MX2008007005A - Particulas de virus de planta nuevos y metodos de inactivacion de estos. - Google Patents

Particulas de virus de planta nuevos y metodos de inactivacion de estos.

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Lada Rasochova
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Abstract

La presente invención se refiere generalmente a virus de planta, producidos mediante plantas, para uso como vacunas y similares. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos de inactivación simple, y partículas de virus de planta de este modo obtenidas. La invención aquí descrita proporciona medios y métodos para producir una vacuna segura basada en una exposición de epítope de epítopes derivadas a partir de un agente patogénico en la superficie de partículas similares al virus de planta inactivadas. Esta invención enseña inactivación de partículas de planta quiméricas e integración del paso de inactivación en el procedimiento de purificación de partícula de virus. El método de inactivación reproduce el virus incapaz de infectar plantas y la integridad de partículas de planta es conservada.

Description

PARTÍCU LAS DE VI RUS DE PLANTA NU EVOS Y M ÉTODOS DE INACTIVACIÓN DE ÉSTOS.
Derechos Gubernamentales [0001 ] Esta I nvención fue elaborada en parte con apoyo del gobierno bajo la Subvención No. 1 U01 AI054641 - 01 otorgada por el I nstituto Nacional de Salud . El gobierno tiene determinados derechos en esta invención.
Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada [0002] Esta solicitud reivindica prioridad para la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. 60/742 , 1 97 , presentada en Diciembre 2 del 2005, la divulgación de la cual es aqu í incorporada mediante referencia en su totalidad .
Campo de la Invención [0003] La presente invención generalmente se refiere a virus de planta, producidos mediante plantas, para uso como vacunas y similares. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos de inactivación de virus y a partículas de virus de planta como vacunas y similares.
Antecedentes de la Invención [0004] La vacunación puede proteger individuos y poblaciones enteras de agentes infecciosos. Desarrollar vacunas seguras y efectivas no es, sin embargo, siempre sencillo debido a un número de razones que van desde la identificación de antígenos efectivos hasta preocupaciones de seguridad con las vacunas desarrolladas. El uso de virus como portadores de péptidos extraños ha sido explorado en el campo de vacunas compuesta. Dichas vacunas están basadas en virus quiméricos, que son híbridos de diferentes componentes de virus animales. Usualmente, el componente mayor de tales híbridos es derivado a partir de un virus que está o ha sido dañado , y el componente menor es un componente antigénico seleccionado de un virus patogénico. Por ejemplo , un virus pox tal como la vaccinia o un poliovirus atenuado puede ser usado como un vector para componentes inmunogénicos de otros virus de animales incluyendo virus humanos. [0005] Sin embargo, dichas técnicas como son discutidas anteriormente pueden ser desventajosas. Dichas vacunas son producidas a partir del crecimiento de virus en sistemas de cultivo celular, cuyo diseño y mantenimiento puede ser caro. La aproximación a virus compuestos involucra manipulación genética de virus vivos infectando animales, con el riesgo de que las mutaciones puedan dar resultado a nuevas formas del virus con infectividad , antigenicidad y/o patogenicidad alterada. En suma , el virus de animal usado como el vector puede ser un virus al cual el animal puede ya haber sido expuesto, y el animal puede ya haber producido anticuerpos para el vector. De este modo, el vector puede ser destruido mediante el sistema inmune antes de que el sitio antigénico incorporado del segundo virus induzca una respuesta inmune. [0006] Un número de métodos han sido usados para inactivación de virus en mam íferos. Estos incluyen : irradiación UV, irradiación UV/psoralen , químicos de Pentose Pharmaceuticals, Microondas, Formalin, BPL, pH , temperatura , e incubación en cloruro de amonio. La irradiación UV ha sido usada para inactivar virus de planta recombinantes. Ver e.g. Langeveld et al. (2001 ) "I nactivated Recombinant Plant Virus Protects Oogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus," Vaccine 1 9 :3661 -3670. [0007] Las patentes que se refieren a métodos para producir las partículas y para el uso de las partículas, particularmente como vacunas incluyen la Patente de Estados Unidos No. 6, 1 1 0,466 en la cual se discute las partículas ensambladas de un virus de planta que contiene un péptido extraño predetermi nado como parte de la proteína de cubierta del virus y la Patente de Estados Unidos No. 6,884,623 la cual discute las partículas ensambladas de un virus que contiene un péptido extraño insertado en la proteína de cubierta del virus, donde el sitio del inserto es preferiblemente libre de repeticiones de secuencia directa flanqueando el inserto. [0008] La Patente de Estados Unidos No. 5,602 ,242 se refiere a virus ARN recombinantes para la encapsidación de secuencias virales modificadas genéticamente en cápsides de proteína , preferiblemente de cubierta en forma de bacilo , heterólogas. Esta patente también se refiere a métodos de elaborar y usar dichos virus recombinantes, específicamente con respecto a la transfección de plantas para brindar cambios fenotípcos y genotípicos en las plantas. Medios para eliminar o inactivar genes de proteína de cubierta viral fueron descritos en Ahlquist ef al. ( 1 981 ) "Complete Nucleotide Sequence of Brome Mosaic Virus RNA3," J. Mol. Biol. 1 53:23-38. [0009] Burge et al. "Effect of Heat on Virus I nactivation by Ammonia", Appl. Environ. Mlcrobiology, Aug 46(2):446-51 , 1 983, discute los efectos del calor en la inactivación de virus con cloruro de amonio. El bacteriófago f2 y polivirus 1 (virus de mamífero, envuelto) fueron estudiados. Fue encontrado que temperaturas de arriba de 40° C para dañar el virus aqu í probado. Cramer WN , et al. "Kinetics of virus inactivation by ammonia", Appl Envi ron Microbiology, Mar 45(3):760-5, 1 983, como Burge et al. , usó cloruro de amonio, a un rango de pHs, para tratar aguas residuales en un intento para inactivar virus. Nuevamente , fueron estudiados bacteriófago f2 y poliovirus 1 (cepa CHAT). Los resultados de estas pruebas fueron reportados para mostrar que el rango de inactivación del polivirus fue influenciado mucho menos, si del todo, mediante el efecto de concentración de N H4+ de lo que fue el rango de inactivación de f2. En el documento se discuten las aplicaciones posibles de la metodología en plantas de tratamiento de agua de desperdicio como una posible alternativa para cloruro, particularmente para miembros del grupo enterovirus.
Breve Descripción de la Invención [001 0] La presente invención incluye métodos para inactivar un virus de planta mediante administrar sulfato de amonio al material de planta seleccionado a partir del grupo que consiste de plantas, tejido de planta, células de planta y protoplastos a un pH de arriba de 8.0 para producir una partícula similar al virus (VLP) inactivado; incubar el material de planta por al menos diez horas; y luego recoger la VLP inactivada a partir del material de planta. Estos métodos pueden incluir la incorporación de un péptido extraño en el virus. El virus puede estar en un virus ARN no envuelto. La VLP inactivada puede presentar un péptido bioactivo heterólogo. El sulfato de amonio es administrado a una concentración de 0.5 M a 1 .0 M . , generalmente a 0.7 M . El pH es generalmente 9.0 y el material de planta puede ser incubado a temperatura ambiente. La VLP no es infecciosa debido a que carece de al menos una porción de ARN presente en el virus de planta. Adicionalmente, no puede iniciar infección sobre inoculación y es incapaz de duplicar. [001 1 ] La presente invención puede también incluir la inactivación de partículas de virus de planta quiméricas y la integración del paso de inactivación en el procedimiento de purificación de partícula de vi rus. El método de inactivación reproduce el vi rus incapaz de infectar plantas. La integridad de la partícula de virus es mantenida mientras el ARN genómico viral infeccioso que está presente dentro de la partícula de virus es destruido. Estos métodos puede ser escalables y pueden ser integrados en el proceso de purificación. [0012] La presente invención también incluye métodos para producir una VLP no infecciosa mediante administrar sulfato de amonio al material de planta seleccionado a partir del grupo que consiste de plantas, tejidos de planta, células de planta y protoplastos y carece al menos de una porción de ARN presente en un virus de planta a un pH de arriba de 8.0; incubar el material de planta por al menos diez horas; y recoger la VLP inactivada a partir del material de planta, en donde la VLP no es capaz de duplicar. [0013] Adicionalmente, modalidades de la presente invención pueden incluir una vacuna, en donde la vacuna incluye un virus y el virus incluye un péptido extraño incorporado en el virus y la vacuna es producida mediante un método que comprende administrar sulfato de amonio a un material de planta seleccionado a partir del grupo que consiste de plantas, tejidos de planta, células de planta y protoplastos a un pH de arriba de 8.0 para producir una VLP inactivada; incubar el material de planta por al menos diez horas; y luego recoger la VLP inactivada a partir del material de planta. El péptido de la VLP presentada puede obtener una respuesta inmune cuando la VLP es administrada a un mamífero. La vacuna puede ser usada para virus de influenza, virus de encefalitis equina del este, parvovirus Canino, o Bacillus anthracis. Adicionalmente, la vacuna puede ser una vacuna de subunidad, en donde el péptido es una porción de un antígeno y la porción es efectiva como una vacuna.
Breve Descripción de las Figura [0014] La Figura 1 muestra ARN extraído a partir de virus inactivado PA10 y activo PA10 fluyendo en gel agorosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio ilustrando ARN genómico de CPMV 1 y 2 en el virus activo y ARN degradado en la preparación de virus inactivo. [0015] La Figura 2 ilustra una cromatografía AIEC de PA7E. [0016] La Figura 3-5 Demuestra inactivación ARN para PA9, PA11 , PA18. [0017] La Figura 6 muestra el gel SDS-PAGE de una prueba de estabilidad de temperatura de 5 días para PA1S. [0018] La Figura 7 ilustra anticuerpos anti-PA en monos CPMV-PA inmunizados como es detectado mediante ELISA. [0019] La Figura 8 muestra anticuerpos anti-PA (IgG) en suero y lavado bronquial en el día 140.
