3’端的终止密码子。

本发明所用的术语“获得”和“获自”可以是从天然来源分离得到，也可以是通过已知的方法人工合成得到，可以包括为了便于进一步的加工而加入酶切位点等，也包括为了在宿主细胞中更好的表达，而进行密码子优化等所有可能的修饰和改变。

任选的步骤(2)合成本发明的NoV-VP1-GII.4基因和NoV-VP1-GI.1基因:将本发明的NoV-VP1-GII.4基因和NoV-VP1-GI.1基因克隆入pPink-HC构建载体中，进行扩增，可以是送往商业合成公司进行大量的扩增。

任选的步骤(3)将本发明的核苷酸序列转入质粒表达载体:酶切后，将本发明的核苷酸序列转入质粒表达载体。优选地，用内切酶BstBI和EcoRI对纯化的pPink-HC-NoV-VP1-GII.4质粒载体和pPink-HC-NoV-VP1-GI.1基因进行双酶切，同时用BstBI和EcoRI对质粒表达载体进行双酶切，该质粒表达载体优选为组成型质粒表达载体，更优选为组成型质粒表达载体pGAPZαA。

任选的步骤(4)质粒表达载体的大量扩增:将步骤(3)中获得的已导入本发明的NoV-VP1-GII.4基因和NoV-VP1-GI.1基因的质粒表达载体转入合适的宿主细胞，在合适的培养条件下，扩增所述质粒表达载体，其中所述宿主细胞是感受态细胞。

该宿主细胞优选是大肠杆菌细胞，更优选是大肠杆菌DH5α细胞，培养所用的培养基优选是LB液体培养基。

任选的步骤(5)线性化步骤(4)中大量扩增的质粒表达载体:首先，获得步骤(3)中的质粒表达载体，或步骤(4)中大量扩增的质粒表达载体，优选通过抽提步骤，获得包含本发明的NoV-VP1-GII.4基因和NoV-VP1-GI.1基因的质粒表达载体，更优选通过抽提步骤，获得pGAPZαA-NoV-VP1-GII.4和pGAPZαA-NoV-VP1-GI.1质粒表达载体；

其次，线性化已大量扩增的质粒表达载体，优选对pGAPZαA-NoV-VP1-GII.4和pGAPZαA-NoV-VP1-GI.1质粒表达载体采用BamHI进行单酶切线性化，并采用乙醇沉淀法回收线性化后的质粒。

步骤(6)在酵母细胞中表达本发明的核苷酸序列:在合适的培养条件下，培养已转入本发明的核苷酸序列或本发明的用于在酵母细胞中表达的核苷酸序列的酵母细胞，或者培养已转入线性化的pGAPZαA-NoV-VP1-GII.4和pGAPZαA-NoV-VP1-GI.1质粒表达载体的酵母细胞24-72小时，转化可以是本领域任何已知的转化方式，优选是电转化方式；该酵母细胞优选是毕赤酵母细胞，更优选是毕赤酵母X33细胞。

任选的步骤(7)提取和纯化本发明的诺如病毒VP1蛋白及其自组装:裂解步骤(6)中得到的酵母细胞，然后纯化得到本发明的诺如病毒VP1蛋白；其中裂解可以是超声裂解，或者破壁酶和超声裂解的组合，破壁酶优选是Lyticase酶；

纯化优选是两步分离纯化步骤，更优选是先进行的离子交换层析步骤，和之后进行的分子筛层析步骤的组合，最优选地，离子交换层析步骤采用sourse15Q，分子筛层析步骤采用superdex200GL。

任选的步骤(8)本发明的诺如病毒VP1蛋白的VLP的鉴定:可以通过现有技术中已知的技术鉴定本发明的诺如病毒VP1蛋白的VLP的正确形成，优选通过质谱检测、DLS粒径检测和或电镜负染检测中的一种或几种。

上述该方面可以仅仅包括上述步骤(1)-(8)中的一步或几步，但至少需要进行步骤(1)和步骤(6)；并且，上述步骤(1)-(8)的顺序并不固定，仅仅是优选按照步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)、步骤(7)和步骤(8)的顺序进行，且其中的步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(7)和步骤(8)均不是必需采用的步骤，而是可选采用的步骤。

上述该方面涉及的任何操作步骤均可采用本领域任何已知并适合的操作步骤来进行。

另一方面，本发明提供可以增强动物免疫反应的组合物或试剂盒(也称为“本发明的组合物”或“本发明的试剂盒”)，其中所述组合物优选是预防用或治疗用的药物组合物，或诊断试剂盒。

在一个优选的实施方案中，该预防用药物组合物优选是诺如病毒疫苗制剂，包含本发明的病毒样颗粒及可药用佐剂，其中本发明的病毒样颗粒可以相同或不同，优选是包含一种本发明的氨基酸序列的单价病毒样颗粒，或者包含两种不同的本发明的氨基酸序列的二价病毒样颗粒。

术语“疫苗”是指含有如上所述的本发明的诺如病毒VLP或其他诺如病毒抗原的制剂，其能够对脊椎动物，特别是对人施用并诱导保护性免疫应答的形式，该保护性免疫应答足以诱导免疫力，以预防和/或改善诺如病毒感染或诺如病毒诱导的疾病和/或减轻诺如病毒感染或疾病的至少一种症状。

术语“免疫应答”指体液免疫应答和由细胞介导的免疫应答二者。体液免疫应答涉及对B淋巴细胞生成抗体的刺激，该抗体例如中和传染物质、阻断传染物质进入细胞、阻断传染物质的复制、和/或保护宿主细胞免于感染和破坏。由细胞介导的免疫应答指由脊椎动物(例如人)展现的，由T淋巴细胞和/或其他细胞(例如巨噬细胞)介导的针对传染物质的免疫应答，其预防或改善感染或减轻其至少一种症状。具体而言，“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指由脊椎动物(例如人)展现的，针对传染物质的免疫力或针对传染物质引发免疫应答，其预防或改善感染或减轻其至少一种症状。

具体而言，由本发明的疫苗的施用诱导的保护性免疫应答表现为消除或降低急性胃肠炎的一种或多种症状的存在，或缩短此类症状的持续时间或降低其严重程度。由诺如病毒引起的胃肠炎的临床症状包括恶心、腹泻、稀粪、呕吐、发烧和全身不舒服。降低或消除疾病症状的保护性免疫应答会降低或终止诺如病毒爆发在人群中的传播。疫苗制备物一般性记载于Vaccine Design(“The subunit and adjuvant approach”(Powell M.F.和Newman M.J.编)(1995)Plenum Press New York)。

