CN104611358A - 一种在大肠杆菌中制备诺如病毒病毒样颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在大肠杆菌中制备诺如病毒病毒样颗粒的方法，包括如下步骤：(1)酶切扩增诺如病毒主衣壳蛋白编码序列片段和pCold载体，连接酶连接并转化感受态大肠埃希菌DH5α；(2)扩增表达转化成功的大肠杆菌宿主菌株；(3)纯化扩增表达的宿主菌株中的诺如病毒主衣壳蛋白颗粒。该方法制备的病毒样颗粒稳定性高，其大小颗粒也比较均一。

Description

一种在大肠杆菌中制备诺如病毒病毒样颗粒的方法

技术领域

本发明属于生物和医药技术领域，具体而言，涉及一种在大肠杆菌中制备诺如病毒病毒样颗粒的方法。

背景技术

诺如病毒(Noroviruses，NoV)是全球范围内引起成人和儿童非细菌性急性胃肠炎暴发流行的重要病原体，同时也是婴幼儿散发性胃肠炎的常见病原(仅次于轮状病毒)，近年来其发病率呈逐渐升高的趋势。目前已知NoV有5个基因组，其中仅Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组感染人。自20世纪90年代中期首次确认GⅡ-4型NoV毒株导致绝大部分NoV胃肠炎暴发和世界性大流行后，NoV GⅡ-4型毒株一直为全球优势流行株。发明人于2013年成功在腹泻病人粪便样本中分离到诺如病毒2012悉尼大流行株类似株，命名为Jingzhou20140403，我们对该分离株进行了全基因组测序，并递交到了NCBI的核酸序列数据库中(Genbank登录号：KF306214)。

诺如病毒为单正链RNA病毒，基因组全长7.5-7.7kb,有多聚A尾巴。基因组有三个开放阅读框，开放阅读框1,2和3，分别编码多聚蛋白、主衣壳蛋白(VP1)和次衣壳蛋白。主衣壳蛋白结构上可以分成两个结构域：衣壳区(Shell domain)和突出区(Protruding domain)；其中突出区为主要的受体结合位点并含有主要的免疫表位。该病毒目前还不能进行体外培养，但是已经证明主衣壳蛋白在昆虫细胞表达后可以自组装成病毒样颗粒(Virus like particle)。用杆状病毒表达诺如病毒的VP1,所形成的VPLs在形态、结构和抗原特性方面均与野生型病毒类似。

目前大规模制备诺如病毒的病毒样颗粒的方法有重组杆状病毒表达系统，酵母表达系统和植物表达系统等。其中使用最广泛的是重组杆状病毒表达系统。其特点为表达量高，易于纯化，而且已有相关的疫苗上市，这给其它疫苗研发和报批提供了模板。酵母表达系统有和重组杆状病毒表达系统相似的优点。但是上述表达系统表达的病毒样颗粒都存在大小不同的两种颗粒，且两种颗粒比例不易控制，这为后续的疫苗质量控制带来了一定的困难。目前诺如病毒相关的临床研究都是以重组杆状病毒表达系统制备的病毒样颗粒作为免疫原。重组杆状病毒表达系统制备诺如病毒样颗粒一般为首先制备获取包含编码诺如病毒主衣壳蛋白的重组杆状病毒，然后用制备的杆状病毒去感染昆虫细胞，随后从细胞裂解液或者细胞上清中纯化病毒样颗粒。纯化方法一般为低速离心去细胞碎片，然后超高速离心沉淀病毒样颗粒，用水或者PBS复溶沉淀后用氯化铯等密度梯度离心进一步纯化。最后对抽取含有目的条带的组分进行超高速离心或者浓缩管离心去除氯化铯。另外一种方法是通过超滤，分子筛加离心交换进行纯化。第一种方法适合小规模病毒样颗粒制备，后一种方法一般为工业级抗原制备。

2002年俄亥俄州辛辛那提儿童医院医疗中心开发了一个只包含病毒颗粒突出区的亚病毒样颗粒(P颗粒)。LigoCyte购买了这个“P颗粒”疫苗的专利，但还没有把它推向临床试验。但动物实验表明该P颗粒免疫原性不及病毒样颗粒。此外，该方法制备P颗粒需要进行体外酶切把标签蛋白和目的蛋白进行分离，不仅费时，费力，增加了费用，同时不可避免引入外源蛋白污染(不能有效酶切的目的蛋白)。

综上，现有表达系统都具有成本高，制备费时费力等缺点，此外，通过现有方法制备的病毒样颗粒大小不均一，如利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达制备诺如病毒病毒样颗粒，其颗粒大小比例受培养条件的影响，单层培养细胞时获得的大颗粒比例可以达到80％以上，但悬浮培养时小颗粒可以达到80％以上，因此，需要一种更好的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法。