Breve Descripción de las Secuencias [0020] SEQ ID NO:1 es la secuencia del péptido de Epítope PA1 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención. [0021] SEQ ID NO:2 es la secuencia del péptido de Epítope PA2 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención. [0022] SEQ ID NO:3 es la secuencia del péptido de Epítope PA3 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención. [0023] SEQ ID NO:4 es la secuencia del péptido de Epítope PA3E usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención.
[0024] SEQ ID NO : 5 es la secuencia del péptido de Epítope PA4 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0025] SEQ ID NO :6 es la secuencia del péptido de Epítope PA5 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0026] SEQ ID NO :7 es la secuencia del péptido de Epítope PA6 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0027] SEQ ID NO :8 es la secuencia del péptido de Epítope PA7 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0028] SEQ ID NO :9 es la secuencia del péptido de Epítope PA7E usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención. [0029] SEQ ID NO: 10 es la secuencia del péptido de Epítope PA8 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0030] SEQ ID NO: 1 1 es la secuencia del péptido de Epítope PA9 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0031 ] SEQ ID NO: 12 es la secuencia del péptido de Ep ítope PA1 0 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0032] SEQ ID NO: 13 es la secuencia del péptido de Epítope PA1 1 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0033] SEQ ID NO: 14 es la secuencia del péptido de Ep ítope PA12 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0034] SEQ ID NO: 15 es la secuencia del péptido de Epítope PA1 3 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención. [0035] SEQ ID NO: 16 es la secuencia del péptido de Epítope PA1 4 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención.
[0036] SEQ I D NO: 17 es la secuencia del péptido de Epítope PA1 5 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención. [0037] SEQ ID NO: 18 es la secuencia del péptido de Epítope PA16 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0038] SEQ ID NO: 19 es la secuencia del péptido de Ep ítope PA1 7 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención. [0039] SEQ ID NO:20 es la secuencia del péptido de Epítope PA1 8 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0040] SEQ ID NO :21 es la secuencia del péptido de Epítope PA1 9 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0041 ] SEQ ID NO:22 es la secuencia del péptido de Epítope PA20 usado de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invención . [0042] SEQ ID NO :23 es la secuencia de aminoácidos del antígeno protectivo (PA) de la presente vacuna de anthrax. [0043] SEQ I D NO :24 es la secuencia de aminoácidos del epítope M2e del virus de influenza .
Descri pción Detallada de la Invención [0044] La presente invención será en adelante descrita de manera más completa en referencia a las figuras que la acompañan, mostradas en las modalidades de la invención . Esta invención puede, sin embargo, ser modificada en varias formas diferentes y no debe ser interpretada como limitada a las modalidades aqu í expuestas. [0045] La presente invención se refiere en parte a métodos de inactivación de virus nuevos para hacer partículas similares del virus de planta nuevas para uso como vacunas y similares. Los métodos para inactivación de virus son aqu í descritos. La presente invención proporciona ejemplos de inactivación de partículas de virus de planta quiméricas e integración del paso de inactivación en el procedimiento de purificación de partícula de virus. El método de inactivación reprod uce el virus incapaz de infectar plantas. Las modalidades de la presente invención pueden incluir medios y métodos para producir una vacuna segura basada en una exposición de epítope de epítopes derivadas a partir de un agente patogénico en la superficie de partículas similares del virus de planta inactivadas. [0046] Las modalidades de la presente invención incluyen un procedimiento escalable y eficiente para inactivación de virus para producir partículas similares del virus (VLPs) que carecen del genoma completo infeccioso del virus. Dichas modalidades incluyen usar una solución reguladora de sulfato de amonio , generalmente a pH 9, como la solución reguladora de extracción inicial . El sulfato de amonio es considerado como no tóxico y aceptable por las autoridades reguladoras. [0047] Las modalidades de la presente invención incluyen inactivación viral con sulfato de amonio a un rango de pH de aproximadamente 9.0. La inactivación viral puede ocurrir a través de división de ARN y degradación. Las partículas virales pueden convertirse en permeabilizadas permitiendo la entrada de iones de amonio en el virus. De esta manera , la incubación con iones de amonio pueden ser llevada a cabo a pH de arriba de 8.0 debido a que a este nivel de pH el virus se hincha por lo cual abre su estructura, permitiendo de este modo la penetración de moléculas pequeñas a través de la cubierta viral. [0048] La presente invención puede también proporcionar para partículas similares al virus ARN nuevo, carecer del ARN típicamente asociado con éstas, en donde dichas partículas similares al virus comprenden un antígeno presentado adecuadamente. [0049] Las modalidades de la presente invención incluyen métodos para la integración de inactivación de partículas en una forma igual con otras operaciones de purificación. Estos métodos pueden incluir instancias en donde el tejido de planta es recolectado y homogenizado en una solución reguladora de extracción, en donde la solución reguladora es sulfato de amonio 0.7 M a pH 9, e incubado a temperatura ambiente por aproximadamente 20 horas. Después de la incubación, las partículas ya no son infecciosas para las plantas y no pueden iniciar infección sobre inoculación. Las mismas condiciones a pH 7.0 no inactivan el virus y temperaturas más altas i.e. 40° C aparentemente dañan la estructura del virus.
[0050] Pasos del Proceso adicionales v Parámetros [0051] Las modalidades de la presente invención pueden también incluir moler/homogenizar el material de planta en la solución reguladora de inactivación, incubar la suspensión molida en una solución de inactivación para degradar el ARN genómico viral, y purificar las partículas de virus resultantes. El material molido puede ser además clarificado mediante centrifugación/filtración antes de la incubación en la solución reguladora de inactivación . Después de la incubación , las partículas pueden ser precipitadas mediante PEG o mediante incrementar la molaridad del sulfato de sodio a un nivel que causa el preci pitado de la partícula a partir de la solución. Los pasos de cromatografía y solución reguladora de intercambio usualmente siguen el paso de inactivación . El paso de inactivación puede ser integrado a cualquier punto en el procedimiento de purificación . Por ejemplo, en algunos procedimientos, la inactivación fue integrada en el proceso de la manera siguiente: CPMV enlazando a la columna H IC en (N H4)2S04 0.7 M , pH 7 ? lavar enlace CPMV con (N H4)2S04 0.7M , pH 9 ? Elución de CPMV con (N H4)2S04 0.7 M , pH 9. Los siguientes rangos pueden ser utilizados: (NH4)2S04 0.5-1 .0 M , pH arriba de 8.0 y temperatura entre 1 0 a 40° C.
[0052] Tipos y Selección de Vi rus q ue pueden ser usados para elaborar VLPs [0053] Las vacunas de la presente invención pueden estar en la forma de antígenos y estar fusionadas a proteínas de cubierta o virus de ARN no envuelto (+ , -, y/o bicatenario). Las modalidades de la presente invención pueden incluir virus RNA de planta junto con virus ARN de planta icosahedral . Si bien el virus del mosaico del frijol bayo es aquí ejemplificado, los métodos de la presente invención pueden ser aplicados a otros virus similares. Por ejemplo, algunos virus preferidos, para uso de acuerdo con la presente TABLA 1 NOMBRE ACRONIMO GENERO FAMILIA Virus del moteado CCMV Bromwirus Bromoviridae clorótico del frijol bayo Virus del mosaico CCMV Comovirus Comoviridae del frijol bayo Virus del enanismo TBSV Tombusvirus Tombusvi idae arbustivo del jitomate Virus del mosaido AMV Alfamovirus Bromoviridae de la alfalfa Virus del mosaico BMV Bromovirua Bromo iridae del bromo Virus del mosaico SBMV Sobemovirus Tombusviridae del frijol sureño
[0054] La presente invención puede ser aplicada a cualquier virus de planta ARN. Para demostrar este sistema fue elegido el comovirus del mosaico del frijol bayo del virus de planta. La estructura tri-dimensional del CPMV es conocido, el cual permite la identificación de sitios adecuados para modificación sin transtornar la estructura de la partícula. Hasta la fecha, los virus de al menos nueve géneros de virus de planta y tres virus satélite ssARN del subgrupo 2 han tenido sus estructuras terciarias y cuaternarias resueltas a alta resolución. Algunos de estos están listados anteriormente en la Tabla 1. [0055] Un grupo ejemplificado de virus de planta para uso como vectores son aquellas proteínas de cubierta que tienen una estructura de barril beta. Una ventaja del uso de virus que tienen una estructura de barril es que las asas entre las cadenas individuales de hoja beta proporcionan sitios convenientes para el inserto de péptidos extraños. La modificación de una o más asas puede ser una estrategia para la expresión de péptidos extraños de acuerdo con la presente invención. Los insertos de otras regiones de la proteína de cubierta también son posibles, tales como insertos dentro del N-terminal y/o C-terminal . [0056] Todos los virus de planta poseen simetría icosahedral cuyas estructuras han sido resueltas conforme a l as ocho veces barril beta en cadena como se ejemplifica mediante CPMV, y es probable que éste represente una estructura común en todos los virus icosahedrales. Todos estos virus son adecuados para usarse en este invención para la presentación de secuencias