CN101495137A

CN101495137A - 新植物病毒颗粒及其灭活方法

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Publication number: CN101495137A
Application number: CNA2006800452055A
Authority: CN
Inventors: L·拉索霍娃; J·P·费尔普斯
Original assignee: Dow Global Technologies LLC
Current assignee: Dow Global Technologies LLC
Priority date: 2005-12-02
Filing date: 2006-12-01
Publication date: 2009-07-29
Also published as: ATE466593T1; JP2009524699A; EP1996711A2; KR20080091759A; AU2006351933A1; CA2632245A1; WO2008085147A2; DE602006014215D1; EP1996711B1; US20070128213A1; MX2008007005A; BRPI0619089A2; WO2008085147A3

Abstract

本发明涉及经植物生产的用作疫苗等的植物病毒。更明确地，本发明涉及简单的灭活方法和借此获得的植物病毒颗粒。本文公开的发明提供生产基于在灭活植物病毒样颗粒表面上的衍生自致病体表位展示的安全疫苗的手段和方法。本发明披露了嵌合植物病毒颗粒的灭活和将灭活步骤整合入病毒颗粒的纯化中。灭活方法提供不能感染植物且保留了病毒颗粒完整性的病毒。

Description

新植物病毒颗粒及其灭活方法

政府权利

本发明得到了美国国家卫生研究院资助的基金项目号1U01AI054641-01的部分政府支持。政府拥有本发明的部分权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求申请于2005年12月2日的美国临时申请序列号No.60/742,197的优先权，将其全文引入本文作为参考。

技术领域

本发明通常涉及植物生产的用作疫苗等的植物病毒。更具体地，本发明涉及病毒灭活方法以及作为疫苗等的植物病毒颗粒。

背景技术

疫苗接种能保护个体和整个种群免于传染源的危害。然而，由于从有效抗原的鉴定到对开发的疫苗的安全性的关注的大量原因，开发安全有效的疫苗不总是简单的。在复合(composite)病毒疫苗领域中已经探究了使用病毒做为外源肽载体。这样的疫苗基于是不同动物病毒组分的杂种的嵌合病毒。通常，这样的杂种的主要组分衍生自无害或已经将其无害化的病毒，且次要组分是选择的病原性病毒的抗原组分。例如，可将痘病毒如牛痘或减毒脊髓灰质炎病毒用作其它动物病毒包括人类病毒的免疫原组分的载体。

然而，上面讨论的这样的技术有缺点。这样的疫苗产自培养在其设计和运行是昂贵的细胞培养系统中的病毒。复合病毒方法涉及活的感染动物的病毒的操作，具有突变可能引起具有改变的感染性、抗原性和/或致病性的新型病毒的风险。此外，用作载体的动物病毒能是动物可能已经暴露于其且病毒可能已经产生针对该载体的抗体的病毒。因此，在第二病毒的混合抗原位点诱导免疫反应前，免疫系统能摧毁载体。

已经为哺乳动物病毒灭活使用了大量方法。这些方法包括：紫外线照射、紫外线/补骨脂素(psoralen)照射、戊糖化学药(PentosePharmaceuticals chemicals)、微波、福尔马林、BPL、pH、温度和氯化铵孵育。已经使用了紫外线照射来灭活重组植物病毒。参见例如，Langeveld et al.(2001)“Inactivated Recombinant Plant Virus ProtectsDogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus，”Vaccine19：3661-3670。

涉及产生该颗粒的方法以及该颗粒的用途，特别地用作疫苗的专利包括美国专利No.6,110,466，该专利讨论了含有预设的外源肽作为病毒衣壳蛋白部分的植物病毒的组装颗粒和美国专利No.6,884,623，该专利讨论了在病毒衣壳蛋白中包含外源肽的植物病毒的组装颗粒，其中插入位点优选地游离于位于插入位点两侧的直接的序列重复。

美国专利No.5,602,242涉及用于在异源，优选杆状衣壳的蛋白衣壳内的遗传工程化的病毒序列的衣壳化的重组RNA病毒。该专利也涉及这样的重组病毒的制造和使用，特别是关于带来植物中基因型和表型改变的病毒转染。在Ahlquist et al.(1981)“Complete NucleotideSequence of Brome Mosaic Virus RNA3，”J.Mol.Biol.153：23-38中公开了删除或灭活病毒衣壳蛋白基因的方法。

Burge et al.，“Effect of Heat on Virus Inactivation by Ammonia”，Appl.Environ.Microbiology，Aug 46(2)：446-51，1983讨论了热以及氯化铵对病毒灭活的效果。研究了噬菌体f2和脊髓灰质炎病毒1(包膜的哺乳动物病毒)。发现高于40℃的温度损害了本文试验的病毒。像Burge等人一样，Cramer WN，et al.“Kinetics of virus inactivation by ammonia”，Appl Environ Microbiology，Mar 45(3)：760-5，1983为了灭活病毒，使用在一系列pH值范围内的氯化铵处理污水。再一次地，研究了噬菌体f2和脊髓灰质炎病毒1(CHAT株)。据报告那些试验结果显示，NH₄ ⁺浓度对脊髓灰质炎病毒灭活率的效果远低于对f2的灭活率的效果，假如并非如此。本文讨论了该方法学在污水处理植物作为氯的可能替代的应用，特别是对于肠道病毒群成员。

发明内容

本发明包括通过给予硫酸铵到大于pH 8.0的、选自植物、植物组织、植物细胞或原生质体的植物材料，产生灭活病毒样颗粒(VLP)；孵育植物材料至少十个小时；然后从植物材料收获灭活病毒样颗粒而生产灭活植物病毒的方法。这些方法能包括外源肽整合到病毒中。该病毒能处于非包膜RNA病毒内。灭活VLP能提呈异源生物活性肽。以0.5M到1.0M，通常0.7M浓度给予硫酸铵。pH通常是9.0，且能在室温下孵育植物材料。因为VLP缺少至少部分存在于植物病毒中的RNA，VLP不具有感染性。此外，在接种时它不启动感染并且不能复制。