发明内容

我们通过实验摸索，找到了一种在大肠杆菌中制备诺如病毒病毒样颗粒的方法。与现行的制备诺如病毒病毒样颗粒的方法相比，本方法具有快速，简单，成本低等优点。此外和其它表达系统相比，不会引入过多的外源因子。例如杆状病毒表达系统会不可避免引入昆虫细胞宿主蛋白和DNA以及杆状病毒结构和非结构蛋白和DNA，所以后续的疫苗还需有灭活以确保杆状病毒被有效灭活。而本发明中使用的是大肠杆菌。大肠杆菌是人体的正常共生菌，不会对人体带来潜在的风险。此外，通过添加标签，我们使最终表达的病毒样颗粒大小均一，稳定性得到了提高。

为了解决颗粒大小不均一和稳定性不好的问题，我们在VP1蛋白N端添加了一个五肽，含有该五肽的VP1-M蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)在细菌中表达后仍然组装形成了病毒样颗粒，这种颗粒稳定性得到了提高，其大小颗粒也比较均一。

本发明的目的是为了提供一种简单、快速、低成本下制备稳定均一的诺如病毒病毒样颗粒的方法。

本发明的发明点

第一：我们的发明首先提供了一种简单、快速、低成本制备诺如病毒病毒样颗粒的方法。把诺如病毒VP1序列连接到表达载体pCold的限制性酶切位点NdeI和BamHI中，在大肠杆菌中表达后可以形成病毒样颗粒。

第二：我们提供了一种制备诺如病毒病毒样颗粒大小均一的制备方法。通过在诺如病毒VP1蛋白N端添加5肽，表达后形成的病毒样颗粒大小均一，且稳定性得到了提高。

本发明首先涉及一种诺如病毒病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)酶切扩增诺如病毒主衣壳蛋白编码序列片段和pCold载体，连接酶连接并转化感受态大肠埃希菌DH5α；

(2)扩增表达转化成功的大肠杆菌宿主菌株；

(3)纯化扩增表达的宿主菌株中的诺如病毒主衣壳蛋白颗粒。

步骤(1)中所述的引物序列为：

NoVFL-F    GGAATTCCATATGNNNNNNNNNNNNATGAAGATGGCGTCGAGTGACGCCAAC(SEQ ID NO.1) 

NoV-R      CGGGATCCTTATAGTGCACGTCTACGCCCCGT(SEQ ID NO.2)。

步骤(1)所述的连接及转化方法为：用NdeI和BamHI同时酶切扩增片段目的序列和pCold载体，回

目的片段和载体片段，以T4DNA连接酶室温连接10-30分钟，连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α。 随机挑选单克隆，接种于LB培养基中，菌落PCR鉴定正确的菌株加入终浓度为30％灭菌甘油保存于-80℃。

步骤(2)所述的扩增表达方法为：取适量冻存菌液接种于LB培养基中，37℃振荡培养，待菌液A₆₀₀＝0.4-0.8时，转移至15℃放置30分钟，然后加入IPTG至终浓度为0.1-0.5mM/L,15℃诱导24-72小时。

步骤(3)所述的纯化方法为下述方法一或方法二，

方法一：

将细菌裂解液上清于4℃条件下，12000xg离心30分钟，收集上清；

根据上清体积加入适量饱和硫酸铵使成33％饱和度硫酸铵溶液，4℃搅拌下沉淀过夜；

4℃条件下，12000xg离心20分钟，弃上清；

沉淀用无菌PBS溶液重悬过夜，重悬液低速离心去除不溶物质，上清经凝胶层析收集目的蛋白，加入饱和硫酸铵溶液使成33％饱和度硫酸铵溶液，4℃搅拌下沉淀过夜；

4℃条件下，12000xg离心20分钟，弃上清；

沉淀用无菌PBS重悬过夜，重悬液低速离心去除不溶物质；

方法二：

细菌裂解液上清直接采用25％(W/W)蔗糖垫底超速离心，28000rpm,4℃离心3小时沉淀蛋白；

沉淀蛋白采用无菌PBS复溶，复溶后蛋白采取低速离心去除不溶蛋白，离心参数为10000xg，30分钟，上清和等体积1.6g/ml氯化铯水溶液混合，41000rpm,10℃离心18-24小时，抽取目的蛋白条带(目的条带位于离心管上部1/3处)。

本发明还涉及由所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法制备获得的诺如病毒病毒样颗粒。

本发明还涉及所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法在制备诺如病毒抗原或疫苗中的应用。

本发明还涉及所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法在制备重组诺如病毒或诺如病毒病毒样颗粒中的应用。