de péptido extraño, que pueden ocurrir en las asas entre las ß-cadenas y/o en los N-terminal y/o C-terminal . [0057] Los métodos para modificar secuencias de ADN para insertar secuencias extrañas o heterólogas son bien conocidos en el arte. Generalmente la secuencia de ARN viral es convertida en un cADN de longitud completa transcripto y clonado en un vector, luego modificado mediante insertar un segmento de ADN extraño en una región capaz de tolerar dicho inserto sin transtornar replicacion de ARN , formación de partícula o transtornar infectividad . [0058] Los comovirus son un grupo de al menos catorce virus de planta que infectan predominantemente leguminosas. Sus genomas consisten de dos moléculas de ARN de sentido positivo, de cadena sencilla de tamaños diferentes que son encapsidados separadamente en partículas isométricas de aproximadamente 28nm de diámetro . Los dos tipos de partículas de nucleoproteína son conocidos con el término componente medio (M ) y bajo (B) como una consecuencia de su comportamiento en gradientes de densidad de cloruro de cesio, los ARNs dentro de las partículas son conocidos como ARN M y B, respectivamente. Ambos tipos de partículas tiene una composición de proteína idéntica , que consiste de 60 copias de cada proteína de cubierta pequeña (VP23) y larga (VP37). En suma, a las partículas de nucleoproteína , las preparaciones de comovirus contiene una cantidad variable de cápsides vacías (de proteína solamente) que son conocidas como componente (T) alto . [0059] En el caso del miembro de tipo del grupo comovirus, virus del mosaico del frijol bayo (CPMV) es conocido que ambos ARN B y M son poliadenilados y tiene una proteína pequeña (VPg) covalentemente ligada a sus 5 ' términos. Estudios más limitados sobre otros comovirus sugieren que estas características son compartidas por los ARNs de todos los miembros del grupo. Ambos ARNs del CPMV han sido secuenciados y muestran que consisten de nucleotidos (B ) 5889 y (M ) 3481 , que excluyen los poli extremos (A) (van Wezenbeek et al 1 983; Lomonossoff and Shanks, 1 983). Ambos ARNs contienen un marco de lectura abierta largo, individual . La expresión de los productos de gen viral ocurre a través de la síntesis y división subsecuente de polipéptidos precursores largos. Ambos ARNs son requeridos para infección de plantas completas. El ARN B más largo es capaz de replicación independiente en protoplastos, sin embargo no son producidas partículas de virus en este caso (Goldbach et al. , 1 980). Esta observación, acoplada con estudios genéticos anteriores, estableció que las proteínas de cubierta están codificadas mediante ARN M , y la formación de partículas de virus infecciosas es dependiente de la presencia de ambos ARNs genómicos virales M y B . [0060] Una ventaja del Comoviridae es que su cápside contiene 1 6 copias cada una de 3 barril beta diferentes que pueden ser manipuladas individualmente. Todas las otras familias de virus y géneros listados anteriormente tienen estructuras 3-dimensionales similares pero con un tipo individual de barril beta. ( En el caso de CPMV, por ejemplo, el inserto extraño puede ser elaborado inmediatamente precediendo el residuo de prolina 23 (Pro23) en el asa ß?-ß? de la proteína de cápside pequeña (VP23). Ver Patente de Estados Unidos No. 6,884,623. [0061 ] La presente invención puede también ser aplicada a virus de planta icosahedral (incluyendo aquellos que contienen estructuras de barril beta) cuyas estructuras de cristal no han sido aún determinadas. Donde la homología de secuencia significante dentro de los genes de proteína de cubierta existe entre un virus cuya estructura de cristal es desconocida y un segundo virus cuya estructura de cristal es conocida , el alineamiento de estructuras primarias permitirá la ubicación de las asas entre las cadenas beta para ser deducidas [ver Dolja, V. V. y Koonin , E . V. ( 1 991 ) J . Gen . Virol . , 72, pp 1 481 -1486]. En suma, donde un virus tiene solamente homolog ía de secuencia de proteína de cubierta m ínima con aquellos virus cuya estructura de cristal ha sido determinada, pueden ser usados alineamientos estructurales primarios en conjunción con algoritmos de predicción estructural terciarios y secundarios apropiados para permitir la determinación de la ubicación de sitios de inserto potencial . [0062] El CPMV y el virus del moteado de la vaina del fríjol (BPMV) muestran que las estructuras 3-D del BPMV y el CPMV son muy similares y son típicas del Comoviridae en general . [0063] El CPMV comprende dos subunidades, las proteínas de cubierta larga (L) y pequeña (S), de las cuales hay 60 copias de cada una por partícula de virus. Las secuencias de péptido extraño pueden ser expresadas a partir de ya sea las proteínas L o S o a partir de ambas proteínas de cubierta en el mismo virión . [0064] El CPMV es virus ARN biparita. Con la finalidad de manipular el genoma de cualquier virus ARN para expresar péptidos extraños, clones de cADN del ARN pueden ser usados. Los clones de cADN de longitud completa de ambas moléculas ARN de CPMV están disponibles, los cuales pueden ser manipulados para insertar secuencias de oligonucleótido que codifican un péptido extraño. Los clones de cADN del genoma a partir de virus ARN de planta pueden ser usados para generar transcripciones in vitro que son infecciosas cuando son inoculados en plantas. [0065] En un aspecto adicional de la presente invención, los clones de cADN de ARNs de CPMV M y B han sido construidos, en los cuales el clon de cADN del RNA M contiene una secuencia de oligonucleótido insertada que codifica un péptido extraño, la cual hace uso de la secuencia del promotor del mosaico de los vasos de la mandioca (CsVMV) ligada a los extremos 5 ' de los cADNs virales para generar transcripciones infecciosas en la planta . Esta técnica supera algunos de los problemas encontrados con el uso de transcripciones generadas in vitro y es aplicable a todos los virus ARN de planta. [0066] Otros virus pueden incluir varios bromovirus, en particular el virus del moteado clorótico del fríjol bayo (CCMV) y los sobemovirus, en particular el virus del mosaico del fríjol sureño (SBMV). Un segmento de ARN de un virus tripartirta puede también ser usado. Ejemplos de dichos virus útiles son los virus tripartita de Bromoviridae, tales como el virus del mosaico del bromo (BMV) y el virus del moteado clorótico del fríjol bayo (CCMV), los cuales están empaquetados en cápsides icosahedrales.. [0067] El genoma del BMV es dividido entre ARN de sentido mensajero 1 , 2 y 3 de 3.2, 2.9 y 2.1 kb respectivamente. La proteína de cubierta es codificada mediante ARN 4 subgenómico que está formado a partir de ARN3. Con la finalidad de que las células sean infectadas con ARN 3 de BMV las proteínas codificadas mediante ARNs de BMV 1 y 2 deben estar presentes. Estos tres ARN 's de BMV son encapsidados separadamente en partículas idénticas. Cada partícula contiene proteína de cubierta 1 80. La proteína de cubierta puede ser modificada para realizar inserciones de péptido .
[0068] Las proteínas de cubierta de un número de los virus indicado en la Tabla 1 han sido comparadas. La similaridad de los elementos estructurales secundarios y su organización espacial está ilustrada en la FIG 1 0 de la Patente de Estados Unidos No:6,884,623. Cualquiera de las asas que se extiende entre las cadenas beta puede ser usada para insertos de epítopes extraños. Sin embargo, los insertos están hechos de manera que las adiciones están expuestas en ya sea la superficie externa o interna del virus de manera que el ensamble de las subunidades de proteína de cubierta y la infectividad del virus no sean abolidas. La elección de un asa particular puede hacerse usando el conocimiento de la estructura de las subunidades de proteína de cubierta individual y sus interacciones con las demás, como se indica mediante la estructura de cristal , de manera que es poco probable que cualquiera de los insertos interfiera con el ensamblaje del virus. La elección del sitio de inserto preciso puede ser hecha, inicialmente, mediante la inspección de la estructura de cristal , seguida por la experimentación in vivo para identificar el sitio óptimo. [0069] De este modo, la estructura tri dimensional de un virus de planta puede ser examinada con la finalidad de identificar las porciones de una proteína de cubierta que están expuestas particularmente en la superficie del virus y que son por lo tanto sitios potencialmente buenos para insertos. La secuencia de aminoácidos de la porción expuesta de una proteína de cubierta puede también ser examinada por aminoácidos que rompen estructuras helicoidales alfa, debido a que éstas son también sitios potencialmente buenos para insertos. Ejemplos de aminoácidos adecuados son la prolina e hidroxiprolina, las cuales en una cadena de polipéptido interrumpen la hélice alfa y crean una curvatura o pliegue rígido en la estructura. La N-terminal y C-terminal de la proteína de cubierta son también sitios atractivos para insertos.
[0070] Tipos de Antígenos y Epítopes [0071] Las modalidades de la presente invención pueden incluir métodos para vacunas de tipo subunidad; de manera que el antígeno presentado representa solamente un segmento o segmentos de un antígeno que se conoce es efectivo. Tales vacuna (antígenos) pueden ser inherentemente más seguros que los organismos completos o las vacunas de proteína completa debido a que éstas carecen de toda funcionalidad asociada con el proceso de infectividad o patología del padecimiento. [0072] Modalidades de la presente invención pueden incluir métodos para una vacuna de subunidad contra los efectos de la infección por anthrax (Bacillus anthracis). En esta vacuna para anthrax, SEQ ID No:23, los antígenos de subunidad representan segmentos de aproximadamente 25 aminoácidos derivados a partir del llamado antígeno protectivo o PA. Se conoce que ésta proteína es efectiva para incrementar la inmunidad al anthrax y es la base para una nueva generación de vacunas para anthrax.