本发明也包括嵌合植物病毒颗粒的灭活以及将灭活步骤整合到病毒颗粒纯化过程。灭活方法提供了不能感染植物的病毒。保留了病毒颗粒的完整性，同时摧毁了存在于病毒颗粒内的感染性病毒基因组RNA。这些方法能够量化，且能整合到纯化程序中。

本发明也包括通过给予硫酸铵到pH大于8.0的、选自植物、植物组织、植物细胞或原生质体并缺少至少部分存在于植物病毒内的RNA的植物材料；孵育植物材料至少十个小时；并从植物材料收获灭活的不能复制的VLP而产生非感染VLP的方法。

此外，本发明的实施方案也包括疫苗，其中疫苗包括病毒且该病毒包括整合到病毒内的外源肽，且通过包含在大于8.0的pH，将硫酸铵加到选自植物、植物组织、植物细胞或原生质体的植物材料；孵育植物材料至少十个小时；然后从植物材料收获灭活的VLP的方法产生疫苗。当将VLP给予到哺乳动物时，提呈的VLP肽能激发免疫反应。能将该疫苗用于流感病毒、东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitisvirus)、犬细小病毒(Canine parvovirus)或炭疽杆菌(Bacillus anthracis)。此外，该疫苗可以是亚单位疫苗，其中肽是抗原的一部分且该部分是疫苗的有效部分。

附图说明

图1：显示了抽提自活的PA10病毒和灭活的PA10病毒的RNA跑1.2％琼脂糖凝胶，用溴化乙锭染色，说明了活病毒中CPMV基因组RNA1和2以及灭活病毒制备物中的降解的RNA。

图2：显示了PA7E的AIEC色谱图。

图3-5：证明了PA9、PA11和PA18的RNA灭活。

图6：显示了PA1S的5天温度稳定性的SDS-PAGE胶。

图7：显示了通过ELISA检测的CPMV-PA免疫的猴子中的抗-PA抗体。

图8：显示了140天时血清和支气管灌洗中的抗-PA抗体(IgG)。

序列简要说明

SEQ ID NO：1是根据本发明实施例3使用的表位PA1的肽序列。

SEQ ID NO：2是根据本发明实施例3使用的表位PA2的肽序列。

SEQ ID NO：3是根据本发明实施例3使用的表位PA3的肽序列。

SEQ ID NO：4是根据本发明实施例3使用的表位PA3E的肽序列。

SEQ ID NO：5是根据本发明实施例3使用的表位PA4的肽序列。

SEQ ID NO：6是根据本发明实施例3使用的表位PA5的肽序列。

SEQ ID NO：7是根据本发明实施例3使用的表位PA6的肽序列。

SEQ ID NO：8是根据本发明实施例3使用的表位PA7的肽序列。

SEQ ID NO：9是根据本发明实施例3使用的表位PA7E的肽序列。

SEQ ID NO：10是根据本发明实施例3使用的表位PA8的肽序列。

SEQ ID NO：11是根据本发明实施例3使用的表位PA9的肽序列。

SEQ ID NO：12是根据本发明实施例3使用的表位PA10的肽序列。

SEQ ID NO：13是根据本发明实施例3使用的表位PA11的肽序列。

SEQ ID NO：14是根据本发明实施例3使用的表位PA12的肽序列。

SEQ ID NO：15是根据本发明实施例3使用的表位PA13的肽序列。

SEQ ID NO：16是根据本发明实施例3使用的表位PA14的肽序列。

SEQ ID NO：17是根据本发明实施例3使用的表位PA15的肽序列。

SEQ ID NO：18是根据本发明实施例3使用的表位PA16的肽序列。

SEQ ID NO：19是根据本发明实施例3使用的表位PA17的肽序列。

SEQ ID NO：20是根据本发明实施例3使用的表位PA18的肽序列。

SEQ ID NO：21是根据本发明实施例3使用的表位PA19的肽序列。

SEQ ID NO：22是根据本发明实施例3使用的表位PA20的肽序列。

SEQ ID NO：23是本炭疽菌苗的保护性抗原(PA)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24是流感病毒表位M2e的氨基酸序列。

具体实施方式

以下将结合附图和具体实施方案在下文中更完整地描述本发明。然而，可通过许多不同形式具体化本发明，但具体实施方案并非构成限制本发明。

本发明部分涉及用于制备用作疫苗等的新的植物病毒样颗粒的新病毒灭活方法。本文描述了病毒灭活的方法。本发明提供了灭活嵌合植物病毒颗粒并将灭活步骤整合入病毒颗粒纯化程序的实施例。灭活方法提供了不能感染植物的病毒。本发明的实施方案包括基于衍生自致病体的表位在灭活的植物病毒样颗粒表面的表位展示产生安全疫苗的方式(means)和方法。

本发明的实施方案包括灭活病毒以产生缺少病毒的完整感染性基因组的病毒样颗粒(VLPs)的有效和量化的(scalable)程序。这样的实施方案包括使用硫酸铵缓冲液，通常为pH 9时，作为起始抽提缓冲液。管理当局认为硫酸铵无毒且可接受。

本发明的实施方案包括用pH范围为大约9.0的硫酸铵灭活病毒。病毒灭活能通过RNA断裂和降解而发生。病毒颗粒变得可渗透，从而允许铵离子进入病毒。因此，应该在大于8.0的pH值进行用铵离子进行的孵育，因为在这个pH水平病毒发生膨胀，该膨胀打开了它的结构，从而允许小分子通过病毒衣壳渗入。

本发明也提供缺少典型地随其相关的RNA的新RNA病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒包含适当提呈的抗原。

本发明的实施方案包括以无缝方式将颗粒灭活同其它纯化操作整合的方法。这些方法包括例子，其中收集并在抽提缓冲液中匀浆植物组织，其中缓冲液是pH 9的0.7M硫酸铵并在室温孵育大约20个小时。孵育后，颗粒不再对植物具有感染性并且不能在接种时引入感染。在pH 7.0的相同条件下没有灭活病毒，而且更高的温度即40℃似乎损害了病毒结构。