本发明还涉及编码所述方法制备获得的诺如病毒病毒样颗粒的编码基因序列，优选的，所述的诺如病毒颗粒蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示

附图说明

图1、目的片段的PCR扩增产物鉴定：M泳道：DNA marker DL15000；泳道1：扩增的目的片段

图2、表达产物的ELISA鉴定：A:Tris缓冲液上清；B:Tris缓冲液+2mM MgCl₂；C：Tris缓冲液+1％Triton X-100；D:Tris缓冲液+2M尿素；E:Tris缓冲液+8M尿素；F:阴性对照；G:阳性对照。

图3、表达产物的Western blot鉴定：M：蛋白质Marker SM1811；1：阳性对照；2：Tris缓冲液上清；3：Tris缓冲液+2mM MgCl₂；4：Tris缓冲液+1％Triton X-100；5：Tris缓冲液+2M尿素；6：Tris缓冲液+8M尿素；7：阴性对照。

图4、纯化后的病毒样颗粒电镜照片。

具体实施方式

材料和方法 

1.1基因，质粒和细胞

诺如病毒主衣壳蛋白编码序列为本室保存,序列和GENEBANK KF306214中序列一致，质粒pCold载体和DH5α菌株购自日本Takara公司。

1.2主要试剂

Ex-Taq DNA聚合酶，DH5α感受态细胞，T4DNA连接酶，DNA marker 15000,琼脂糖购自日本Takara公司；兔抗诺如病毒(GII.4)多克隆抗体，HRP标记兔抗诺如病毒(GII.4)多克隆抗体为本室保存；诺如病毒抗原检测试剂盒为本实验室根据诺如病毒序列自行制备。胶回收试剂盒购自德国Qiagen公司。BamHI和EcoRI FastDigest限制性内切酶购自Thermo Scientific公司。

1.3引物设计和合成

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用引物见表1。

表1 寡核苷酸引物序列

表1.引物序列

注：F为正向引物，R为反向引物。正向引物划线部分为NdeI酶切位点，反向引物划线部分为BamHI酶切位点。N:任意碱基。 

实施例1、基因片段扩增，酶切和连接及目的基因的诱导表达

用NdeI和BamHI同时酶切扩增片段目的产物和pCold载体，回收目的片段和载体片段，以T4DNA连接酶室温连接10-30分钟，连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α。随机挑选单克隆，接种于LB培养基中，菌落PCR鉴定，抽取部分菌液送上海生工进行DNA测序。经鉴定正确的菌液加入适量灭菌甘油使甘油终浓度为30％保存于-80℃。从图1可以看出，成功获得了目的片段的产物。对目的产物进行胶回收，酶切连接转化感受态大肠杆菌埃希菌。挑取单菌落进行PCR鉴定，对阳性菌落进行扩大培养。同时测序结果表明表达质粒构建正确。

取适量冻存菌液接种于LB培养基中，37℃振荡培养，待菌液A₆₀₀＝0.4-0.8时，转移至15℃放置30分钟，然后加入IPTG至终浓度为0.1-0.5mM/L,15℃诱导24-72小时。10000xg离心10分钟收集菌体，用10mM pH 7.2-7.4的PBS清洗，然后重悬菌体于50mM Tris缓冲液(含有5m M EDTA,10mg/ml PMSF，1mM DTT),超声破碎，10000xg离心取上清，沉淀分别用含有2mM MgCl₂,1％Triton X-100,2M尿素和8M尿素的50mM Tris缓冲液重悬(加入MgCl₂，Triton X-100,2M尿素和8M尿素的作用是溶解不溶的蛋白)，离心后保留上清。使用诺如病毒抗原检测试剂盒和Western blot方法检测各步骤收获上清中的目的蛋白，空载体表达菌作为阴性对照，阳性对照为利用重组杆状病毒表达系统制备的诺如病毒病毒样颗粒，两种制备方法制备的病毒样颗粒编码序列一致。ELISA鉴定结果见图2，Western blot检测结果见图3，可见，菌体中成功表达了目的病毒的蛋白颗粒。

实施例2、目的蛋白颗粒的纯化及形态鉴定

方法一：将细菌裂解液上清于4℃条件下，12000xg离心30分钟，收集上清。根据上清体积加入适 量饱和硫酸铵使成33％饱和度硫酸铵溶液，4℃搅拌下沉淀过夜；4℃条件下，12000xg离心20分钟，弃上清，沉淀用0.22μm滤过的PBS溶液重悬过夜，重悬液低速离心去除不溶物质，上清经Sepharose 6-FF凝胶层析，收集目的蛋白，加入饱和硫酸铵溶液使成33％饱和度硫酸铵溶液，4℃搅拌下沉淀过夜；4℃条件下，12000xg离心20分钟，弃上清，沉淀用0.22μm滤过的PBS重悬过夜，重悬液低速离心去除不溶物质，BCA蛋白定量法或者使用Nanodrop ND-1000测定上清中蛋白浓度，SDS-PAGE分析蛋白纯度。