[0073] Las vacunas para parvovirus canino también son producidas. Ver e. g. Langeveld et al. (2001 ) "I nactivated Recombinant Plant Virus Protects Dogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus", Vaccine 19:3661 -3670 y Langeveld et al. ( 1 995) "Full Protection in Mink Against Mink Enteritis Virus with New Generation Canine Parvovirus Vaccines Based on Synthetic Peptide or Recombinant Protein ," Vaccine 1 3: 033-1 037. Estas vacunas de subunidad basadas en partícula viral han ya probado su efectividad contra un patógeno viral (Parvovirus) y protegido ani males de un reto letal con el agente infeccioso. Las partículas quiméricas están siendo comúnmente producidas en plantas de fríjol bayo mediante infectar la planta con ADNs o ARNs virales recombinantes pre diseñados. Sobre la inoculación , el virus recombinante rocía de cél ula a células y a larga distancia. Esto resulta en una infección sistémica de plantas. El tejido de planta infectado es recolectado , y las partículas de virus quimérico son extraídas, formuladas y usadas como vacunas. De acuerdo con las modalidades de la presente invención , puede ser ventajoso para inactivar los candidatos de vacuna para satisfacer los requerimientos de protección ambiental . [0074] Los métodos presentes de inactivación pueden ser aplicados no solamente a partículas que exhiben epítopes antigénicos que son luego usadas como vacunas, sino también a partículas que exhiben cualquier otro péptido útil tal como péptidos de blanco , péptidos antimicrobianos, y similares. Esta tecnología puede ser también aplicada a las partículas de tipo silvestre o modificadas que son luego usadas para enlace covalente de varias porciones a la superficie de partícula . Esto incluye enlace de proteínas que incluyen proteínas antigénicas, péptidos, carbohidratos, l ípidos, ácidos nucleicos, agentes de detección (tales como tintes fluorescentes), agentes radioactivos, ligandos de blanco y similares. Los complejos de partícula pueden ser usados como vacunas así como también para transportación de los agentes asociados con tejidos blanco y similares. Esta tecnolog ía puede ser también aplicada antes de encapsulación de varios agentes, tales como fármacos, ácidos nucleicos extraños para expresión de genes extraños, toxinas, y similares dentro de las partículas que son luego usadas para administración y transportación del agente encapsulado. [0075] Entre los varios epítopes de péptido que pueden ser usados de acuerdo con la presente invención y expresados en la superficie de las cápsides, están incluidos aquellos de patógenos bacterianos y virales y cánceres que incluyen aquellos del virus de influenza, virus de encefalitis equina del este y B. anthracis. [0076] El péptido extraño , el cual puede ser incorporado en virus de planta (ver e.g . WO 92/1 861 8), puede ser de tipos altamente diversos. Pueden haber algunas limitaciones debido a la naturaleza y talla de los péptidos extraños y el sito en el cual se colocan sobre o en la partícula de virus. La secuencia de péptido no debe interferir con la capacidad del virus modificado para ensamblar cuando es cultivado in vivo. En esta especificación el término "extraño", como se aplica a un péptido o al ácido nucleico que lo codifica , significa péptidos o secuencias de ácido nucleico que no son nativos del virus de planta usado como vector. Dichas secuencias pueden ser descritas alternativamente como secuencias heterólogas o exógenas. El término "péptido" incluye polipéptidos y péptidos pequeños. El péptido generalmente contiene más de 5 residuos de aminoácido. [0077] Las partículas de virus modificado pueden ser formadas a partir de cualquier péptido biológicamente útil. Ejemplos de tales péptidos son las hormonas péptido; enzimas; factores de crecimiento; antígenos de origen animal, fúngico, bacteriano, viral o protozoal; anticuerpos incluyendo anticuerpos anti-idiotípicos; inmunoreguladores y citoquinas, e.g. interferones e interleuquinas; receptores; adhesinas; y partes o precursores de cualquiera de los tipos extraños de péptido. [0078] Entre el amplio rango de secuencias de péptido bioactivo presentado en vectores de virus de planta (de acuerdo con WO 92/18618, por ejemplo) tienen especial importancia los péptidos antigénicos que son la base de vacunas, particularmente de virus animal (incluyendo humano) y vacunas bacterianas. Debe ser notado que las vacunas pueden tener aplicaciones profilácticas (i.e. prevención de padecimiento) o terapéuticas (i.e. tratamiento de padecimiento). Para aplicaciones de vacuna, un sistema de presentación de epítope especialmente atractivo es proporcionado. Cuando es usado para dichas aplicaciones, el componente péptido antigénico será colocado apropiadamente en la partícula de virus para ser reconocido mediante el sistema inmune, por ejemplo mediante ubicación en una parte expuesta de la prote ína de cubierta del virus. De este modo, en algunas modalidades de la presente invención se proporcionan partículas ensambladas de un virus de planta modificado que contiene un antígeno derivado de un patógeno, e. g. un virus de animal o patógeno bacteriano, incorporado en una posición expuesta de la superficie de la proteína de cubierta del virus de planta. La partícula de virus de planta modificado ensamblado puede ser usado como el componente inmunogénico de una vacuna. Dichas partículas de virus de planta modificado ensamblado que presentan péptidos antigénicos también tienen aplicaciones como el componente de presentación de antígeno de una prueba de inmunodiagnóstico para detección de, por ejemplo, patógenos animales (incluyendo humano) y padecimientos. [0079] En modalidades de la presente invención, el VLP antigénico es inactivado y/o reproducido no infecciosamente mientras que mantiene la integridad de los antígenos. De este modo, esto remueve el riesgo de transmisión no intencional de partículas virales infecciosas, aún si hay virus de planta. Esto puede reducir gratamente las preocupaciones regulatorias. De este modo, la transmisión y diseminación del virus de planta a plantas, después de ser administrado a la persona o animal que necesita ser tratado, es gratamente disminuida . Este sistema es altamente versátil en consideración al tamaño del péptido extraño que puede ser insertado en la proteína de cubierta viral. De este modo los péptidos que contienen hasta 38 o más aminoácidos pueden ser usados de acuerdo con la presente invención
[0080] Métodos de Administración [0081 ] Los métodos de administración para estos virus , ahora recombiantes, pueden incluir un aerosol administrado a membranas de mucosa. Sin embargo, varios métodos de administración pueden ser usados de acuerdo con la presente invención . Estos incluyen administraciones inyectables (I P, I , SC), o administraciones orales, intranasales o transdérmicas.
[0082] Virus Cand idatos. Morfología de Cápside de los M ismos, e Inserto de Antígenos/Epítopes en éstos. [0083] El segmento polinucleótido que codifica el péptido extraño puede ser insertado en cualquier lugar adecuado en la proteína de cubierta del virus original que no interfiera con la habilidad del vi rus para replicar e infectar al hospedero, y que permita la producción apropiada y la presentación del péptido en la partícula de virus modificada. Generalmente, el polinucleótido extraño es insertado de manera que es producido como parte de o como fusión con la proteína de cubierta . [0084] Los transcriptores de ARN son preparados, in vivo, como en hospederos bacterianos, o in vitro, como es conocido en el arte, y usados para inocular un hospedero de planta apropiado o tejido de planta. El ARN puede ser usado en forma encapsidada o en solución , desde que la encapsidación ocurrirá dentro del organismo hospedero. Alternativamente, el ADN viral fusionado al promotor de polimerasa ARN dependiente de ADN puede ser usado para iniciar la transcripción de ARNs virales in vivo en el hospedero de planta. Los ARN transcritos son luego capaces de iniciar la infección viral en el hospedero de planta. [0085] Como está entendido por aquellos calificados en el arte, un virus dado puede requerir condiciones especiales para replicación e infectividad óptima, que incluye la presencia de genes que actúan en forma cis o en forma trans, todos los cuales están presentes cuando se infecta la planta o el tejido de planta. Por ejemplo, para infectividad de ARN3 de BMV, la presencia de ARN 1 y 2 de BMV es necesaria . Por otra parte, la infección mediante un virus que tiene los genes de especificidad de hospedero necesaria para un hospedero dado puede en algunas circunstancias permitir la infección del hospedero mediante un segundo virus que no afecta normalmente al hospedero, e. gf. virus BMV y TMV mezclados afectarán ambos cebada y tabaco aún cuando el BMV solo no infecta tabaco y el TMV solo no infecta cebada ( Hamilton y Nichols ( 1 977) Phytopathology, 67:484-489). [0086] Las plantas pueden ser transfectadas bajo condiciones de invernadero y/o campo. La abrasión del tejido de hoja es usualmente requerido para la transfección . Las plantas pueden ser inoculadas en cualquier tiempo durante el ciclo de crecimiento, preferiblemente cuando las plantas son jóvenes. La elección de virus y los detalles de modificación serán asunto de elección dependiendo de los parámetros conocidos y entendidos por aquellos con calificación ordinaria en el arte. [0087] En suma, para modificar la proteína de cubierta, otros genes adecuados pueden ser insertados en el genoma viral original para expresión en la planta hospedera . Estos genes incluyen para producción de péptidos, proteínas, fármacos o cualquier otro polipéptido útil en plantas útiles comercialmente. En general , cualquier gen heterólogo cuyo producto de expresión es funcional dentro de la célula de planta puede ser insertado en el sistema de expresión viral aquí descrito. [0088] La proteína de cubierta modificada por si sola puede ser insertada en un genoma de un virus heterólogo. Con la fi nalidad de asegurar la fidelidad traduccional del gen de proteína de cubierta heterólogo, también será necesario para modificar el codón ATG de iniciación de traducción para la proteína de cubierta original si este no es eliminado, y esto puede ser acompañado por medios conocidos en el arte, tales como sustitución dirigida de oligonucleótido . Si la secuencia de proteína de cubierta a ser adicionada tiene su propio codón de inicio traduccional, la deleción o inactivación del codón de inicio para la proteína original si es necesaria; alternativamente, sin embargo, puede ser retenido y usado para iniciar traducción de la secuencia de proteína de cubierta adicionada, previsto que cualquier cambio de secuencia de aminoácidos i ntroducida de esta manera no interfiere con la formación de cápside y empaquetamiento del ARN .
[0089] Un rango amplio de hospederos de planta susceptibles y células de planta pueden ser usados. Estos incluyen cualquier planta monocotiledonea y dicotiledónea, tejidos de la planta así como también células de planta que crecen en cultivo de suspensión o que forman un callo.