附加的过程步骤和参数

本发明的实施方案也包括在灭活缓冲液中磨碎/匀浆植物材料，在灭活缓冲液中孵育磨碎的浆体以降解病毒基因组RNA，纯化产生的病毒颗粒。可通过在灭活缓冲液中孵育前离心/过滤进一步地澄清磨碎的物质。在孵育后，可通过PEG或通过将硫酸铵的摩尔浓度增加到导致颗粒从溶液中沉淀的水平来沉淀颗粒。通常在灭活步骤后进行缓冲液交换和层析步骤。可在任何点上将灭活步骤整合入纯化程序。例如，在某些程序中，以下述方式将灭活整合入程序中：将CPMV在pH 7的0.7M(NH₄)₂SO₄中结合到HIC柱子

用pH 9的0.7M(NH₄)₂SO₄洗涤结合的CPMV

用pH 9的0.7M(NH₄)₂SO₄洗脱CPMV。可利用下述范围：0.5-1.0M(NH₄)₂SO₄、pH值大于8.0及温度介于10到40℃间。

能用来制备VLPs的病毒的类型和选择

本发明的疫苗能是抗原形式并融合到非-包膜RNA病毒(+、-和/或双链的)的衣壳蛋白。本发明的实施方案包括连同二十面体植物RNA病毒的植物RNA病毒。尽管本文例证的是豇豆花叶病毒，也能将本发明的方法应用到其它类似的病毒。例如，用于根据本发明的某些优选的病毒是：

能将本发明应用到任何RNA植物病毒。为了证明该系统，选择植物病毒豇豆花叶病毒(CPMV)。已知CPMV的三维结构，该结构允许鉴定适于修饰而不破坏颗粒结构的位点。截至目前，已经在高分别率下解决了来源于至少九个植物病毒属和三个亚组2ssRNA卫星病毒的三级和四级结构。在上面的表1中列出了某些这些病毒。

用作载体的例证的一组植物病毒是那些其衣壳蛋白具有β-折叠桶结构的病毒。使用具有β-折叠桶结构的病毒的一个优点是，β-折叠的单条股间的环为外源肽的插入提供了便利的位点。一个或更多个环的修饰能是表达依据本发明的外源肽的一个策略。在衣壳蛋白的其它区域的插入也是可能的，例如在N-末端和/或C-末端中的插入。

所有的具有二十面体对称的已经解决了其结构的植物病毒符合如CPMV例证的八股β-折叠桶折叠，并且这可能代表了在所有的二十面体病毒中的共同的结构。所有的这样的病毒适用于本发明提呈外源肽序列的目的，该提呈能发生在β-折叠桶间的环中和/或N-末端和/和C-末端内。

修饰DNA序列以插入异源或外源序列的方法是本领域公知的。通常将病毒RNA序列转变成全长cDNA转录物并克隆入载体，然后通过在能容忍这样的插入而没有破坏RNA复制、颗粒形成或干扰感染性的区域插入外源DNA片段进行修饰。

豇豆花叶病毒组是一组主要感染豆类的至少十四种植物病毒。它们的基因组由独立地在大约28nm直径的等轴颗粒内壳体化的具有不同长度的单链正义RNA的两个分子组成。由于它们在氯化铯密度梯度离心中行为的结果，将两类核蛋白分别命名为中间(M)和底部(B)组分，在颗粒内的RNA分别命名为M和B RNA。两类颗粒具有相同的蛋白组成，其由每一个大(VP37)和小(VP23)衣壳蛋白的60个拷贝组成。除了核蛋白颗粒外，豇豆花叶病毒制备物还包括可变量的命名为顶部(T)组分的空(仅有蛋白质)衣壳。

在豇豆花叶病毒组的类型成员的情况下，已知豇豆花叶病毒(CPMV)的M和B RNA均被聚腺苷酸化并具有共价连接到其5’末端的小蛋白(VPg)。对其它豇豆花叶病毒的更有限的研究暗示，该组的所有成员的RNA均分享了这些特点。已经将来源于CPMV的两个RNA进行了测序并显示其由3481(M)和5889(B)个核苷酸组成，排除聚腺甘酸尾(van Wezenbeek等人，1983；Lomonossoff和Shanks，1983)。两条RNA均含有单个的长的开放阅读框。通过巨大前体多肽的合成和随后的切割，病毒基因产物的病毒发生。两条RNA均是感染完整植物所必需的。更大的B RNA能在原生质体中独立复制，可是在这个情况下不产生病毒颗粒(Goldbach等人，1980)。该观察以及更早的遗传研究建立了M RNA编码衣壳蛋白以及感染性病毒颗粒的形成依赖于B和M两条病毒基因组RNA的存在的认识。

豇豆花叶病毒科的一个优点是，它们的衣壳包括能被独立操作的每一个具有3个不同β-折叠桶的六十个拷贝。上面所列的所有其它病毒科和属均具有相似的3-维结构但仅有一种类型的β-折叠桶。(例如，在CPMV的情况下，能在小衣壳蛋白(VP23)βB-βC环中脯氨酸23(Pro²³)残基的前面制备外源插入。参见美国专利No.6,884,623。

也能将本发明应用到尚未测定其晶体结构的二十面体植物病毒(包括那些包含β-折叠桶结构的)。在未知其晶体结构的一种病毒和已知其晶体结构的第二病毒间存在衣壳蛋白基因内的显著的序列同一性的地方，对一级结构的比对允许β-链间的待推断的环的单位[参见Dolja，V.V.and Koonin，E.V.(1991)J.Gen.Virol.，72，pp 1481-1486]。此外，在病毒同那些已经测定其晶体结构的病毒仅具有最小的衣壳蛋白序列同一性的地方，可将一级结构比对同适当的二级和三级结构预测算法结合使用来允许潜在的插入位点的定位的测定。

CPMV和菜豆荚斑点病毒(BPMV)显示，BPMV和CPMV的3-D结构非常相似且一般而言是豇豆花叶病毒科的典型。

CPMV包含两种亚基，小的(S)和大的(L)衣壳蛋白，每个病毒颗粒每一种亚基具有60个拷贝。可从同一个病毒粒上的L或S蛋白或从两种衣壳蛋白上表达外源肽序列。

CPMV是由两部分组成的(biparite)RNA病毒。为了操作任何RNA病毒的基因组来表达外源肽，可使用RNA的cDNA克隆。可以获得能将其进行操作以插入编码外源肽的寡核苷酸序列的两种CPMVRNA分子的全长cDNA克隆。能使用来源于植物RNA病毒的基因组的cDNA克隆来体外产生当将其接种到植物上时具有感染性的转录物。