本发明的组合物可配制为用于例如投递至口、胃肠、和呼吸(例如鼻)粘膜中一项或多项的制剂。本发明的组合物可以例如配制为用于通过注射(诸如胃肠外注射(例如静脉内、皮下、皮内或肌肉内注射))而施用的制剂。

疫苗组合物包含与诺如病毒抗原组合的一种或多种佐剂。大多数佐剂含有设计用于保护抗原免于快速代谢的物质(诸如氢氧化铝或矿物油)以及免疫应答刺激物(诸如百日咳博德特氏菌(Bordatella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)衍生的蛋白质)。合适的佐剂可通过商业途径获得，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(PifcoLaboratories,Detroit,Mich.)；Merck佐剂65(默克公司,Inc.,Rahway,N.J.)；铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸酰化糖的不溶性悬浮液；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；和Quil A。

术语“佐剂的有效量”是指能够刺激针对所施用抗原的免疫应答的一种或多种佐剂量，即提高针对所施用抗原组合物的免疫应答的量，如增加洗鼻液中的IgA水平、血清IgG或IgM水平、或B和T细胞增殖。与施用没有任何佐剂的相同抗原组合物相比，佐剂的有效量是指免疫球蛋白水平的升高超过5％、优选超过25％、特别是超过50％的佐剂量。

在一个优选的实施方案中，该预防用药物组合物中的可药用佐剂是氢氧化铝佐剂。

发明人研制了可供筛选的20种铝佐剂，并与商业化铝佐剂共同进行了小鼠免疫原性比较研究，筛选确定了最优铝佐剂。发明人还开展了包括抗原与佐剂吸附动力学、抗原吸附后结构确证、抗原吸附于佐剂后的分布等研究。发明人确定了处方缓冲体系的组成和佐剂的用量，组方配比等。

在一个优选的实施方案中，该疫苗制剂是可经粘膜途径施用的疫苗制剂。

在一个优选的实施方案中，该疫苗制剂的单次施用剂量为1-5000μg本发明的病毒样颗粒，更优选为5-3000μg本发明的病毒样颗粒，最优选为10-1000μg本发明的病毒样颗粒，所述佐剂的有效量为1-3000μg，优选为10-1250μg。

在一个优选的实施方案中，该动物优选是哺乳动物，更优选是人。

另一方面，本发明提供制备增强动物免疫应答的方法，其中包括将本发明的组合物或本发明的氨基酸引入动物体内的步骤。该方法覆盖本发明的氨基酸、本发明的核苷酸、本发明的VLP及本发明的组合物在制备用于增强动物免疫应答的药物或其他物质中的用途，或在制备用于检查动物针对诺如病毒的免疫应答增强的试剂盒中的用途。

在一个优选的实施方案中，该免疫应答是增强的B细胞应答或增强的T细胞应答。

在一个优选的实施方案中，该免疫应答是针对本发明的VLP的中和抗体的产生，优选是针对诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1和或诺如病毒GI.1亚型毒株KF039736.1的中和抗体的产生。

术语“中和抗体”是指当病毒侵入机体时，B淋巴细胞产生的一种抗体，能够与病毒表面的抗原结合，阻止病毒感染细胞，最终防止病毒颗粒侵入目标细胞。

在一个优选的实施方案中，该动物是哺乳动物，优选是人。

在一个优选的实施方案中，该组合物通过皮下、肌肉内、静脉内、鼻内、胃肠外、经粘膜或直接导入淋巴结内来导入动物体内，优选经粘膜导入动物体。

另一方面，本发明提供针对本发明的病毒样颗粒的抗体，该抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

在一个优选的实施方案中，该抗体为单克隆抗体。

另一方面，本发明提供本发明的病毒样颗粒的用途，用于以下用途:

(1)筛选野生型诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1或野生型诺如病毒GI.1亚型毒株KF039736.1的抑制剂；

(2)制备预防病毒性急性肠胃炎的疫苗；

(3)制备预防或治疗病毒性急性肠胃炎的药物组合物；

(4)制备用于诊断病毒性急性肠胃炎的诊断试剂盒；

(5)作为免疫原，研制抗体及检测试剂盒。

在下面的附图和实施方案中进一步说明本发明。然而，这些附图和实施方案不应被认为限制本发明的范围，并且本领域技术人员容易想到的改变将包括在本发明的精神和所附权利要求的保护范围内。

附图说明

图1.显示构建重组质粒时，酶切产物的电泳结果,泳道1为目的条带，泳道M为DNA分子量标准。

图2.显示胶回收目的载体的回收片段的电泳结果，泳道1为经BstBI和EcoRI酶切过的pGAPZαA，泳道M为DNA分子量标准。

图3.显示重组质粒载体的测序结果。

图4.显示重组质粒提取及线性化的电泳结果，泳道M为DNA分子量标准，泳道1和2分别为线性化前后的重组载体。

图5.显示重组质粒载体转化入毕赤酵母后，菌落PCR鉴定的结果，C-和C+泳道分别为阴性对照和阳性对照，1-9泳道为不同的单克隆。

图6.显示毕赤酵母X33小试表达的结果，M为蛋白标准分子量，泳道C-和C+为阴性对照和阳性对照，泳道1～5为不同的菌落小试表达结果。

图7.显示诺如病毒的结构。A:VP1蛋白的结构域示意图；B:病毒颗粒三维结构(根据冷冻电镜结果构建，分辨率3.4埃)；C:VP1蛋白二聚体结构；D:VP1的P结构域的三维结构；E：诺如病毒组装示意图(部分来自Anne M.Hutson et al.Norovirus disease:changingepidemiology and host susceptibility factors.TRENDS in Microbiology 12:279-287(2004))。

图8.显示目的蛋白sourse15Q的分离纯化结果，泳道M为蛋白标准分子量，泳道穿透为sourse15Q上扬过程中的穿透，泳道1-8为不同的目的蛋白洗脱产物。

图9.显示目的蛋白分离纯化的最终结果，泳道M为蛋白分子量标准，泳道C+为阳性对照，泳道1-5为不同管收集的洗脱样品，泳道1和泳道2为目的蛋白峰。

图10.显示目的蛋白的表达和质谱鉴定，其中C+为发明人纯化的大肠杆菌表达的GII.4VP1蛋白。

图11.显示重组诺如病毒VP1蛋白的纯化结果。

图12.显示纯化后的VP1蛋白经动态光散射检测结果示意图。

图13.纯化后的VLP颗粒电镜负染结果示意图。图示VLP颗粒。

图14.结合抗体和中和抗体检测。

具体实施方式

本发明中使用标准方法操纵遗传物质，如Sambrook，J.等人，Molecular cloning:A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989所述。分子生物试剂根据制造商的说明使用。