[0090] Pasos del Proceso Adicionales [0091 ] Para producir las partículas de virus de planta modificados, el ácido nucleico viral de planta puede ser modificado mediante introducir una secuencia nucleótida que codifica para el péptido extraño (tal como un virus de animal o un antígeno bacteriano) como una fusión con parte del genoma viral de planta el cual codifica para la proteína de cubierta, infectar plantas o células de planta con el ácido nucleico viral modificado , y recoger partículas unidas del virus modificado. Los virus aislados son luego inactivados de acuerdo con la presente invención . [0092] La secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido extraño es típicamente introducida a la parte del genoma de vi rus de planta que codifica para una porción expuesta de la proteína de cubierta. Este procedimiento puede ser llevado a cabo mediante manipulación de un cADN que corresponde al ARN de un virus ARN . En el caso de un virus ARN , un transcripto de ARN del ADN modificado es preparado usualmente para inoculación de células de planta, o preferiblemente plantas completas, para obtener un estado de multiplicación anterior a la recolección de partículas unidas del virus modificado. Alternativamente, clones de cADN de virus ARN pueden ser construidos en plásmidos de manera que extremos 5 ' de las secuencias que codifican proteína de cubierta viral están fusionadas directamente al sitio de inicio transcripcional de un activo promotor activo en el hospedero de planta. El péptido extraño es expresado inicialmente como parte de la proteína de cápside y de este modo es producido como parte de la partícula de virus entera . El péptido puede de este modo ser producido como una molécula conjugada para ser usado como tal . Alternativamente, la modificación genética del virus puede ser designada con la finalidad de permitir liberación del péptido deseado de la partícula del virus mediante la aplicación de agentes apropiados los cuales causarán división de la partícula de virus. Esto puede ser obtenido mediante insertar aminoácidos que flanquean el péptido de interés que son sensibles a hidrólisis de ácido. Por ejemplo, aminoácidos asp-pro pueden ser diseñados para flanquear el péptido insertado y el péptido puede ser liberado a partir de la partícula mediante tratamiento con un ácido suave. [0093] Con la finalidad de producir virus modificado en una escala comercial , no es necesario preparar inoculante inefectivo (ADN o ARN transcripto) para cada lote de producción de virus. En su lugar, un inoculante inicial puede ser usado para infectar plantas; el virus modificado resultante puede ser amplificado en las plantas para producir virus completos o ARN viral como inoculante para lotes subsecuentes.
[0094] El ADN o ARN extraño puede ser insertado en el genoma de virus de planta en una variedad de configuraciones. Por ejemplo, puede ser insertado como una adición al ácido nucleico existente que codifica para la proteína de cubierta o como una sustitución de parte de la secuencia existente que codifica para la proteína de cubierta. Esta elección puede ser determinada en parte por la estructura de la proteína de cubierta y la facilidad con la cual pueden ser hechas adiciones o remplazamientos sin i nterferencia con la capacidad del virus genéticamente modificado para ensamblarse a partículas en plantas. La determinación del tamaño más apropiado y permisible de adición o deleción para los propósitos de esta invención puede ser obtenido en cualquier caso particular, posiblemente con alguna experimentación adicional , a la luz de la presente divulgación . El uso de insertos adicionales aparece para ofrecer más flexibilidad que insertos de recolocación en algunas instancias. [0095] La multiplicación de virus modificados en plantas es capaz de producir productos significantes. Como se indica anteriormente, la secuencia nucleótida heteróloga insertada puede incluir aquellos que codifican aminoácidos los cuales son rápidamente disociables de manera que, después de un estado de multiplicación, el material deseado puede ser separado de las partículas de virus. Por ejemplo, uno puede insertar dos péptidos en la proteína de cubierta- uno será usado para purificación de la partícula modificada mediante, por ejemplo, purificación de afinidad y disasociada después de la purificación ; el otro puede ser un péptido antigénico que será retenido en la partícula y usado para vacunación . Como una alternativa para división total del péptido, puede ser posible y deseable en algunos casos para liberar el péptido en una forma en la cual permanezca intacto dentro de una parte mayor de la cápside. [0096] De acuerdo con otro aspecto de la presente invención , dos sitios de enzima de restricción diferente pueden ser elegidos dentro del ácido nucleico viral que codifica la proteína de cubierta y el ácido nucleico es restringido usando las enzimas de restricción apropiadas. Pares de oligonucleótidos complementarios son sintetizados codificando el péptido extraño que es deseado para ser insertado en la proteína de cubierta de virus. Los oligonucleótidos terminan en extremos que son compatibles con los sitios de enzimas de restricción permitiendo de este modo el inserto en el ácido nucleico del virus restringido. Este procedimiento resulta en la introducción de una secuencia nucleótida que codifica para un péptido extraño en la secuencia de proteína de cubierta. [0097] Como es aquí usado, el término "virus ARN híbrido" o "virus ARN modificado" se refiere a secuencias de ARN de virus recombinante que comprenden secuencias virales infecciosas derivadas de un virus ARN , y un segmento polinucleótido par aun epítope/antígeno/péptido derivado de otra fuente. De este modo, antes de la inactivación , los ARNs virales modificados o híbridos de esta invención son secuencias de ARN que comprenden secuencias virales infecciosas derivadas a partir de un virus ARN , y un segmento polinucleótido de un epítope/antígeno/péptido derivado de otro virus, bacteria u otras fuentes. El término "virión ARN híbrido" O "partícula de virus h íbrido" puede ser usado para referirse a la forma encapsidada de dichos virus. Una secuencia de ARN viral original adecuada para recibir un segmento polinucleótido que codifica péptido insertado es un ejemplo de una secuencia que corresponde a aquel de un virus ARN . Estas secuencias, cuando son modificadas mediante inserto o de otra manera , son "derivadas de" la secuencia viral que ocurre naturalmente/original . [0098] Dichas secuencias vi rales deben tener como m ínimo las funciones de replicabilidad en el hospedero y la habilidad de infectar el hospedero. Las determinantes de dichas funciones pueden ser requeridas en forma cis o en otros casos pueden ser suplidas en forma trans. Un ejemplo de un requerimiento de replicación satisfactoria en forma trans es la necesidad de I presencia de las proteínas codificadas mediante ARNs de BMV 1 y 2 con la finalidad de permitir al ARN 3 de BMV replicar en el hospedero. En contraste, ciertas señales de replicación deben estar presente en forma cis (i. e. , ligadas directamente a derivados de ARN3) para permitir la replicación de derivados de ARN3 mediante la maquinaria introducida en la célula infectada mediante ARNs 1 y 2. Otro ejemplo de funciones trans son las proteínas codificadas mediante ARN 1 de CPMV con la finalidad de permitir al ARN2 de CPMV replicar en el hospedero. En contraste, ciertas señales de replicación deben estar presentes en forma cis (i. e. directamente ligadas a derivados de ARN2) para permitir la replicación de derivados de ARN2 mediante la maquinaria introducida en la célula infectada mediante ARN 1 . [0099] También puede ser deseable que las secuencias virales originales tengan sitios adecuados para la adición de polinucleótidos que codifican péptido heterólogos o extraños. El término "extraños" y "heterólogos" en referencia a estos segmentos polinucleótidos y secuencias significan secuencias que en la naturaleza no están en el virus original . Similarmente, los polipéptidos y péptidos heterólogos o extraños aqu í se refieren al antígeno o epítope que fue adicionado al sistema de producción/expresión viral . Tales secuencias o polinucleótidos extraños pueden ser insertos en cualquier locación sin incrementar la interferencia con las funciones necesarias de la secuencia viral original , i .e. , la habilidad para replicar e infectar al hospedero. En referencia a la expresión en un hospedero un polinucléotido "heterólogo" o "aislado" se refiere a uno que n está naturalmente presente en la ubicación en el hospedero en el cual ha sido colocado. Es deseable que la ubicación de los segmentos que codifican péptido heterólogo no interfieran con las funciones necesarias de las secuencias virales originales. [0100] Los segmentos de ácido nucleico insertos no necesitan ocurrir naturalmente pero pueden ser modificados, componer más de un segmento que codifica, o codificar más de un péptido/polipéptido. El ARN puede también ser modificado mediante combinar insertos y deleciones con la finalidad de controlar la longitud total u otras propiedades de la molécula de ARN modificada. [0101] Las secuencias de ARN extraño insertado pueden ser virales o no virales en el origen, y pueden corresponder ya sea a ARN o ADN naturalmente. Estas pueden ser de origen procarióticas o eucarióticas, durante tanto tiempo como éstas están en la forma que puede ser traducida directamente mediante la maquinaria de traducción de la célula recipiente u reconocida de otro modo y utilizada para sus funciones regulatorias, estructurales o funcionales. [0102] Cualquier planta puede ser infectada con una secuencia de ARN de esta invención, como será evidente para aquellos calificados en el arte, mediante proporcionar funciones de replicación y especificidad del hospedero apropiadas. Con construcciones apropiadas, otros organismos eucarióticos pueden también ser infectados, así como también pueden ser cultivos de tejido o células individuales. Esta invención no está limitada a ninguna clase dada de hospedero o tipo de virus ARN. [0103] El término "infección sistémica" significa infección diseminada a lo largo del sistema del organismo hospedero para involucrar más allá de las células del sitio de inoculación original. El organismo hospedero entero no necesita estar infectado; ciertos tejidos pueden ser blancos para la infección. Los tejidos preferidos son tejidos de hoja. [0104] El término "transfectado" como se aplica al organismo hospedero significa la incorporación de las secuencia virales de esta invención a las células del organismo de tal manera que sea replicada en éstas. Para ser transfectado, el organismo no necesita estar infectado sistemáticamente, pero puede ser no infectado sistemáticamente. Sin embargo, la diseminación sistémica del virus no es requerida por la presente invención. [01 05] Los métodos para iniciar infección del organismo hospedero son bien conocidos en el arte, y cualquier método adecuado puede ser usado. Un método preferido para la i nfección de plantas es poner en contacto la planta herida con una solución que contiene el virus o ARN viral de manera que provoque el virus replique en ella , o infecte la planta . [01 06] Modalidades de la presente invención pueden utilizar virus de planta como sistemas de vector para producir vacunas similares y otros polipéptidos en y mediante plantas. Un aspecto de la presente invención se refiere a las partículas ensambladas de un virus ARN de planta que contienen un péptido extraño predeterminado como parte de la proteína de cubierta del virus, en donde el ARN ha sido removido o reproducido no infecciosamente usando métodos de la presente invención . La presente invención puede también incluir partículas ensambladas de un virus de planta que exhiben un péptido extraño, en donde la exhibición interna es posible. La presente invención incluye también virus que carecen de ARN infeccioso. [0107] Como aplicación par la preparación de vacunas, la presente invención tiene ventajas sobre las vacunas convencionales, vacunas recombinantes basadas en virus animales o bacterias, y vacunas de péptido que incluyen: 1 ) costos bajos de producción, así como producción muy alta de partículas de virus puras que son obtenidas a partir de plantas infectadas, y no es necesario el paso de producción de cultivo de tejido; 2 ) mejorar la seguridad , como virus de planta son incapaces de infectar y replicar en animales, y de este modo no serán capaces de mutar en formas virulentas, como puede ser el caso con las vacunas de virus de animal recombinantes y convencionales; 3) estabilidad excepcional tanto como comovirus como preparaciones purificadas pueden ser secadas y almacenadas por varios años sin perder su efectividad ; 4) carecer de conjugación del péptido para el resultado en inmunogenicidad incrementada de este modo exhibiendo el péptido en la superficie de las partículas; y 5) virus más pequeños que permiten la introducción de genes quiméricos mediante manipulación in vitro en contraste con la recombinación homologa in vivo (transfección). [01 08] A menos que sea indicado de otra manera, los términos "un", "una" y "el" como son usados aqu í se refieren al menos a uno . [01 09] Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales, y publicaciones aqu í referidas o citadas son incorporadas mediante referencia en su total extensión siendo estas consistentes con las enseñanzas de esta especificación . [01 1 0] A continuación están los ejemplos que ilustran los procedimientos para practicar la invención . Estos ejemplos no deben ser usados como limitantes. Todos los porcentajes están en peso y todas las proporciones de mezclas de solvente están en volumen a menos que se haga nota de algo distinto.