在本发明进一步的方面，构建了CPMV RNA M和B的cDNA克隆，其中M RNA的cDNA克隆含有插入的编码外源肽的寡核苷酸序列，其使用连接到病毒cDNA的5’端的木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子序列，在植物中产生感染性转录物。该技术克服了使用体外产生的转录物时碰到的某些问题并可应用到所有的植物RNA病毒。

其它病毒能包括各种雀麦草花叶病毒组，特别是豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)和南方菜豆花叶病毒组，特别是南方菜豆花叶病毒(SBMV)。也可使用具有三部分的病毒的RNA片段。这样的有用病毒的例子是雀麦花叶病毒科的有三部分的病毒，如雀麦草花叶病毒(BMV)和豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)，其包装在二十面体衣壳内。

BMV的基因组分成信使意义RNA 1、2和3，大小分别是3.2、2.9和2.1kb。从RNA 3形成的亚基因组RNA 4编码衣壳蛋白。为了用BMVRNA 3转染的细胞，BMV RNA 1和2编码的蛋白必须存在。这三个BMV RNA被分别壳体化到相同的颗粒中。每一个颗粒包括180个衣壳蛋白。可修饰衣壳蛋白以携带肽插入物。

已经比较了表1中显示的大量病毒的衣壳蛋白。在美国专利No.6,884,623的图10中解释了二级结构元素和它们的空间组织的相似性。外源表位的插入能使用任何位于β-折叠桶间的环。然而，制备插入使得将增加物暴露在病毒的内部或外部表面并使得不废除衣壳蛋白亚单位的组装和病毒的感染性。通过使用晶体结构显示的单个衣壳蛋白亚单位的结构以及它们彼此之间的相互作用的知识选择特定的环，使得任何插入不太可能干扰病毒组装。通过观察晶体结构然后通过体内试验法来鉴定最好的位点能初步选择准确的插入位点。

因此，为了鉴定被特别暴露在病毒表面并因而是潜在的好插入位点的衣壳蛋白的部分，可检查植物病毒的三维结构。也可检查衣壳蛋白暴露部分的氨基酸序列以寻找断裂α-螺旋结构的氨基酸，因为这些也是潜在的好插入位点。合适的氨基酸的例子是脯氨酸和羟脯氨酸，其在多肽链内打断α-螺旋并创立结构中的刚性扭结或弯曲。衣壳蛋白的N-和C-末端也是有吸引力的插入位点。

抗原和表位的类型

本发明的实施方案包括亚单位类型疫苗的方法；即，提呈的抗原仅代表了已知有效的抗原的片段。这样的疫苗(抗原)比全生物或全蛋白疫苗固有地更安全，因为它们缺少与疾病的感染过程或病理学相关的所有功能性。

本发明的实施方案包括抗炭疽(炭疽杆菌)感染效应的亚单位疫苗的方法。在该炭疽疫苗中，SEQ ID No：23，亚单位抗原代表了衍生自所谓的保护性抗原或PA的大约25个氨基酸的片段。已知该蛋白能有效激发针对炭疽的免疫并是新一代炭疽疫苗的基础。

也生产了犬细小病毒疫苗。参见例如Langeveld et al.(2001)“Inactivated Recombinant Plant Virus Protects Dogs from a LethalChallenge with Canine Parvovirus，”Vaccine 19：3661-3670和Langeveld etal.(1995)“Full Protection in Mink Against Mink Enteritis Virus with NewGeneration Canine Parvovirus Vaccines Based on Synthetic Peptide orRecombinant Protein，”Vaccine 13：1033-1037。已经证明了这些基于病毒颗粒的亚单位疫苗能有效抵抗病毒病原(细小病毒属)并保护动物免受传染源的致命威胁。当前通过用预先工程化的重组病毒RNA或DNA感染植物在植物中生产嵌合颗粒。紧接着接种，重组病毒从细胞到细胞和远距离地传播。这导致植物的系统感染。收集感染的植物组织，抽提、按配方制造嵌合病毒颗粒并将其用作疫苗。根据本发明的实施方案，灭活疫苗候选者以满足环境保护的要求是有利的。

不仅可将本灭活方法应用到展示抗原表位然后将其用作疫苗的颗粒，也可将其应用到展示任何其它有用的肽如靶向肽、抗微生物肽等等的颗粒。也可将该技术应用到野生型或修饰的颗粒，然后将其用于各种部分到颗粒表面的共价连接。这包括包含抗原蛋白、肽、碳水化合物、脂类、核酸、检测剂(如荧光染料)、放射剂、靶向配体等等的蛋白连接。可将颗粒合成物用作疫苗以及用于将相关的因子传递到靶向组织等等。也能在各种试剂如药物、位于颗粒中的用于表达外源基因、毒素等等，然后将其用于壳体化的试剂的给予和传递的外源核酸的壳体化前应用该技术。

包括在能根据本发明进行使用并表达在衣壳表面上的许多肽表位是来源于病毒和细菌病原和癌症的那些，包括来源于流感病毒、东方马脑炎病毒和炭疽杆菌的那些。

可能整合入植物病毒的外源肽(参见例如WO 92/18618)可能具有高度不同的类型。由于外源肽的性质和大小以及将其置于病毒颗粒内或上的位点，可能存在某些限制。肽序列不应干扰修饰的病毒在体内培养时进行组装的能力。在本说明书中，当术语“外源的”应用到肽或编码它的核酸时，其意思是指针对用作载体的植物病毒不是与生俱来的肽或核酸序列。也可将这样的序列可选地描述为外源的或异源的序列。术语“肽”包括小肽和多肽。肽通常包括超过5个氨基酸残基。

能从任何生物上有用的肽形成修饰的病毒颗粒。这样的肽的例子是肽类激素；酶；生长因子；原生动物、病毒、细菌、真菌或动物起源的抗原；包括抗独特性抗体的抗体；免疫调节剂和细胞因子，例如干扰素和白介素；受体；粘附素；和任何上述类型肽的部分或前体。