方法二：细菌裂解液上清直接采用25％蔗糖(W/W)垫底超速离心，28000rpm,4℃离心3小时沉淀蛋白(Beckman,SW28转子),沉淀蛋白采用滤过PBS复溶，复溶后蛋白采取低速离心去除不溶蛋白(10000xg，30分钟)，上清和等体积1.6g/ml氯化铯水溶液混合，41000rpm,10℃离心18-24小时(Beckman,SW41转子)。目的条带在离心管上方1/3处，抽取目的条带后按照上述方法进行蛋白浓度测定和纯度分析。

电镜观察纯化蛋白形态：

使用滤过的PBS将纯化蛋白浓度调至100-200μg/ml，取20-50μl于超净工作台内滴至干净的PE手套上，将铜网正面向下放置在液滴上，室温孵育5分钟，孵育同时另取20-50μl pH值为7.0的磷钨酸染色液滴至PE手套上；用干净的吸水纸吸去铜网上的液滴，正面向下放置在磷钨酸染色液滴上，室温孵育5分钟，用干净的吸水纸吸去铜网上的液滴，室温晾干，透射电镜下观察蛋白形态。结果见图4，可见，电镜照片下的诺如病毒主衣壳蛋白颗粒形态单一，大小约为43.99纳米。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的技术方案的实质内容，并不用作保护范围的限定。

Claims (10)

1.一种诺如病毒病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)酶切扩增诺如病毒主衣壳蛋白编码序列片段和质粒载体，连接酶连接并转化感受态大肠埃希菌DH5α；

(2)扩增表达转化成功的大肠杆菌宿主菌株；

(3)纯化扩增表达的宿主菌株中的诺如病毒主衣壳蛋白颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的引物序列为：

NoVFL-F GGAATTCCATATGNNNNNNNNNNNNATGAAGATGGCGTCGAGTGACGCCAAC

NoV-R CGGGATCCTTATAGTGCACGTCTACGCCCCGT。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的连接及转化方法为：用NdeI和BamHI同时酶切扩增片段目的序列和pCold载体，回收目的片段和载体片段，以T4DNA连接酶室温连接10-30分钟，连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α，随机挑选单克隆，接种于LB培养基中，菌落PCR鉴定正确的菌株加入终浓度为30％灭菌甘油保存于-80℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的扩增表达方法为：取适量冻存菌液接种于LB培养基中，37℃振荡培养，待菌液A₆₀₀＝0.4-0.8时，转移至15℃放置30分钟，然后加入IPTG至终浓度为0.1-0.5mM/L，15℃诱导24-72小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的纯化方法为下述方法一或方法二，

方法一：

将细菌裂解液上清于4℃条件下，12000x g离心30分钟，收集上清；

根据上清体积加入适量饱和硫酸铵使成33％饱和度硫酸铵溶液，4℃搅拌下沉淀过夜；

4℃条件下，12000x g离心20分钟，弃上清；

沉淀用无菌PBS溶液重悬过夜，重悬液低速离心去除不溶物质，上清经凝胶层析收集目的蛋白，加入饱和硫酸铵溶液使成33％饱和度硫酸铵溶液，4℃搅拌下沉淀过夜；

4℃条件下，12000x g离心20分钟，弃上清；

沉淀用无菌PBS重悬过夜，重悬液低速离心去除不溶物质；

方法二：

细菌裂解液上清直接采用25％蔗糖垫底，28000rpm，4℃下离心3小时沉淀蛋白；

沉淀蛋白采用无菌PBS复溶，复溶后蛋白采取低速离心去除不溶蛋白，离心参数为10000x g，30分钟，上清和等体积1.6g/ml氯化铯水溶液混合，41000rpm，10℃下离心18-24小时，抽取目的蛋白条带。

6.权利要求1-5任一所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述的诺如病毒病毒样颗粒蛋白为VP1-M，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.权利要求1-6任一所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法制备获得的诺如病毒病毒样颗粒。

8.权利要求1-6任一所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法在制备诺如病毒抗原或疫苗中的应用。

9.权利要求1-6任一所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法在制备重组诺如病毒或诺如病毒病毒样颗粒中的应用。

10.表达权利要求7所述的诺如病毒病毒样颗粒的编码基因。