Ejemplos Ejemplo 1 -Breve Descri pción de la Inactivación de Partícu las CPMV [01 1 1 ] Más de 1 6 partículas de CPMV diferentes (portando epítopes diferentes) así como también virus de CPMV de tipo silvestre fueron inactivadas usando este procedimiento. El ARN ha sido aislado de los virus inactivados y puestos a fluir en un gel para determinar si el ARN está degradado. Las partículas inactivadas han sido también inoculadas para platas para probar la habilidad para inducir infección . Ninguna de las plantas inoculadas produce infección viral . El ARN aislado a partir de partículas de virus inactivadas fue degradado en cada caso probado (ver la Figura 1 como un ejemplo).
Ejemplo 2- Ejemplos Ad icionales de Inactivación de CPMV [01 1 2] Un estudio fue realizado para determinar si sulfato de amonio 0.8 M puede inactivar CPMV mientras se preserva su integridad . Sulfato de amonio 0.8 M fue usados como parte del presente proceso de purificación . I ncrementar el pH durante el proceso pudo permeabilizar el virus pero también incrementó la concentración de N H3 libre. [01 1 3] La conclusión de este estudio fue que sulfato de amonio 0.8 M a pH 9 y a pH 7 ambos a 22° C y 40° C preservaron la integridad del virus y que la ¡nfectividad del virus fue perdida solamente a pH 9. Los experimentos de control donde fue incubado CPMV en Tris-HCI 30 mM a 22 y 40° C produjeron partículas de CPMV completamente infectivas. A partir de estos resultados, fue además concluid que es la combinación del sulfato de amonio 0.8 M y pH 9 lo que es requerido para causar la inactivación y no la temperatura o el sulfato de amonio solo. Los experimentos en este estudio fueron llevados a cabo en un caldo de células molidas ajustadas a la concentración de sulfato de amonio adecuado y pH y fue una preocupación que un compuesto en la suspensión de planta estuviera causando inactivación (e.g. psoralenos). Para probar o desaprobar esto, un segundo estudio fue realizado para determinar si las partículas de CPMV purificadas pueden ser inactivadas usando la combinación de sulfato de amonio y pH 9. Varios químicos de grados de pureza fueron usados para determinar si algunas impurezas en los químicos fueron responsables de la inactivación. Una matriz experimental fue colocada y todas las condiciones probadas como se muestra en la Tabla 1. Fue usado sulfato de amonio 0.7 M como si fuera parte de nuestro proceso re-optimizado de manera que una integración fácil fue posible. Tabla 2. Una matriz experimental para estudio de inactivación de ( H^SC a 22° C por 20 h. Pureza Concentración Tris-HCL 30 mM No. ÍNH_) S04 (NHi)?S04 1 ANALAR 0.1 Si 2 ARISTAR 0.5 No 2 0.7
[0114] Las concentraciones de (NH4)2S040.7 M y 0.5 M a pH 9 inactivaron CPMV mientras (NH4)2S040.1 M a pH 9 no. La Figura 1 muestra ARN, extraído a partir de virus inactivo y activo, fluyendo en gel agarosa al 1.2% y teñido con EtBr. Los resultados muestran presencia de ARN 1 y 2 genómico de CPMV en el virus activo, y ARN degradado en la preparación de virus inactivado. Los mismos resultados han sido obtenidos en otras 15 partículas virales quiméricas y por el virus de tipo silvestre.
Ejemplo 3- Partículas de CPMV Quiméricas Usados en los Experimentos de Inactivación [0115] Las partículas de CPMV quiméricas fueron diseñadas para expresar péptidos derivados a partir de la proteína de antígeno protectivo ("PA") de Bacillus anthracis. Los péptidos fueron expresados en las proteínas de cubierta pequeñas y/o grandes de CPMV, usando los métodos descritos en las patentes de Estados Unidos 5,874,087; 5,958,422 y 6,110,466. Los siguiente péptidos fueron expresados: Tabla 3 E pito pe Secuencia Péptida SFO ID NO: PAI SNSRKKRSTSAGPTVPDRDNDGIPD 1 PA2 SPE ARHPLVAAY PIV W D ENI ILS 2 PA3 RIIFNGKDLNLVERRIAAVNPSDPL 3 PA3E ERIIFNGKDLNLVERRIAAVNPSDPL 4 PA4 RQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPN 5 PA5 SDF EKVT RI DKNVSP EARHP 6 PA6 HVDMENIILS NEDQSTQNTDSQTR 7 PA7 TDS QTRTISKNTSTSRTHTSEVHGN 8 PA7E ETDSQTRTISKNTSTSRTHTSEVHGN 9 PA8 HGNA EVHASFFDIGGSV SAGFSNSN 10 PA9 SNSNSSTVAIDHSLSLAGERT 11 Tabla 3 E pito pe Secuencia Péptida SEQ ID NO: PAIO ETMGL TADTARLNANI 12 PA11 EPTTSLVLGKNQTLATI KAKE NQ E 13 PA12 PS NL-APIALNAQDDFSSTPITMN 14 PA13 SEVLPQIQETTARIIFNGKD 15 PA14 NGKDUMLVERRIAAVNPSDPLETTK 16 PA15 ETTKPDMTLKEALKIAFGFNEPNGN 17 PA16 Q G DITE FDFNF DQ QTSQ I KNQ 18 PA17 DRNNIAVGADESVVKEAHRE 19 PA18 REVI NSSTEG LLLNI DKDIRKI LSG 20 PA19 D LNISSLRQDGKTFIDFK 21 PA20 TKENTI INPS ENGDTSTNGI K 22 Ejemplo 4- Producción de Partículas de CPMV Quiméricas en Plantas [0116] Las semillas de Fríjol Bayo California # 5 de Ferry Morse, número de parte 1450, fueron germinadas durante la noche a temperatura ambiente en toallas de papel húmedas. Las semillas germinadas fueron transferidas a la tierra. Siete días tras la germinación las plántulas fueron inoculadas con WT de partículas de CPMV. Después de la inoculación, las plantas crecieron a 25° C con un periodo de photo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad por dos a tres semanas. Las hojas que mostraron síntomas fueron recogidas y congeladas a -80° C antes de la purificación.
Ejemplo 5 - Inactivación de Partículas de CPMV Quiméricas y Purificación de Partículas Similares al Virus de CPMV Quiméricas Inactivadas [0117] Fueron congelados a -80° C 40 g de tejido de hoja infectado con CPMV. El tejido de hoja congelado fue aplastado a mano y colocado en una mezcladora de alta velocidad "Waring", número de parte 801 1 S. Fueron colocados 1 20 mi de solución reguladora de inactivación fría (sulfato de amonio 0.5 M , Tris base 0.03 M pH 9.00, PMSF 0.2 mM ) en las hojas aplastadas. Las hojas fueron molidas 2 veces por 3 segundos a alta velocidad . La solución fue decantada en un bote de centrifugado de 500 mi . La mezcladora fue lavada con 30 mi de solución de inactivación fría y el lavado fue vaciado en un bote de centrifugado de 500 mi . La solución fue centrifugada a 1 5,000 G por 30 minutos para remover el debris celular de planta . El supernatante fue decantado en un cilindro graduado e incubado para inactivar el virus por 20 horas a temperatura ambiente. Para precipitar el virus de CPMV, fue adicionada solución PEG 6000 ( PEG 6000 al 20% , NaCI 1 M ) al supernatante para brindar la concentración final de PEG a PEG 6000 al 4% con NaCI 0.2 M , y la solución fue gentil mente mezclada . Fue permitido que la solución se precipitara por una hora en hielo. La solución de precipitado de virus fue luego centrifugada a 1 5,000 G por 30 minutos para recolectar el sedimento de virus CPMV. El supernatante fue vaciado y el virus fue inmediatamente resuspendido en solución reguladora que enlaza intercambio de anión (Tris base 30 mM , pH 7.50). Para purificación adicionalmente las partículas similares al virus, la mezcla de proteína fue fraccionada mediante cromatografía de intercambio de anión usando resina de intercambio de anión fuerte POROS 50 HQ de Applied Biosystems, número de parte 1 -2559-1 1 . El gradiente de volumen de columna 20 fue de solución reguladora A, Tris base 30 mM, pH 6.75, a solución reguladora B, Tris base 30 mM, pH 6.75 con NaCI 1 M. La cromatografía fue realizada con un explorador AKTA de Amersham Biosciences, número de parte 18-1112-41. La Figura 2 ilustra la cromatografía AIEC de PA7E. Todas las muestras listadas en el Ejemplo 3 fueron procesadas usando el método descrito en este Ejemplo con resultados similares. Dos picos mayores fueron detectados. El trazo azul es la absorbencia a 280, el trazo rojo es la absorbencia a 260, el trazo verde es el porcentaje de solución reguladora B, y el trazo café es la conductividad. Las marcas rojas en la parte inferior del cromatograma son las fracciones. El primer pico en el gradiente, que contiene las partículas similares al virus deseado, fue solución reguladora intercambiada por solución reguladora PBS, pH 7.4 usando un concentrador de giro Millipore de membrana de corte 100 kDa, número de parte UFC910096. Las muestras fueron luego almacenadas a -80° C. El segundo pico contiene la contaminación de partícula disasociada. Un gel SDS-PAGE fue preparado, con la carga AIEC de precipitado PEG PA7E, estándar CPMV WT y las fracciones PA7E AIEC. El SDS-PAGE fluyó en un Bis-Tris al 4-12% Nupage de Invitrogen, gel pozo 12, número de parte NP0322. La solución reguladora fluyendo fue solución reguladora fluyendo MES SDS de Invitrogen Nupage, número de parte NP0002. El gel fue fluido con una carga de voltaje de 200V por 35 minutos. La línea 1 que contiene 5ul de marcador Ladder SeeBlue Plus 2 de Invitrogen, número de parte LC5925. La línea 2 contiene el -i precipitado ??7? PEG resuspendido que fue cargado en la columna AIEC. La línea 3 contiene CPMV WT. Las líneas 4-8 contienen las partículas PA7E purificadas blanco que corresponden al pico 1 AIEC que fueron recolectadas y procesadas adicionalmente. Las líneas 9-10 contienen la contaminación de partículas PA7E disasociadas que corresponden al pico 2 AIEC.