在提呈在植物病毒载体上的广泛范围的生物活性肽中(例如，与WO 92/18618一致)，特殊的重要性附加到是疫苗，特别地动物(包括人类)病毒和细菌疫苗的基础的抗原肽。应注意，疫苗可能具有预防性的(即疾病预防)或治疗性的(即疾病治疗)应用。对于疫苗应用，提供了特别有吸引力的表位提呈系统。当用于这样的应用时，抗原肽组分将被适当地定位在表达颗粒上以能被免疫系统容易地识别，例如通过在病毒的衣壳蛋白的暴露部分的定位。因此，在本发明的某些实施方案中，提供的是包含衍生自病原，例如动物病毒或细菌病原，整合在植物病毒的衣壳蛋白表面上的暴露位置的抗原的修饰植物病毒的组装颗粒。能将组装的修饰的植物病毒颗粒用作疫苗的免疫原组分。这样的组装的修饰的提呈抗原肽的植物病毒颗粒也具有作为用于检测，例如，动物(包括人类)病原和疾病的免疫诊断试验的抗原提呈组分的应用。

在本发明的实施方案中，在保留抗原的完整性的同时，将抗原VLP灭活和/或使其不具有感染性。因此，这消除了感染性病毒颗粒非期望传送的风险，纵使它们是植物病毒。这极大地减少了调控上的关注。因此，极大地减少了在将它给予被治疗的人或动物后植物病毒到植物的传播和散布。关于能被插入到病毒衣壳蛋白内的外源肽的大小，该系统是高度通用的。因此，根据本发明，能使用包含多达38或更多个氨基酸的肽。

给予方法

给予这些，当前是重组的，病毒的方法包括给予到粘膜的气雾剂。然而，根据本发明，能使用各种给予方法。这些包括可注射的给予(IP、IM、SC)或经皮的、鼻内的或口服的给予。

候选病毒、其衣壳形态学和其中抗原/表位的插入

能在原始病毒衣壳蛋白中的任何合适位置插入编码外源肽的多核苷酸片段，其不干扰病毒复制和感染宿主的能力且其允许在修饰的病毒颗粒上适当地生产和提呈肽。通常，插入外源多核苷酸，因此它被作为衣壳蛋白的部分或与衣壳蛋白融合而被生产。

在体内例如在细菌宿主内或如本领域所公知的在体外制备RNA转录物并使用其来接种合适的植物宿主或植物组织。能以壳体化形式或在溶液中使用RNA，因为壳体化将在宿主生物内发生。可选地，能使用融合到依赖DNA的RNA聚合酶启动子的病毒DNA来启动病毒RNA在植物宿主体内的转录。然后，转录的RNA能启动病毒在植物宿主内的感染。

如将被本领域技术人员所理解的，给定的病毒可能需要最佳的感染性和复制的特殊条件，包括以顺式或反式起作用的基因的存在，当感染植物或植物组织时，其全部将被提呈。例如，对于BMV RNA3的感染性，BMV RNA 1和2的存在是必需的。此外，具有针对给定宿主的必需的宿主特异性基因的病毒的感染能在某些环境中允许通过正常情况下不影响该宿主的第二病毒感染宿主，例如混合的TMV和BMV病毒将感染大麦和烟草，即使BMV单独不感染烟草且TMV单独不感染大麦(Hamilton and Nichols(1977)Phytopathology，67：484-489)。

能在田地和/或温室条件下转染植物。转染通常需要叶片组织的擦伤。可在植物生长周期的任何时间接种植物，优选植物幼小时。病毒的选择和修饰的细节是选择的问题，这依赖于本领域技术人员所知晓和理解的参数。

除了修饰衣壳蛋白外，为了在宿主植物中的表达，也可将其他合适的基因插入原始的病毒基因组。这些包括用于在植物中生产商业有用的肽、蛋白质、药物或任何其他有用的多肽的基因。通常，可将其表达产物在植物细胞中起作用的异源基因插入本文公开的病毒表达系统。

可将修饰的衣壳蛋白本身插入异源病毒的基因组中。为了确保异源衣壳蛋白基因的翻译保真度，假如原始衣壳蛋白的翻译起始ATG密码子未被删除也必需将其进行修饰，且可通过本领域已知的方法完成该修饰，如寡核苷酸直接取代。假如待加载的衣壳蛋白序列具有它自己的翻译起始密码子，必需将该原始蛋白的起始密码子删除或灭活；然而，可选地，可将其保留并用于启动加载的衣壳蛋白序列的翻译，只要因此引入的任何氨基酸序列改变不干扰RNA包装和衣壳形成。

可使用宽范围的易感植物宿主和植物细胞。这些包括任何双子叶植物和单子叶植物、植物的组织以及培养在悬浮培养物中或形成愈合组织的植物细胞。

进一步的程序步骤

为了生产修饰的植物病毒颗粒，可通过引入编码以同编码衣壳蛋白的部分植物病毒基因组融合的外源肽(如动物病毒或细菌抗原)的核苷酸序列，用修饰的病毒核酸感染植物或植物细胞并收集修饰的病毒的组装颗粒修饰植物病毒核酸。然后根据本发明将分离的病毒灭活。

典型地在植物病毒基因组编码衣壳蛋白暴露部分的部分引入编码外源肽的核酸序列。可通过相应于RNA病毒的RNA的cDNA操作实现该操作。在RNA病毒的情况下，为了接种植物细胞，或优选地全植物，通常制备修饰的DNA的RNA转录物，以在收获组装的修饰病毒颗粒前获取增殖阶段。可选地，可在质粒中构建RNA病毒的cDNA克隆，以使病毒衣壳蛋白的5’端编码序列直接融合到在植物宿主中具有活性的启动子的翻译起始位点。可将外源肽最初作为衣壳蛋白的部分而进行表达并借此以完整病毒颗粒的部分而进行生产。因此，可将肽作为想以此进行使用的共轭分子进行生产。可选地，为了允许目标肽从病毒颗粒释放，可应用合适的导致其从病毒颗粒断裂的试剂来设计病毒的遗传修饰。可通过在目标肽两侧插入对酸性水解敏感的氨基酸而完成该释放。例如，可将天冬氨酸-脯氨酸氨基酸工程化使其位于插入肽的两侧且可通过用弱酸处理将插入肽从颗粒上释放。