I.诺如病毒GII.4的VP1蛋白的表达及检验

实施例1.pGAPZαA-NoV-VP1-GII.4基因合成和载体构建

1.基因合成

根据诺如病毒GII.4亚型KJ678151.1毒株VP1蛋白基因序列，合成得到NoV-VP1-GII.4基因，其具体序列如SEQ ID No.5所示，并在两端加上酶切位点碱基，5’端加上GAAACG的Kozak序列和3’端加上终止密码子。合成之后连入pPink-HC构建质粒载体，得到pPink-HC-NoV-VP1-GII.4。

2.酶切

用BstBI和EcoRI对克pPink-HC-NoV-VP1-GII.4构建质粒载体进行双酶切，获得两个片段，其中小片段约1634bp，如图1所示，泳道1为目的条带，泳道M为DNA分子量标准。同时用BstBI和EcoRI对pGAPZαA进行双酶切，如图2所示，泳道1为经BstBI和EcoRI酶切过的pGAPZαA，泳道M为DNA分子量标准。

3.连接

利用胶回收试剂盒分别回收pPink-HC载体的小片段和pGAPZαA中的条带，然后利用T4连接酶在16℃条件下过夜连接，获得重组表达质粒pGAPZαA-NoV-VP1-GII.4。

4.转化

将获得的重组表达质粒pGAPZαA-NoV-VP1-GII.4转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后在1.5mlEP管中37℃摇菌1h，离心去掉上清液，取剩余的200ml菌液和菌体重悬，接着在含有Zeocin抗生素的LLB固体培养基上涂板，37℃过夜培养，随机挑取单克隆进行PCR检测。

5.阳性克隆的检测和确定

(1)PCR检测

PCR扩增检测体系20μl，包括引物NoV-FL-F(5’-CGAAGAAA CGATGAAGATGGCTTCTTCTGACGCTAAC-3’)和NoV-FL-R

(5’-AAGAAACGATGAAGATGGCTTCTTCTGACGCTAAC-3’)，0.2μl Taq DNA聚合酶(10单位/μl)，2μl的10XPCR缓冲液(含有MgCl₂)，菌落模板(待测菌落)，0.25μl的dNTP(2.5mmol/L)，15.55μl去离子无菌水；PCR条件:95℃10min；94℃60s，55℃45s，72℃2min，25次循环；72℃延伸10min；电泳检测PCR扩增产物，挑选扩增片段长度大约为1634bp的阳性菌落。

(2)测序确定阳性克隆载体

选择PCR检测为阳性的单菌落进行单向测通测序，其测序引物为3’AOX通用引物，测序结果与合成的目的基因序列进行比对，结果完全符合的单菌落确定为阳性克隆载体，如图3所示。

实施例2.载体提取及转化毕赤酵母X33

1.表达载体扩繁及线性化

将测序正确的菌株摇菌培养后提取质粒，采用BamHI对重组质粒进行单酶切线性化。线性化体系共50μl，包括重组载体20μl，BamHIμl(3000U)，Cutsmart缓冲液5μl，其余用无菌去离子水补齐。将体系混合均匀后置于37℃水浴中酶切3h。酶切结束后用电泳检测酶切效果，如图4所示，泳道M为DNA分子量标准，泳道1和2分别为线性化前后的重组载体。

2.毕赤酵母X33感受态细胞制作及重组载体的电转化

按照标准流程制作毕赤酵母X33的感受态细胞，并将线性化的重组载体和感受态细胞孵育。然后用电转仪进行电转化，电转化参数为1KV/mm。电转化后的样品中加入YPDS液体培养液，置于30℃培养2-4h，之后涂布含有Zeocin的YPDS平板，将所述的平板放置于30℃培养3～4天。

3.阳性毕赤酵母菌落的检测和蛋白检测

(1)菌落PCR检测

首先将待测平板上的菌落进行如下处理。分别挑取待测菌落，各与10μl TAE缓冲液混合均匀，于微波炉中执行以下操作:高火3.5min，振荡，高火2min，振荡，高火1.5min，振荡，高火1min，振荡，高火30s，振荡，放置于-20℃30min，100℃沸水浴5min，得到待测菌液模板。PCR扩增检测体系20μl，包括引物NoV-FL-F(5’-CGAAGAAACGATGAAGATGGCTTCTTCTGACGCTAAC-3’)和NoV-FL-R(5’-AAGAAACGATGAAGATGGCTTCTTCTGACGCTAAC-3’)，0.2μl Taq DNA聚合酶(10单位/μl)，2μl的10XPCR缓冲液(含有MgCl₂)，菌液模板5μl，0.25μl的dNTP(2.5mmol/L)，10μl去离子无菌水；PCR条件:95℃10min；94℃60s，55℃45s，72℃2min，25次循环；72℃延伸10min；电泳检测PCR扩增产物，如图5所示，C-和C+泳道分别为阴性对照和阳性对照，1-9泳道为不同的单克隆。

(2)小试表达培养及蛋白表达的SDS-PAGE

取上述菌落，在BMGY培养基中进行培养小试表达，其表达无需添加任何诱导剂，在30℃振荡培养约48h。培养结束后，分别从5瓶菌液中吸取1ml菌液，4℃条件下4000rpm离心，去掉液体培养基，收集菌体。上述菌体经Lyticase酶溶壁处理后，加入1/4体积的SDS-PAGE5X上样缓冲液，沸水浴5min中后，置于室温冷却，冷却后上样。

在100V电压下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚蓝)前沿达到凝胶底部。将所用凝胶用考马斯亮蓝(w:v+2.5％)染色后脱色，电泳结果如图6所示，其中M为蛋白标准分子量，泳道C-和C+为阴性对照和阳性对照，泳道1～5为不同的菌落小试表达结果。

实施例3.目的蛋白的纯化及检测

1.利用大容积培养瓶(2L)对阳性表达菌落进行培养，培养基为液体BMGY培养基，培养条件为30℃，220rpm震荡培养48h。

2.利用1L收菌瓶收集菌体，4℃条件下4000rpm对菌液离心，弃掉上清，多次收集，收集后的菌体冷冻储存。

3.取上述的菌体5g，加入50ml Lyticase工作液(1M Sortibal，0.1M EDTA pH7.4，2％(v/v)β-巯基乙醇)后加入200μl(10U/μl)的Lyticase酶，30℃水浴1h溶去细胞壁；溶壁后的样品在4℃条件下4000rpm离心收集菌体，向其中加入破菌缓冲液(20mM PB pH7.8，30mM NaCl)重悬，重换后的细胞在冰上超声破碎，超声破碎条件为:功率300W，超声3s间隔6s，共计超声10min；4℃条件下12000rpm离心60min，分别对上清液和沉淀进行可溶性分析。