Ejemplo 5 - Análisis de Partículas Similares al Virus de CPMV Quiméricas Inactivadas - Extracción de ARN Genómico Viral [0118] El ARN acuoso de Ambion, número de parte 1912, el equipo fue usado para extraer el ARN genómico viral de las muestras de CPMV inactivado purificado PEG. Las partículas de virus CPMV que no hubieron sido inactivadas fueron usadas como un control (muestras activas). Las Figuras 3-5 muestran los resultados de la inactivación de ARN por PA9, PA10, PA11, PA12 y PA18. Todas las muestras listadas en el Ejemplo 3 fueron procesadas usando el método descrito en el Ejemplo 6 con resultados similares. Los E-geles al 1.2% de pre-prueba de Invitrogen, número de parte G501801, fueron usados para visualizar el ARN extraído para las Figuras 1-3. Todos los marcadores en las Figuras 3-5 fueron cargados con 1 ul de Ladder Plus KB 1, número de parte 10787-026. En las figuras 3, línea uno es 1 ul de marcador. La línea 2 es PA9 activo. La línea 3 es PA9 inactivado. La línea 4 es marcador. La línea 5 es PA10 activo, la línea 6 en PA10 inactivado. La línea 7 es marcador. En las figuras 4, la línea 1 es 1 ul de marcador. La línea 2 es PA11 activo. La línea 3 es PA18 inactivado. El ARN genómico viral fue degradado en las muestras inactivadas como se indicó mediante la detección de "extensiones" pero ARN1 y ARN2 genómico de CPMV de longitud completa fue detectado en las muestras que no sufrieron inactivación.
Ejemplo 7 - Análisis de Partículas Similares al Virus de CPMV Quiméricas Inactivadas - Estabilidad mediante SDS-PAGE [0119] La estabilidad de las proteínas de cubierta grandes y pequeñas fue probada con SDS-PAGE. La Figura 6 muestra el gel SDS-PAGE de una prueba de estabilidad de temperatura de 5 días para PA1S como un ejemplo. El SDS-PAGE fue diluido en Bis-Tris al 4-12% Nupage de Invitrogen, gel 12 pozo, número de parte NP0322. El gel fue diluido con una carga de voltaje de 150 V por 60 minutos. La solución reguladora fluyendo fue MES SDS Nupage de Invitrogen, número de parte NP0002. La línea 1 contiene 7 ul de marcador de proteína no teñida Benchmark de Invitrogen (Invitrogen Benchmark Unstained Protein Ladder), número de parte 10747-012. La línea 2 contiene partícualas de virus PA1S inactivadas incubadas a temperatura ambiente por 5 días. La línea 3 contiene partículas de virus PA1S inactivadas incubadas a 4o C por 5 días. La línea 4 contiene partículas de virus PA1S inactivadas incubadas a -20° C por 5 días. No fue detectada degradación de proteína.
Ejemplo 8 - Análisis de Partículas Sim ilares al Virus de CPMV Quiméricas Inactivadas - Estabil idad Mediante SEC [01 20] La integridad de las partículas similares al virus ensambladas fue probada usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Todas las muestras listadas en el Ejemplo 3 fueron analizadas usando SEC con resultados similares. La columna SEC usada fue una columna SEC anal ítica Tosoh TskGel G5000 de 30 cm x 7.8 mm de Supelco con tamaño de cama de 1 0 micrón , número de parte 08023. La fase móvil para la SEC fue NaP04 0.1 M pH 7.00. Un pico individual fue detectado correspondiendo a las partículas de virus ensambladas. Las partículas de CPMV ensambladas eluidas a partir de la columna con un tiempo de retención de 1 4.0 minutos.
Ejemplo 9 - Análisis de Partículas Si mi lares al Virus de CPMV Qu iméricas Inactivadas - Infectividad en Plantas [0121 ] Las partículas de CPMV quiméricas inactivadas listadas en el Ejemplo 3 fueron probadas para su habilidad para infectar plantas. Las semillas de fríjol bayo California #5 de Ferry Morse, número de parte 1 450, fueron germinadas durante la noche a temperatura ambiente en toallas de papel húmedas. Las semillas germinadas fueron transferidas a la tierra. Siete d ías tras la germinación las plántulas fueron inoculadas con WT de partículas de CPMV. Después de la inoculación , las plantas crecieron a 25° C con un periodo de photo de 1 6 horas de luz y 8 horas de oscuridad por dos a tres semanas y se observaron síntomas de formación . Las plantas inoculadas con WT inactivado o partículas de CPMV quiméricas fueron recogidas y procesadas para aislamiento de partículas de virus. Fueron congelados a -80° C 40 g de tejido de hoja. El tejido de hoja congelado fue aplastado a mano y colocado en una mezcladora de alta velocidad "Waring", número de parte 801 1 S . Fueron colocados 1 20 mi de Tris base 30 mM , pH 7.50, PMSF 0.2 mM en las hojas aplastadas. Las hojas fueron molidas 2 veces por 3 segundos a alta velocidad . La solución fue decantada en un bote de centrifugado de 500 mi . La mezcladora fue lavada con 30 mi de solución reguladora fría y el lavado fue vaciado en un bote de centrifugado de 500 mi . La solución fue centrifugada a 1 5,000 G por 30 minutos para remover el debris celular de planta . El supernatante fue decantado en un cilindro graduado. Para precipitar el virus de CPMV, fue adicionada solución PEG 6000 fría (PEG 6000 al 20% , NaCI 1 M ) al supernatante para brindar la concentración final de PEG a PEG 6000 al 4% con NaCI 0.2 M , y la solución fue gentilmente mezclada . Fue permitido que la solución se precipitara por una hora en hielo. La solución de precipitado de virus fue luego centrifugada a 1 5,000 G por 30 minutos para recolectar el sedimento de virus CPMV. El supernatante fue vaciado y el virus fue inmediatamente resuspendido en solución reguladora PBS , pH 7.4. Las muestras fueron probadas para la presencia de partícula de virus con SDS-PAGE. El SDS-PAGE fue diluido en Bis-Tris al 4-1 2% Nupage de I nvitrogen , gel 1 2 pozo, número de parte N P0322. El gel fue diluido con una carga de voltaje de 1 50 V por 60 minutos. La solución reguladora fue solución reguladora fluyendo Nupage MES SDS de Invitrogren, número de parte NP002. No fueron detectadas partículas de virus.
Ejemplo 10 - Inmunización de Ratones con Partículas de CPMV Inactivadas que Contienen Epítope PA [0122] Ratones femeninos balb/c de 7 semanas de edad fue inyectado tres veces intraperitonealmente con 100 pg de CPMV-PA inactivado purificado en la presencia de adyuvante. Los ratones de control recibieron partículas de CPMV inactivadas con péptido no relacionado o solamente adyuvante en PBS, pH 7.00. Fue usado 100 µ? de adyuvante Ribi (R-700; Ribi Immunochem Research, Hamilton, Montana) mezclado con 100 µ? de la muestra. El volumen total de administración fue 200 µ?. Las inyecciones fueron administradas a intervalos de 3 semanas. [0123] Para inmunización intranasal, PA de CPMV inactivado, sin adyuvantes, fue administrado a ratones anestesiados. Un volumen total de 100 µ? fue administrado en dos aberturas nasales (50 µ? por abertura nasal). Los ratones de control recibieron CPMV inactivado con péptido no relacionado o solamente PBS, pH 7.0. [0124] Las muestras de sangre fueron obtenidas 1 día después de la primera administración y 2 semanas después de cada una de las dos subsecuentes administraciones. [0125] La breve descripción de los estudios de inmunización de ratones se proporciona a continuación: Tabla 4 Adyuvante Tratamiento Ruta Dosis # de rat nes Sí CP V-PA IP 3x1 00 ug/200 ul 5 Sí control-CPMV IP 3x1 00 ug/200 ul 5 Sí PBS, pH 7.0 IP 3xN/A/200 ul 3 No CPMV-PA IN 3x 00 ug/100 ul 5 No control-CPM V I N 3x1 00 ug/1 00 ul 5 No PBS. pH 7.0 I N 3xN/A/100 ul 3 Ejemplo 1 1 -Inmu n ización de Primates No H umanos con Partículas de CPMV Inactivadas q ue Contienen Epítopes PA [0126] Las partículas de CPMV inactivado que contiene epítopes PA fueron probadas en su habilidad para generar respuestas de anticuerpo para los péptidos de anthax co-expresados cuando son administrados a macacos rhesus. Cuatro monos fueron inmunizados intramuscularmente con las elaboraciones de péptido de PA de CPMV inactivado y un mono con el control de CPMV de tipo silvestre inactivado. Cada dosis de inmunización consistió de 2 mg de la mezcla de péptido del virus de todos las 1 6 elaboraciones de PA de CPMV. Los animales fueron vacunados en los d ías 0, 7, 1 4 y 28. [01 27] Los anticuerpos IgG y IgA fueron monitoreados usando pruebas de ELISA con proteína de PA como un blanco. Tres a 5 mi de sangre fueron vaciados en heparina en cada uno de los d ías de inmunización. Las células y el plasma fueron separados y criopreservados. Los monos anestesiados con quetami na fueron broncoscopiados en los d ías 0, 1 4, y 28 y especímenes de lavado bronquial fueron obtenidos y criopreservados. Los lavados bronquiales y el plasma fueron descongelados y los títulos de anticuerpo IgG e IgA medidos en pruebas de ELISA. Altos títulos de ambos anticuerpos IgG e IgA fueron detectados en el plasma y los lavados bronquiales. Los resultados son mostrados en las Figuras 7 y 8.