为了商业规模地生产修饰的病毒，不必为每一批病毒生产制备无效接种剂(DNA或RNA转录物)。可选地，可使用原始的接种剂感染植物；可在植物中扩增产生的修饰病毒来生产全病毒或病毒RNA作为随后的批次的接种剂。

可以各种配置将外源RNA或DNA插入到植物病毒基因组中。例如，可将它以在编码衣壳蛋白的已存在核酸上的加载形式或以编码衣壳蛋白的部分已存在序列的替换的形式进行插入。可通过衣壳蛋白的结构和用其可在没有干扰遗传修饰的病毒在植物中组装成颗粒的能力下制备加载或取代的放松(ease)而部分测定该选择。根据本公开，能在每一种特定情况下通过某些额外的实验获取用于本发明目的的可允许的和最合适的加载或删除的大小的测定。在某些情况下，额外插入物的使用似乎提供了比取代插入物更多的灵活性。

在植物中增殖修饰的病毒能生产显著的产率。如上面表明地，插入的异源核苷酸序列可能包括那些编码易被断裂的氨基酸的序列，因此，在增殖阶段后，能从病毒颗粒分离目标物质。例如，人们能将两条肽插入衣壳蛋白-可将一条用于通过，例如，亲和纯化进行的修饰颗粒的纯化并在纯化后将其断裂；另一条能是保留在颗粒上并用于免疫接种的抗原肽。作为肽的全部断裂的选择，在某些情况下，以其在衣壳的主要部分内保持完整的形式释放是可能的和期望的。

根据本发明的另一方面，可在编码衣壳蛋白的病毒核酸内选择两种不同的限制酶位点且通过使用合适的限制酶可将核酸进行限制性酶切。合成编码期望插入病毒衣壳蛋白内的外源肽的互补寡核苷酸对。寡核苷酸在与限制酶位点一致的末端终止从而允许将其插入限制的病毒核酸。这个操作导致编码外源肽的核苷酸序列引入到衣壳蛋白序列中。

如本文所用，术语“杂种RNA病毒”或“修饰的RNA病毒”指包含衍生自RNA病毒的感染性病毒序列、衍生自另一来源的表位/抗原/肽的多核苷酸片段的重组病毒RNA序列。因此，在灭活前，本发明的杂种的或修饰的病毒RNA是包含衍生自一种RNA病毒的感染性病毒序列和衍生自另一种病毒、细菌或其它来源的表位/抗原/肽的多核苷酸片段的RNA序列。可将术语“杂种RNA病毒粒”或“杂种病毒颗粒”用来指这样的病毒的壳体化形式。一种适于接受插入的编码肽的多核苷酸片段的原始病毒RNA序列是相应于RNA病毒序列的序列的例子。当通过插入或其它方式修饰时，这些序列是“衍生自”原始的/天然发生的病毒序列。

这样的病毒序列必须最少也要具有在宿主内复制的功能和感染宿主的能力。可能需要这样的顺式功能测定或在其它情况下，可能反式提供这样的功能测定。可满足反式复制需要的例子是为了允许BMVRNA 3在宿主中复制对BMV RNA 1和2编码的蛋白的存在的需要。相比较地，某些复制信号必须顺式存在(即直接连接到RNA 3衍生物上)以允许通过在被RNA 1和2诱导的感染细胞内的机制复制RNA 3衍生物。另一个反式功能的例子是为了允许CPMV RNA 2在宿主内复制，需要CPMV RNA 1编码的蛋白。相比较地，某些复制信号必须以顺式存在(即直接连接到RNA 2衍生物上)以允许通过被RNA 1引导的感染细胞内的机制复制RNA2衍生物。

也可期望的是，原始病毒序列具有外源或异源肽编码多核苷酸的合适加载位点。与这些多核苷酸片段和序列有关的术语“外源的”和“异源的”指在原始病毒中未天然存在的序列。相似地，外源或异源肽和多肽本文指加到病毒表达/生产系统的抗原或表位。可将这样的外源多核苷酸或序列在不干扰原始病毒序列的必需功能，即复制和感染宿主的能力的任何位置插入。关于在宿主中的表达，“异源的”或“分离的”多核苷酸是一条在宿主内其被置于的位置为天然存在的多核苷酸。可期望的，异源肽编码片段的放置不干扰原始病毒序列的必需功能。

不必天然发生但可能被修饰的插入核酸片段复合了多于一种编码片段或编码多于一种的肽/多肽。也可通过组合插入和删除修饰RNA以控制修饰的RNA分子的整体长度或其它性质。

插入的外源RNA序列在起源上能是非病毒的或病毒的，且可能本质上对应于RNA或DNA。它们在起源上可能是原核生物的或真核生物的，只要它们处于能被受体细胞的翻译机制直接翻译或在其他方面，它们的功能、结构或调控功能能被识别和利用的形式。

如本领域技术人员公知地，通过提供合适的宿主特异性和复制功能，可用本发明的RNA序列感染任何植物。在合适的构建下，也可将其它的真核生物如可能是单个细胞和组织培养物进行感染。本发明不限于任何给定的宿主种类或RNA病毒类型。

术语“系统感染”指感染通过宿主生物的系统传播以包括多于在原始接种位点上的细胞。不必感染整个的宿主生物；感染可针对某些组织。优选的组织是叶片组织。

当应用到宿主生物时，术语“转染的”指将本发明的病毒序列以能在其中复制的方式整合入生物体的细胞。为了被转染，不必但能是系统感染生物体。然而，本发明不需要病毒的系统传播。

本领域公知启动宿主生物体感染的方法，并且可使用任何合适的方法。优选的植物感染方法是将创伤的植物与含有病毒或病毒RNA的溶液接触以导致病毒在植物中复制或感染植物。

本发明的实施方案能利用植物病毒作为在植物中和通过植物生产疫苗样和其它多肽的载体系统。本发明的一个方面涉及组装的含有预设的外源肽作为病毒衣壳蛋白的部分的植物RNA病毒颗粒，其中通过使用本发明的方法已经消除了RNA或使其不具有感染性。本发明也能包括组装的展示外源肽的植物病毒颗粒，其中内部展示是可能的。本发明也包括缺少感染性RNA的病毒。