4.将破菌上清用sourse15Q离子交换缓冲液A(20mM PB pH7.8)稀释6倍后，上样sourse15Q层析住进行层析，其具体步骤为:

(1)柱平衡:用5倍柱体积的缓冲液A(20mM PB pH7.8)和缓冲液B(20mM PB pH7.8，1M NaCl)交替清洗sourse15Q柱，流速为5ml/min，最终用缓冲液A平衡约2个柱体积；

(2)样品上柱:将稀释后的样品用缓冲液A上样sourse15Q柱，流速为3ml/min，收集流出液，留样SDS-PAGE；

(3)样品洗脱:在用缓冲液A洗至基线平稳后，用线性梯度洗脱的方式洗脱目标蛋白，其洗脱条件为:20个柱体积内洗脱至100％的缓冲液B，分别用2mlEP管进行分段收集洗脱液，用SDS-PAGE检测结果。如图8所示，其中泳道M为蛋白标准分子量，泳道穿透为sourse15Q上扬过程中的穿透，泳道1-8为不同的目的蛋白洗脱产物，其中泳道2中含有目的蛋白且量较大；

(4)柱再生:用0.5M NaOH溶液进行sourse15Q柱的再生。

5.将所述的sourse15Q洗脱的2号管进行凝胶过滤层析，所用的介质为superdex200GL，缓冲液为20mM PB pH7.8，300mM NaCl。分段收集目的蛋白峰，进行SDS-PAGE检测。如图9所示，其中泳道M为蛋白分子量标准，泳道C+为阳性对照，泳道1-5为不同管收集的洗脱样品，泳道1和泳道2为目的蛋白峰。也参见图11。

II.诺如病毒GI.1的VP1蛋白的表达及检验

实施例4.诺如病毒GI.1的VP1蛋白的表达

按照实施例1中类似的步骤，将Norovirus Hu/GI.1/CHA7A011/2010/USA，Genbank号:KF039736.1的VP1基因(SEQ ID NO:2，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:4)进行优化，得到用于在酵母细胞X33中表达的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)；转入重组表达质粒pGAPZαA，得到NoV GI.1VP1基因表达质粒pGAPZaA-NoV-GI.1-Yeast(以下简称质粒GI.1)。

将线性化后的质粒GI.1转入酵母X33菌株中，经博莱霉素抗性筛选，将具有抗性的克隆在BMGY培养基中进行小量表达培养，通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测是否有目的蛋白表达。具体步骤如下:

1.制备毕赤酵母X33感受态细胞

1.1用牙签蘸取些许毕赤酵母X33工作菌种菌液，划线于YPD培养平板，29℃静置培养1-2天，直至清晰可见单克隆菌落。

1.2从毕赤酵母X33划线平板中，挑取单个菌落接种于10ml YPD培养基中，29℃，250rpm培养1-2天。

1.3从10ml X33小量活化菌液中取1ml菌液，接种于100ml新鲜的YPD培养基中，29℃，230rpm，培养至菌液OD600达到1.3-1.5。

1.4制备毕赤酵母X33感受态细胞:

(1)4℃，1500g，离心5min收集菌体。

(2)加入250ml预冷注射水，重悬菌体。4℃，1500g，离心5min收集菌体。

(3)加入50ml预冷注射水，重悬菌体。4℃，1500g，离心5min收集菌体。

(4)加入10ml预冷的1M Sorbitol，重悬菌体。4℃，1500g，离心5min收集菌体。

(5)加入300μl预冷的1M Sorbitol，重悬混匀菌体，待用。

2.线性化质粒GI.1

2.1取约5μg质粒GI.1，用5μl单切点限制性内切酶BglII或BamHI，37℃酶切约2h。

2.2将反应后体系用ddH₂O₂补至200μl，加入1/10体积3M NaAc(pH 5.2)和2.5倍体积无水乙醇，颠倒混匀后，-20℃静置放置1h；4℃，12000rpm，离心10min，去掉上清；加入800μl 70％乙醇清洗，室温，12000rpm，离心3min，去掉上清；晾干。

2.3加入10μl ddH₂O₂溶解DNA，待用。

3.质粒GI.1电转化毕赤酵母X33及筛选

3.1取80μl毕赤酵母X33感受态细胞，加入线性化的质粒GI.1，用移液枪吸打混匀后，冰上静置5min。

3.2将上述样品平均分为两份(每份～45μl)加入0.1cm的电极杯，设置电压为1KV，进行电转化。

3.3电转结束后，立即加入500μl预冷的YPDS培养基，合并两份电转化样品转入无菌EP管中，30℃，静置培养2-3h，复苏菌体。

3.4将复苏的菌体重悬后，分为300μl和700μl两个梯度，涂于含博莱霉素(50μg/ml)抗生素YPDS平板中。30℃，避光静置培养2-3天。

3.5从转化平板中，挑取单克隆划线于新鲜的含博莱霉素的YPDS固体平板，29℃避光培养1-2天。

4.表达菌株小量培养

从上述划线平板中挑取单克隆，分别接于10ml BMGY液体培养基，29℃，250rpm培养2-3天。同时以含有空质粒pPGAPZaA的毕赤酵母X33菌株为阴性对照。

5.蛋白提取及考染检测目的蛋白表达

5.1分别取100μl菌液，4℃，12000rpm，离心5min，收集菌体。

5.2向收集的100μl菌体中加入100μl蛋白提取液(1ml Lyticase working Buffer加入20μl Lyticase)，吸打混匀。30℃水浴1h。

5.3 4℃，12000rpm，离心10min，弃去上清，沉淀用100μl ddH₂O₂重悬，按照实施例的纯化步骤进行纯化(结果参见图11)，即得到蛋白溶液。

5.4各取40μl蛋白溶液加入10μl 5x上样缓冲液，沸水煮样5min，立即置于冰上冰浴3min。取15μl样品，10％SDS-PAGE胶，恒压150进行电泳，结束后通过考马斯亮蓝的染色观察是否可见目的条带。

6.结果与讨论

6.1考马斯亮蓝染色SDS-PAGE胶

SDS-PAGE胶考染结果(参见图10)显示，与GII.4VP1蛋白相比，在同一位置处，大多数克隆都出现一条明显较深的蛋白条带；虽然在此位置处，阴性对照也同样出现一条蛋白条带，但颜色较浅。

6.2讨论

通过考马斯亮蓝染色的方法，可以看到一条和预期大小一致的清晰的蛋白条带，但由于阴性对照在此位置处也出现一条大小一样的条带，因此我们还需更进一步确认此条带是否是目的蛋白，后续我们可以通过蛋白纯化来确定，同时可以检测是否能够形成VLP颗粒。