Ejemplo 12 -Inmu nización de Ratones con Partícu las de CPMV Inactivadas q ue Contienen Epítope M2e del Vi rus de Influenza [01 28] Ratones femeninos balb/c de 1 7 semanas de edad fueron inyectados tres veces intraperitonealmente con 1 00 pg de CPMV inactivado purificado que expresa un péptido M2e de influenza en la presencia de adyuvante. La secuencia es SLLTEVETPI RN EGCRCN DSSD (SEQ I D NO: 24). Los ratones de control recibieron partículas de CPMV inactivado con péptido no relacionado o solamente adyuvante en PBS , pH 7.00. Fueron usados 1 00 µ? de adyuvante Ribi (R-700; Ribi I mmunochem Research , Hamilton , Montana) mezclado con 1 00 µ? de la muestra fue usado. El volumen total para la administración fue 200 µ ? . Las inyecciones fueron administradas a intervalos de 3 semanas. [01 29] Para inmunización intranasal , PA de CPMV inactivado que contiene péptido M2e de influenza, sin adyuvantes, fue administrado a ratones anestesiados. U n volumen total de 1 00 µ ? fue administrado en dos aberturas nasales (50 µ ? por abertura nasal) . Los ratones de control recibieron CPMV inactivado con péptido no relacionado o solamente PBS, pH 7.0.
[0130] Las muestras de sangre fueron obtenidas 1 día después de la primera administración y 2 semanas después de cada una de las dos subsecuentes administraciones. [0131] La breve descripción de los estudios de inmunización de ratones se proporciona a continuación: Tabla 6 Adyuvante Tratamiento Ruta Dosis # de ratones Sí CP V-M2e IP 3x100 ug/200 ul 5 Sí control-CPMV IP 3x100 ug/200 ul 5 Sí PBS, pH 7.0 IP 3xN/A/200 ul 3 No CPMV-M2e IN 3x100 ug/100 ul 5 No control-CPMV IN 3x100 ug/100 ul 5 No PBS, pH 7.0 IN 3XN/A/100 ul 3
[0132] Lo precedente es ilustrativo de la presente invención, y no está elaborado como limitante de la misma. La invención es definida mediante las siguientes reivindicaciones, con equivalentes de las reivindicaciones a ser incluidas aquí.

Claims (14)

  1. REIVI N D ICACION ES 1 . Un método para inactivar un virus de planta que comprende: administrar sulfato de amonio a material de planta que expresa una partícula similar al virus en donde el material de planta es seleccionado a partir del grupo que consiste de plantas, tejido de planta, células de planta y protoplastos a un pH de arriba de 8.0; incubar el material de plantas por al menos diez horas para producir una partícula similar al virus (VLP) ; y recoger el VLP inactivado a partir del material de planta .
  2. 2. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 , que comprende además al menos un péptido extraño incorporado en el virus.
  3. 3. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 , en donde dicho virus en un virus ARN no envuelto.
  4. 4. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 , en donde dicho VLP inactivado presenta un péptido bioactivo heterólogo.
  5. 5. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 , en donde dicho péptido es un antígeno.
  6. 6. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 , en donde dicho péptido es un epítope.
  7. 7. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 , en donde el sulfato de amonio es administrado a una concentración de 0.5 M a 1 .0 M .
  8. 8. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el pH es pH
  9. 9.0 9. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el material de planta es incubado entre 10° C a 40° C.
  10. 10. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde dicho método comprende enlazar dicho virus de planta a una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica en (NH4)2S04 7.0 M a pH 7, lavando virus de enlace con (NH )2S04 0.7 M a pH 9, y eluyendo dicho virus con (NH )2S040.7 M a pH 9.
  11. 11. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el virus tiene una cápside que es icosahedral.
  12. 12. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el virus es de una familia seleccionada a partir del grupo que consiste de Bromoviridae, Comoviridae y Tombusviridae.
  13. 13. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el virus es un género seleccionado a partir del grupo que consiste de Bromovirus, Comovirus, Tombusvirus, Alfamovirus y Sobemovirus.
  14. 14. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el virus es seleccionado a partir del grupo que consiste de virus del mosaico del frijol bayo, virus del moteado clorótico del frijol bayo, virus del enanismo arbustivo del jitomate, virus del mosaico de la alfalfa, virus del mosaico del bromo y virus del mosaico del frijol sureño. 1 5. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 , en donde el virus comprende proteínas de cubierta y los péptidos son antígeno fusionado a las proteínas de cubierta. 1 6. El método de acuerdo con la Reivi ndicación 1 , en donde el péptido es seleccionado a partir del grupo que consiste de una hormona de péptido, una enzima, un factor de crecimiento , un anticuerpo, un inmunoregulador y una citoquina . 1 7. El método de acuerdo con la Reivindicación 3, en donde dicho método comprende además convertir una secuencia de ARN viral en un transcriptor de cADN de longitud completa, clonar dicho cADN en un vector, y modificar dicho cADN mediante insertar un segmento de ADN extraño en una región capaz de tolerar dicho inserto sin interrumpir la replicación de ARN , la formación de partícula o infectividad . 1 8. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 , en donde el péptido extraño incorporado en el virus es seleccionado a partir del grupo que consiste de una subunidad de virus de influenza, virus de encefalitis equina del este, parvovirus canino, y Bacillus anthracis. 1 9. Un método para producir una VLP no infecciosa que comprende: administrar sulfato de amonio a un material de planta seleccionado a partir del grupo que consiste de plantas, tejido de planta, células de planta y protoplastos y carecer al menos de una porción de ARN presente en un virus de planta a un pH de arriba de 8.0; incubar el material de planta por al menos diez horas; y recoger la VLP inactivada a partir del material de planta, en donde dicha VLP no es capaz de replicar. 20. Una vacuna que comprende una VLP en donde dicha vacuna comprende un virus de planta en donde dicho virus comprende al menos un péptido extraño incorporado en el virus y la vacuna es producida mediante un método que comprende administrar sulfato de amonio al material de planta seleccionado a partir del grupo que consiste de plantas, tejido de planta, células de planta y protoplastos a un pH de arriba de 8.0 para producir una VLP inactivada, incubar el material de planta por al menos d iez horas; y recoger la VLP inactivada a partir del material de planta . 21 . La vacuna de acuerdo con la Reivindicación 20 , en donde el péptido de VLP presentado obtiene una respuesta inmune cuando dicha VLP es administrada a un mamífero . 22. La vacuna de acuerdo con la Reivindicación 20 , en donde la vacuna es para virus de influenza , virus de encefalitis equina del este, parvovirus canino, o Bacillus anthracis. 23. La vacuna de acuerdo con la Reivindicación 20 , en donde el péptido es un ep ítope. 24. La vacuna de acuerdo con la Reivindicación 23, en donde el epítope es un patógeno viral , un patógeno bacteriano o cáncer. 25. La vacuna de acuerdo con la Reivindicación 20, en donde dicha vacuna es una vacuna de subunidad , en donde dicho péptido es una porción de un antígeno y dicha porción es efectiva como una vacuna . 26. La vacuna de acuerdo con la Reivindicación 20, en donde dicho péptido extraño comprende SEQ I D NO: 23. RES U M E N La presente invención se refiere generalmente a virus de planta, producidos mediante plantas, para uso como vacunas y similares. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos de inactivación simple, y partículas de virus de planta de este modo obtenidas. La invención aqu í descrita proporciona medios y métodos para produci r una vacuna segura basada en una exposición de epítope de epítopes derivadas a partir de un agente patogénico en la superficie de partículas similares al virus de planta inactivadas. Esta invención enseña inactivación de partículas de planta quiméricas e integración del paso de inactivación en el procedimiento de purificación de partícula de virus. El método de inactivación reproduce el virus incapaz de infectar plantas y la integridad de partículas de planta es conservada.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2752323T3 (es) * 2009-09-18 2020-04-06 Fraunhofer Usa Inc Partículas de tipo virus que comprenden proteínas diana fusionadas a proteínas de revestimiento de virus vegetales
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US11433123B2 (en) 2016-07-21 2022-09-06 Case Western Reserve University Sustained release cowpea mosaic virus or virus-like particle therapeutic constructs for the treatment of cancer
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US11590183B2 (en) 2017-03-10 2023-02-28 Case Western Reserve University Cancer immunotherapy using virus particles
WO2018213587A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Case Western Reserve University Anticancer trail-targeted plant virus particles
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US11390853B2 (en) 2019-04-26 2022-07-19 Case Western Reserve University Freeze dried viral nanoparticle constructs
US11896676B2 (en) 2019-08-07 2024-02-13 Case Western Reserve University Targeting cancer cells and tissue using filamentous plant virus particles

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19923027C2 (de) * 1999-05-19 2002-09-19 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Inaktivierung von Viren
WO2005086667A2 (en) * 2004-02-27 2005-09-22 The Dow Chemical Company High efficiency peptide production in plant cells

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