当应用到疫苗制备时，本发明具有超过传统疫苗、基于动物病毒或细菌的重组疫苗和肽疫苗的优点，包括：1)降低了生产费用，因为能从感染的植物中获得极高收率的纯病毒，且不需要组织培养生产步骤；2)提高的安全性，因为植物病毒不能感染动物和在动物中复制，因此不能突变成有毒的形式，但传统的和重组动物疫苗可能会产生这种情况；3)像豇豆花叶病毒组一样的罕见的稳定性，能在没有丢失有效性的情况下干燥纯化的制备物并将其存放多年；4)缺少导致增加的免疫原性的肽的共轭，从而在颗粒的表面展示肽；和5)当与体内同源重组(转染)相比时，更小的病毒允许通过体外操作引入嵌合基因。

除非另外指明，如本文所用，术语“a”、“an”和“the”指至少一。

以到不与本说明书的明确教导不一致的程度将本文参考或引用的所有的专利、专利申请、临时专利和出版物的全文引入本文作为参考。

下述内容是解释实施本发明的过程的实施例。不应将这些实施例解释为限制。除非另外指明，所有的百分比是重量百分比，所有的溶剂混合物比例是体积比。

实施例

实施例1-CPMV颗粒灭活的概述

使用该步骤灭活超过16种不同的CPMV颗粒(携带不同的表位)以及野生型CPMV病毒。已经从灭活的病毒分离了RNA并在凝胶上跑胶来测定RNA是否被降解。也将灭活的颗粒接种植物来测试诱导感染的能力。没有接种的植物产生病毒感染。从灭活病毒颗粒分离的RNA在每一个测试的情况中都被降解(参见图1作为例子)

实施例2-CPMV灭活的进一步的例子

设立一个研究来测定0.8M的硫酸铵能否灭活CPMV，同时保留它的完整性。将0.8M的硫酸铵用作本纯化过程的部分。在该过程中的pH的增加渗透化(permealize)病毒，但也会增加游离NH3的浓度。

本研究的结论是，pH 9和pH 7的0.8M的硫酸铵均在22℃和40℃维持了病毒完整性，而且仅仅在pH 9时病毒完整性丢失。对照实验中，在30mM Tris-HCl中在22和40℃下孵育CPMV，产生了完全的感染性CPMV颗粒。从这些结果，可进一步推论，导致灭活所需的是0.8M的硫酸铵和pH 9的组合，而不是单独的温度或硫酸铵。在调整到合适的硫酸铵浓度和pH的磨碎的细胞液上继续进行本研究实验，且关注植物浆料中的化合物导致灭活(例如补骨脂素)。为了证明或反驳这一点，设立第二个研究来测定能否使用硫酸铵和pH 9的组合将纯化的CPMV颗粒灭活。使用各种纯化级别的化学品来测定化学品中某些杂质是否要为灭活负责。设立实验矩阵，且所有测试的条件显示在表2中。使用了0.7M的硫酸铵，因为它是我们再次最佳化的过程的部分，因此，可容易进行整合。

pH 9的浓度为0.5M和0.7M的(NH₄)₂SO₄灭活了CPMV，而pH 9的0.1M的(NH₄)₂SO₄没有灭活。图1显示了抽提自活性的和灭活的病毒的跑1.2％的琼脂糖凝胶并用EtBr染色的RNA。结果显示了在活性病毒内CPMV基因组RNA 1和2以及灭活的病毒制备物中降解的RNA的存在。超过15种嵌合病毒颗粒和野生型病毒已经获得了相同的结果。

实施例3-灭活实验中使用的嵌合CPMV颗粒

工程化嵌合CPMV颗粒以表达衍生自炭疽杆菌保护性抗原(“PA”)蛋白的肽。通过使用美国专利5,874,087、5,958,422和6,110,466公开的方法在CPMV的大和/或小衣壳蛋白上表达该肽。表达了下述肽：

实施例4-在植物中生产嵌合CPMV颗粒

在室温下在湿纸巾中过夜使购自费里-摩尔斯公司序列号1450的豇豆加利福尼亚#5种子发芽。将发芽的种子转到土壤中。发芽后七天，用WT或嵌合CPMV颗粒接种幼苗。在接种后，在25℃、光周期为16小时光8小时黑暗将植物培养两到三周。收集显示了症状的叶片并在纯化前将其在-80℃中冷冻。

实施例5-嵌合CPMV颗粒的灭活和灭活的嵌合CPMV病毒样颗粒的纯化

在-80℃冷冻40g CPMV感染的叶片组织。用手破碎冷冻的叶片组织并将其倒入Waring高速搅拌器、序列号8011S中。将120ml冷的灭活缓冲液(0.5M硫酸铵、0.03M Tris碱pH 9.00、0.2mM PMSF)倒到破碎的叶片上。在高速下将叶片磨2次进行3秒。将溶液轻轻倒入500ml的离心瓶中。用30ml冷的灭活缓冲液洗涤搅拌器并将洗涤物倒入500ml离心瓶。在15,000G下将溶液离心30分钟以去除植物细胞碎片。将上清轻轻倒入刻度量筒并孵育以在室温下将病毒灭活20小时。为了沉淀CPMV病毒，将冷的PEG 6000溶液(20％PEG 6000，1MNaCl)加到上清中使最终的PEG浓度为具有0.2M NaCl的4％PEG6000，然后轻柔地混合溶液。在冰上将溶液沉淀1小时。然后在15,000G下将病毒沉淀溶液离心30分钟来收集CPMV病毒沉淀。倒掉上清并将病毒立即重悬于阴离子交换结合缓冲液(30mM Tris碱、pH 7.50)中。为了进一步纯化病毒样颗粒，通过使用购自Applied Biosystems、序列号为1-2559-11的POROS 50HQ强阴离子交换树脂的阴离子交换色谱将蛋白混合物分级。20倍柱体积梯度是从缓冲液A、30mM Tris碱、pH 6.75到具有1M NaCl的缓冲液B、30mM Tris碱、pH 6.75。用购自Amersham Biosciences、序列号18-1112-41的AKTAexplorer进行层析。图2说明了PA7E的AIEC色谱图。使用本实施例中公开的方法处理列在实施例3中的所有样品，具有相似的结果。检测到两个主要的峰。蓝迹线是在280的吸收度，红迹线是在260的吸收度，绿迹线是缓冲液B的百分比，棕迹线是电导率。在色谱图底部的红色记号是流份。通过使用100kDa截留膜Millipore旋转浓缩器、序列号UFC910096将在梯度上的第一个峰，其含期望的病毒样颗粒缓冲液交换到PBS缓冲液、pH 7.4中。然后将样品保存在-80℃。第二个峰含有断裂的颗粒污染物。用PA7E PEG沉淀物AIEC装载、WT CPMV标准和AIEC PA7E流份制备SDS-PAGE凝胶。在Invitrogen Nupage 4-12％Bis-Tris、12孔胶、序列号NP0322上跑SDS-PAGE。跑胶缓冲液是Invitrogen NupageMES SDS跑胶缓冲液、序列号NP0002。用200V电压降将胶跑胶35分钟。泳道1含有5μl Invitrogen SeeBlue Plus2梯度、序列号LC5925。泳道2含有重悬的装载到AIEC柱子上的PEG沉淀PA7E。泳道3含有WT CPMV。泳道4-8含有相应于AIEC峰1的目标纯化的PA7E颗粒，其被进一步地收集和处理。泳道9-10含有相应于AIEC峰2的断裂的PA7E颗粒污染物。