III.效果鉴定

实施例5.目的蛋白和病毒样颗粒的鉴定

1.委托华大基因蛋白检测中心进行质谱检测，检测结果如图10所示，确认得到的氨基酸序列与目的蛋白的氨基酸序列一致，即得到了目的蛋白的氨基酸序列。

2.将目的蛋白产物进行DLS粒径检测，检测其是否为VLP颗粒及颗粒的均一度。其检测条件为:25℃平衡10s，每轮13次，共计2轮，取其平均颗粒水合直径平均值计算粒径以及粒径均一度指数PdI，如图11所示，目标蛋白在缓冲液中以直径非常均一颗粒形态存在，表明其形成了VLP颗粒，其水合直径为47.51nm(符合49nm的理论值)，PdI为0.025，颗粒质量非常好(参见图12)。

3.将所述的目的蛋白委托北京大学医学部电镜分析中心进行电镜负染检测，在电镜下目标颗粒结果如图12所示，经毕赤酵母表达的目的VP1蛋白形成了病毒样颗粒，其颗粒直径约38nm,与野生病毒的直径一致(参见图13)。

实施例6.VLP颗粒免疫效价评测

将实施例3-4中纯化得到的NoV病毒VLP颗粒进行小鼠免疫，实验材料主要包括:纯化制备的NoV GI.1VLP蛋白、NoV GII.4VLP蛋白、猪胃膜素(PGM)、氢氧化铝佐剂、BALB/c小鼠等。

6.1小鼠免疫方案

BALB/c小鼠，免疫周期6周，10只(5只/组)，空白对照组不免疫，仅取血作为阴性对照，免疫组每只小鼠的抗原(实施例3-4中纯化得到的NoV病毒VLP颗粒)接种量为10μg，分别在第0、14、28天进行三次免疫，免疫部位是腿部肌肉，具体分组如下所示:

各组小鼠分别在第14天、28天和42天分别进行眼眶采血，用于抗体效价分析。通过实验组免疫效果分析，初步确认NoV VLP蛋白颗粒是否具有免疫原性；抗体应答和铝佐添加对抗体效价影响，为后续实验方案提供参考。

6.2免疫检测方案

6.2.1结合抗体检测

用96孔酶标板，包被NoV GI.1VLP蛋白或GII.4VLP蛋白，检测免疫的小鼠血清与NoV VLP的血清结合效价。具体实验操作步骤如下:

(1)包被:用包被液PBS将包被抗原NoV VLP稀释为2ng/ul，100ul/孔加至96孔酶标板，4℃包被过夜。

(2)封闭:将包被好酶标板甩净，置于吸水纸上拍干。以200ul/孔加入封闭液(2％BSA)，室温放置1-2小时。

(3)样品稀释:用样品稀释液将待测样品稀释，确定初始稀释倍数，再三倍梯度稀释。

(4)点样:将封闭后的酶标板甩净，置于吸水纸上拍干，样品从稀释板内以100μl/孔加至酶标板内，设置仅加入样品稀释液的阴性对照，室温放置约1.5小时。

(5)加检测抗体:将酶标板甩净，置于吸水纸上拍干，用二抗稀释液稀释HRP标记山羊抗小鼠二抗(0.8mg/ml)至0.4μg/ml，即二抗1:2000倍稀释，以100μl/孔加至酶标板内，室温放置1小时。

(6)显色:每孔300μl PBST洗板5次，甩净，置于吸水纸上拍干。用吸水纸擦拭底部。以100μl/孔加入TMB显色液，室温避光显色15分钟。

(7)终止:以100ul/孔加入终止液，终止反应。

(8)读数:将酶标板板放入酶标仪中，OD450进行读数，保存至电脑并进行数据分析。各样品最大稀释比判定:以大于阴性血清吸光度值2.000倍的各样本最大稀释度作为该样品的效价。

6.2.2中和抗体检测

(1)包被:用包被液PBS，将PGM溶解成100μg/ml，100ul/孔加至96孔酶标板，4℃包被过夜。

(2)封闭:将包被好酶标板甩净，用PBST(含吐温0.05％的PBS缓冲液)振荡洗板3-5次，200ul/孔，除去多余未结合的PGM，置于吸水纸上拍干；每孔加入200ul封闭液(2％BSA)，将酶标板置于室温封闭1-2小时。

(3)点样:封闭结束后，用PBST洗板3次，每次5分钟，结束后拍干。以100μl/孔加入NoV VLP与血清的混合液，设置仅加入稀释液的阴性对照，室温放置1小时。

NoV VLP与血清反应操作过程如下:

血清以1:100作为初始稀释倍数，依次对倍进行稀释，然后加入等体积的NoV VLP蛋白，浓度为1μg/ml，混匀后，将酶标板放置于4℃冰箱孵育过夜。

(4)加检测抗体:孵育结束后，PBST洗板3-5次，每次3-5分钟，结束后拍干，每孔加入100ul HRP标记的NoV VLP鼠多抗(1ug/ml)；将孔板置于室温，继续孵育1小时。

(5)显色:每孔300μl PBST洗板5次，甩净，置于吸水纸上拍干。用吸水纸擦拭底部。以100μl/孔加入TMB显色液，室温避光显色15分钟。

(6)终止:以100ul/孔加入终止液，终止反应。

(7)读数:将酶标板板放入酶标仪中，OD450进行读数、保存至电脑并进行数据分析。

体内结合抗体水平表明，NoV病毒VLP颗粒具有良好的免疫原性，同时，同等抗原剂量下，氢氧化铝佐剂的添加能够显著增强抗原在体内诱导的抗体滴度，表明氢氧化铝佐剂有助于增强NoV病毒VLP颗粒的免疫原性，中和抗体检测表明，用氢氧化铝佐剂和重组诺如病毒VLP蛋白配制成的疫苗具有中和活性，因此，可进一步开发成为疫苗产品(参见图14)。

序列表

<110> 北京康乐卫士生物技术股份有限公司

<120> 重组诺如病毒VLP颗粒和制备方法及其用途

<130> PF 170636CNI

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1623

<212> DNA

<213> 诺如病毒

<400> 1

atgaagatgg cgtcgagtga cgccaaccca tctgatgggt ccgcagccaa cctcgtccca 60

gaggtcaaca atgaggttat ggctctggag cccgttgttg gtgccgccat tgcggcacct 120

gtagcgggcc aacaaaatgt aattgacccc tggattagaa ataattttgt acaagcccct 180

ggtggagagt ttacagtatc ccctagaaac gctccaggtg aaatactatg gagcgcgccc 240

ttgggccctg atttaaatcc ctacctatcc catttggcca gaatgtacaa tggttatgca 300

ggtggttttg aagtgcaggt aattctcgcg gggaacgcgt tcaccgccgg aaaggtcata 360

tttgcagcag tcccaccaaa ttttccaact gaaggcttga gccccagcca ggtcactatg 420

ttcccccata tagtagtaga tgttaggcaa ctagaacctg tgttgattcc cttacccgat 480

gttaggaata atttctacca ttacaatcaa tcaaatgacc ccaccattaa gttgatagca 540

atgttgtata caccacttag ggctaataat gctggggatg atgtcttcac agtttcttgc 600

cgagttctca cgagaccatc ccccgatttt gatttcatat ttctagtgcc acccacagtt 660

gagtcaagaa ctaaaccatt ctctgtccca gttttaactg ttgaggagat gaccaattca 720

agattcccca ctcctttgga aaagttgttc acgggtccca gcagtgcctt tgttgttcaa 780

ccacaaaacg gtaggtgcac gactgatggc gtgctcctag gcaccaccca actgtctcct 840

gtcaacatct gcaccttcag aggagatgtc acccatatca caggtagtcg taactacaca 900

atgaatttgg cttctcaaaa ttggagcaat tatgacccaa cagaagaaat cccagcccct 960

ctaggaactc cagatttcgt ggggaagatt caaggcgtgc tcacccaaac cacaaggaca 1020

gatggctcaa cacgcggcca caaagccaca gtgtacactg ggagcgccga ctttgctcca 1080

aaactgggca gagttcaatt tgaaactgac acagaccatg attttgaaac taaccaaaac 1140

acaaaattca ccccagttgg tgtcatccaa gatggtagca ccacccaccg aaatgaaccc 1200

caacagtggg tgctcccaag ttactcaggc agaaatactc ctaatgtgca tctggccccc 1260

gctgtagccc ccacttttcc gggtgagcaa cttctcttct tcagatccac catgcccgga 1320

tgcagcgggt accccaacat ggatttggac tgtctgctcc cccaggaatg ggtgcagtac 1380

ttctaccaag aggcagcccc agcacaatct gatgtggctc tgctaagatt tgtgaatcca 1440

gacacaggta gggttttgtt tgagtgtaag cttcataaat caggctatgt tacagtggct 1500

cacactggcc aacatgattt ggttatcccc cccaatggtt attttaggtt tgattcctgg 1560

gtcaaccagt tttacacgct tgcccccatg ggaaatggaa cggggcgtag acgtgcacta 1620

taa 1623

<210> 2

<211> 1593

<212> DNA

<213> 诺如病毒

<400> 2

atgatgatgg cgtctaagga cgctacatca agcgtggatg gcgctagtgg cgctggtcag 60

ttggtaccgg aggttaatgc ttctgaccct cttgcaatgg atcctgtagc aggttcttcg 120

acagcagtcg cgactgctgg acaagttaat cctattgatc cctggataat taataatttt 180

gtgcaagccc cccaaggtga atttactatt tccccaaata atacccccgg tgatgttttg 240

tttgatttga gtttgggtcc ccatcttaat cctttcttgc tccatctatc acaaatgtat 300

aatggttggg ttggtaacat gagagtcagg attatgctag ctggtaatgc ctttactgcg 360

gggaagataa tagtttcctg cataccccct ggttttggtt cacataatct tactatagca 420

caagcaactc tctttccaca tgtgattgct gatgttagga ctctagaccc cattgaggtg 480

cctttggaag atgttaggaa tgttctcttt cataataatg atagaaatca acaaaccatg 540

cgccttgtgt gcatgctgta cacccccctc cgcactggtg gtggtactgg tgattctttt 600

gtagttgcag ggcgagttat gacttgcccc agtcctgatt ttaatttctt gtttttagtc 660

cctcctacgg tggagcagaa aaccaggccc ttcacactcc caaatctgcc attgagttct 720

ctgtctaact cacgtgcccc tctcccaatc agtagtatgg gcatttcccc agacaatgtc 780

cagagtgtgc agttccaaaa tggtcggtgt actctggatg gccgcctggt tggcaccacc 840

ccagtttcat tgtcacatgt tgccaagata agagggacct ccaatggcac tgtaatcaac 900

cttactgaat tggatggcac accctttcac ccttttgagg gccctgcccc cattgggttt 960

ccagacctcg gtggttgtga ttggcatatc aatatgacac agtttggcca ttctagccag 1020

acccagtatg atgtagacac cacccctgac acttttgtcc cccatcttgg ttcaattcag 1080

gcaaatggca ttggcagtgg taattatgtt ggtgttctta gctggatttc ccccccatca 1140

cacccgtctg gctcccaagt tgacctttgg aagatcccca attatgggtc aagtattacg 1200

gaggcaacac atctagcccc ttctgtatac ccccctggtt tcggagaggt attggtcttt 1260

ttcatgtcaa aaatgccagg tcctggtgct tataatttgc cctgtctatt accacaagag 1320

tacatttcac atcttgctag tgaacaagcc cctactgtag gtgaggctgc cctgctccac 1380

tatgttgacc ctgataccgg tcggaatctt ggggaattca aagcataccc tgatggtttc 1440

ctcacttgtg tccccaatgg ggctagctcg ggtccacaac agctgccgat caatggggtc 1500

tttgtctttg tttcatgggt gtccagattt tatcaattaa agcctgtggg aactgccagc 1560

tcggcaagag gtaggcttgg tctgcgccga taa 1593

<210> 3

<211> 540

<212> PRT

<213> 诺如病毒

<400> 3

Met Lys Met Ala Ser Ser Asp Ala Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala Ala

1 5 10 15

Asn Leu Val Pro Glu Val Asn Asn Glu Val Met Ala Leu Glu Pro Val

20 25 30

Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Val Ala Gly Gln Gln Asn Val Ile

35 40 45

Asp Pro Trp Ile Arg Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly Glu Phe

50 55 60

Thr Val Ser Pro Arg Asn Ala Pro Gly Glu Ile Leu Trp Ser Ala Pro

65 70 75 80

Leu Gly Pro Asp Leu Asn Pro Tyr Leu Ser His Leu Ala Arg Met Tyr

85 90 95

Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val Gln Val Ile Leu Ala Gly Asn

100 105 110

Ala Phe Thr Ala Gly Lys Val Ile Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe

115 120 125

Pro Thr Glu Gly Leu Ser Pro Ser Gln Val Thr Met Phe Pro His Ile

130 135 140

Val Val Asp Val Arg Gln Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp

145 150 155 160

Val Arg Asn Asn Phe Tyr His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Leu Ile Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly

180 185 190

Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro

195 200 205

Asp Phe Asp Phe Ile Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Arg Thr

210 215 220

Lys Pro Phe Ser Val Pro Val Leu Thr Val Glu Glu Met Thr Asn Ser

225 230 235 240

Arg Phe Pro Thr Pro Leu Glu Lys Leu Phe Thr Gly Pro Ser Ser Ala

245 250 255

Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr Asp Gly Val Leu

260 265 270

Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Pro Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly

275 280 285

Asp Val Thr His Ile Thr Gly Ser Arg Asn Tyr Thr Met Asn Leu Ala

290 295 300

Ser Gln Asn Trp Ser Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu Ile Pro Ala Pro

305 310 315 320

Leu Gly Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly Val Leu Thr Gln

325 330 335

Thr Thr Arg Thr Asp Gly Ser Thr Arg Gly His Lys Ala Thr Val Tyr

340 345 350

Thr Gly Ser Ala Asp Phe Ala Pro Lys Leu Gly Arg Val Gln Phe Glu

355 360 365

Thr Asp Thr Asp His Asp Phe Glu Thr Asn Gln Asn Thr Lys Phe Thr

370 375 380

Pro Val Gly Val Ile Gln Asp Gly Ser Thr Thr His Arg Asn Glu Pro

385 390 395 400

Gln Gln Trp Val Leu Pro Ser Tyr Ser Gly Arg Asn Thr Pro Asn Val

405 410 415

His Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu

420 425 430

Phe Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asp

435 440 445

Leu Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln Tyr Phe Tyr Gln Glu

450 455 460

Ala Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val Ala Leu Leu Arg Phe Val Asn Pro

465 470 475 480

Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu Cys Lys Leu His Lys Ser Gly Tyr

485 490 495

Val Thr Val Ala His Thr Gly Gln His Asp Leu Val Ile Pro Pro Asn

500 505 510

Gly Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr Thr Leu Ala

515 520 525

Pro Met Gly Asn Gly Thr Gly Arg Arg Arg Ala Leu

530 535 540

<210> 4

<211> 530

<212> PRT

<213> 诺如病毒

<400> 4

Met Met Met Ala Ser Lys Asp Ala Thr Ser Ser Val Asp Gly Ala Ser

1 5 10 15

Gly Ala Gly Gln Leu Val Pro Glu Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Ala

20 25 30

Met Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Thr Ala Val Ala Thr Ala Gly Gln

35 40 45

Val Asn Pro Ile Asp Pro Trp Ile Ile Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro

50 55 60

Gln Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp Val Leu

65 70 75 80

Phe Asp Leu Ser Leu Gly Pro His Leu Asn Pro Phe Leu Leu His Leu

85 90 95

Ser Gln Met Tyr Asn Gly Trp Val Gly Asn Met Arg Val Arg Ile Met

100 105 110

Leu Ala Gly Asn Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Val Ser Cys Ile

115 120 125

Pro Pro Gly Phe Gly Ser His Asn Leu Thr Ile Ala Gln Ala Thr Leu

130 135 140

Phe Pro His Val Ile Ala Asp Val Arg Thr Leu Asp Pro Ile Glu Val

145 150 155 160

Pro Leu Glu Asp Val Arg Asn Val Leu Phe His Asn Asn Asp Arg Asn

165 170 175

Gln Gln Thr Met Arg Leu Val Cys Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Thr

180 185 190

Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Phe Val Val Ala Gly Arg Val Met Thr

195 200 205

Cys Pro Ser Pro Asp Phe Asn Phe Leu Phe Leu Val Pro Pro Thr Val

210 215 220

Glu Gln Lys Thr Arg Pro Phe Thr Leu Pro Asn Leu Pro Leu Ser Ser

225 230 235 240

Leu Ser Asn Ser Arg Ala Pro Leu Pro Ile Ser Ser Met Gly Ile Ser

245 250 255

Pro Asp Asn Val Gln Ser Val Gln Phe Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu

260 265 270

Asp Gly Arg Leu Val Gly Thr Thr Pro Val Ser Leu Ser His Val Ala

275 280 285

Lys Ile Arg Gly Thr Ser Asn Gly Thr Val Ile Asn Leu Thr Glu Leu

290 295 300

Asp Gly Thr Pro Phe His Pro Phe Glu Gly Pro Ala Pro Ile Gly Phe

305 310 315 320

Pro Asp Leu Gly Gly Cys Asp Trp His Ile Asn Met Thr Gln Phe Gly

325 330 335

His Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Asp Val Asp Thr Thr Pro Asp Thr Phe

340 345 350

Val Pro His Leu Gly Ser Ile Gln Ala Asn Gly Ile Gly Ser Gly Asn

355 360 365

Tyr Val Gly Val Leu Ser Trp Ile Ser Pro Pro Ser His Pro Ser Gly

370 375 380

Ser Gln Val Asp Leu Trp Lys Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Ser Ile Thr

385 390 395 400

Glu Ala Thr His Leu Ala Pro Ser Val Tyr Pro Pro Gly Phe Gly Glu

405 410 415

Val Leu Val Phe Phe Met Ser Lys Met Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Asn

420 425 430

Leu Pro Cys Leu Leu Pro Gln Glu Tyr Ile Ser His Leu Ala Ser Glu

435 440 445

Gln Ala Pro Thr Val Gly Glu Ala Ala Leu Leu His Tyr Val Asp Pro

450 455 460

Asp Thr Gly Arg Asn Leu Gly Glu Phe Lys Ala Tyr Pro Asp Gly Phe

465 470 475 480

Leu Thr Cys Val Pro Asn Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Gln Leu Pro

485 490 495

Ile Asn Gly Val Phe Val Phe Val Ser Trp Val Ser Arg Phe Tyr Gln

500 505 510

Leu Lys Pro Val Gly Thr Ala Ser Ser Ala Arg Gly Arg Leu Gly Leu

515 520 525

Arg Arg

530

<210> 5

<211> 1623

<212> DNA

<213> 诺如病毒

<400> 5

atgaagatgg cttcttctga cgctaaccca tctgacggtt ctgctgctaa cttggttcca 60

gaagttaaca acgaagttat ggctttggaa ccagttgttg gtgctgctat cgctgctcca 120

gttgctggtc aacaaaacgt tatcgaccca tggatcagaa acaacttcgt tcaagctcca 180

ggtggtgaat ttactgtttc tccaagaaac gctccaggtg aaatcttgtg gtctgctcca 240

ttgggtccag acttgaaccc atacttgtct cacttggcta gaatgtacaa cggttacgcg 300

ggtggcttcg aagttcaagt tatcttggct ggtaacgctt tcactgctgg taaggttatc 360

ttcgctgctg ttccaccaaa ctttccaact gaaggcttgt ctccatctca ggttactatg 420

ttcccacaca tcgttgttga cgttagacaa ttggaaccag ttttgatccc attgccagac 480

gttagaaaca acttctacca ctacaaccaa tctaacgacc caactatcaa gttgatcgct 540

atgttgtaca ctccattgag agctaacaac gctggtgacg acgttttcac tgtttcttgt 600

agagttttga ctagaccatc tccagacttc gacttcatct tcttggttcc accaactgtt 660

gaatctagaa ctaagccatt ctctgttcca gttttgactg ttgaagaaat gactaactct 720

agattcccaa ctccattgga aaagttgttc actggtccat cttctgcttt cgttgttcaa 780

ccacaaaacg gtagatgtac tactgacggt gttttgttgg gtactactca attgtctcca 840

gttaacatct gtactttcag aggtgacgtt actcacatca ctggttctag aaactacact 900

atgaacttgg cttctcaaaa ctggtctaac tacgacccaa ctgaagaaat cccagctcca 960

ttgggtactc cagacttcgt tggtaagatc caaggtgttt tgactcaaac tactagaact 1020

gacggttcta ctagaggtca caaggctact gtttacactg gttctgctga cttcgctcca 1080

aagttgggta gagttcaatt cgaaactgac actgaccacg acttcgaaac taaccaaaac 1140

actaagttca ctccagttgg tgttatccaa gacggttcta ctactcacag aaacgaacca 1200

caacaatggg ttttgccatc ttactctggt agaaacactc caaacgttca cttggctcca 1260

gctgttgcgc ccacattccc aggtgaacag ttgttgttct tcagatctac tatgccaggt 1320

tgttctggtt acccaaacat ggacttggac tgtttgttgc cacaagaatg ggttcaatac 1380

ttctaccaag aagctgctcc agctcaatct gacgttgctt tgttgagatt cgttaaccca 1440

gacactggta gagttttgtt cgaatgtaag ttgcacaagt ctggttacgt tactgttgct 1500

cacactggtc aacacgactt ggttatccca ccaaacggtt acttcagatt cgactcttgg 1560

gttaaccaat tctacacttt ggctccaatg ggtaacggta ctggtagaag aagagctttg 1620

taa 1623

<210> 6

<211> 1593

<212> DNA

<213> 诺如病毒

<400> 6

atgatgatgg cttctaagga cgctacttct tctgttgacg gtgcttctgg tgctggtcaa 60

ttggttccag aagttaacgc ttctgaccca ttggctatgg acccagttgc tggttcttct 120

actgctgttg ctactgctgg tcaagttaac ccaatcgacc catggatcat caacaacttc 180

gttcaagctc cacaaggtga atttactatc tctccaaaca acactccagg tgacgttttg 240

ttcgacttgt ctttgggtcc acacttgaac ccattcttgt tgcacttgtc tcaaatgtac 300

aacggttggg ttggtaacat gagagttaga atcatgttgg ctggtaacgc tttcactgct 360

ggtaagatca tcgtttcttg tatcccacca ggtttcggtt ctcacaactt gactatcgct 420

caagctactt tgttcccaca cgttatcgct gacgttagaa ctttggaccc aatcgaagtt 480

ccattggaag acgttagaaa cgttttgttc cacaacaacg acagaaacca acaaactatg 540

agattggttt gtatgttgta cactccattg agaactggtg gtggtactgg tgactctttc 600

gttgttgctg gtagagttat gacttgtcca tctccagact tcaacttctt gttcttggtt 660

ccaccaactg ttgaacaaaa gactagacca ttcactttgc caaacttgcc attgtcttct 720

ttgtctaact ctagagctcc attgccaatc tcttctatgg gtatctctcc agacaacgtt 780

caatctgttc aattccaaaa cggtagatgt actttggacg gtagattggt tggtactact 840

ccagtttctt tgtctcacgt tgctaagatc agaggtactt ctaacggtac tgttatcaac 900

ttgactgaat tggacggtac tccattccac ccattcgagg gtccagctcc aatcggtttc 960

ccagacttgg gtggttgtga ctggcacatc aacatgactc aattcggtca ctcttctcaa 1020

actcaatacg acgttgacac tactccagac actttcgttc cacacttggg ttctatccaa 1080

gctaacggta tcggttctgg taactacgtt ggtgttttgt cttggatctc tccaccatct 1140

cacccatctg gttctcaagt tgacttgtgg aagatcccaa actacggttc ttctatcact 1200

gaagctactc acttggctcc atctgtttac ccaccaggtt tcggtgaagt tttggttttc 1260

ttcatgtcta agatgccagg tccaggtgct tacaacttgc catgtttgtt gccacaagaa 1320

tacatctctc acttggcttc tgaacaagct ccaactgttg gtgaagctgc tttgttgcac 1380

tacgttgacc cagacactgg tagaaacttg ggtgaattta aggcttaccc agacggtttc 1440

ttgacttgtg ttccaaacgg tgcttcttct ggtccacaac aattgccaat caacggtgtt 1500

ttcgttttcg tttcttgggt ttctagattc taccaattga agccagttgg tactgcttct 1560

tctgctagag gtagattggg tttgagaaga taa 1593

Claims (9)

1.一种制备诺如病毒VP1病毒样颗粒的方法，其特征在于，在毕赤酵母表达系统中表达分别如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列编码的诺如病毒GII.4亚型毒株KJ678151.1的VP1蛋白或如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列编码的诺如病毒GI .1亚型毒株KF039736 .1的VP1蛋白，并进行破菌后对上清进行纯化获得；

所述毕赤酵母表达系统是将所述的核苷酸序列构建于pGAPZαA载体的组成型表达启动子控制之下，并导入毕赤酵母毕赤酵母X33之中，在合适的培养条件下培养以产生蛋白，其中培养过程中无需添加甲醇。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述编码核苷酸序列的5’端还增加有的GAAACGATGNN的Kozak序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母是毕赤酵母X33。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其培养时采用的BMGY培养基。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为24-72小时。

6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述纯化是两步分离纯化步骤，即先进行的离子交换层析步骤和之后进行的分子筛层析步骤的组合。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将破菌后的上清用sourse15Q离子交换柱进行层析；所述的分子筛层析是凝胶过滤层析，所用的介质为 superdex200GL。

8.一种增强人诺如病毒免疫反应的组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步聚：

1）按如权利要求1至7任一项所述的方法制备得到的诺如病毒VP1病毒样颗粒；

2）混合氢氧化铝佐剂，且所述氢氧化铝佐剂的有效量为10-1250μg。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述氢氧化铝佐剂的有效量为10-1250μg。

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