实施例6-灭活的嵌合CPMV病毒样颗粒-病毒基因组RNA抽提物的分析

使用Ambion RNAqueous、序列号1912试剂盒来从PEG纯化的灭活CPMV样品抽提病毒基因组RNA。将未灭活的CPMV病毒颗粒用作对照(有活性的样品)。图3-5显示了PA9、PA10、PA11、PA12和PA18的RNA灭活结果。通过使用实施例6中公开的方法处理实施例3中列出的所有样品，具有相似的结果。为图1-3使用了购自Invitrogen、序列号G501801的预灌注1.2％E-Gels来可视化抽提的RNA。图3-5中的所有的分子量梯度是1KB增加的分子量梯度、序列号10787-026的1μl上样。在图3中，泳道1是1μl分子量梯度。泳道2是有活性的PA9。泳道3是灭活的PA9。泳道4是分子量梯度。泳道5是有活性的PA10，泳道6是无活性的PA10。泳道7是分子量梯度。在图4中，泳道1是1μl分子量梯度。泳道2是有活性的PA11。泳道3是灭活的PA11。泳道4是分子量梯度。泳道5是有活性的PA12，泳道6是无活性的PA12。泳道7是分子量的梯度。在图5中，泳道1是1μl分子量梯度。泳道2是有活性的PA18。泳道3是灭活的PA18。如通过检测“模糊”表明地，灭活样品中的病毒基因组RNA被降解了，但在未经历灭活的样品中检测到了全长CPMV基因组RNA1和RNA2。

实施例7-通过SDS-PAGE分析灭活的嵌合CPMV病毒样颗粒-稳定性

用SDS-PAGE测定小的和大的衣壳蛋白的稳定性。图6显示了作为例子的PA1S的5天温度稳定性测定的SDS-PAGE凝胶。在InvitrogenNupage 4-12％Bis-Tris、12孔凝胶、序列号NP0322上跑SDS-PAGE。用150V电压降将凝胶跑胶60分钟。跑胶缓冲液是Invitrogen NupageMES SDS跑胶缓冲液、序列号NP0002。泳道1含有7μl InvitrogenBenchmark未染色蛋白分子量梯度、序列号10747-012。泳道2含有在室温下孵育5天的灭活的PA1S病毒颗粒。泳道3含有在4℃孵育5天的灭活的PA1S病毒颗粒。泳道4含有在-20℃孵育5天的灭活的PA1S病毒颗粒。未检测到蛋白降解。

实施例8-通过SEC分析灭活嵌合CPMV病毒样颗粒-稳定性

通过使用分子排阻色谱(SEC)测定组装的病毒样颗粒的完整性。通过使用SEC分析实施例3中所列的所有样品，具有相似的结果。使用的SEC柱是购自Supelco的具有10微米球大小、序列号08023的30cm x 7.8mm Tosoh TskGel G5000分析型SEC柱。SEC的流动相是0.1M的NaPO₄、pH 7.00。检测到相应于组装的病毒颗粒的单个峰。组装的CPMV颗粒从柱子上洗脱，保留时间是14分钟。

实施例9-植物中灭活嵌合CPMV病毒样颗粒感染性的分析

测验了实施例3中所列的灭活嵌合CPMV颗粒感染植物的能力。在室温下在湿纸巾中过夜使购自费里-摩尔斯公司序列号1450的豇豆加利福尼亚#5种子发芽。将发芽的种子转到土壤中。发芽后七天，用灭活的和有活性的WT或嵌合CPMV颗粒接种十株幼苗。在接种后，在25℃、光周期为16小时光8小时黑暗将植物培养两到三周并观察症状的形成。用灭活WT或嵌合CPMV颗粒接种的植物没显示症状，但用有活性WT或嵌合CPMV颗粒接种的植物显示了典型的CPMV感染症状。收集用灭活WT或嵌合CPMV颗粒的接种的叶片并为病毒颗粒分离而进行处理。在-80℃冷冻40g CPMV感染的叶片组织。用手破碎冷冻的叶片组织并将其倒入Waring高速搅拌器、序列号8011S中。将120ml冷的30mM Tris碱、pH 7.50、0.2mM PMSF倒在破碎的叶片上。在高速下将叶片磨2次进行3秒。将溶液轻轻倒入500ml的离心瓶中。用30ml冷的缓冲液洗涤搅拌器并将洗涤物倒入500ml离心瓶。在15,000G下将溶液离心30分钟以去除植物细胞碎片。将上清轻轻倒入刻度量筒。为了沉淀CPMV病毒，将冷的PEG 6000溶液(20％PEG 6000，1M NaCl)加到上清中使最终的PEG浓度为具有0.2M NaCl的4％PEG6000，然后轻柔地混合溶液。在冰上将溶液沉淀1小时。然后在15,000G下将病毒沉淀溶液离心30分钟来收集沉淀中的CPMV病毒。倒掉上清并将病毒立即重悬于PBS缓冲液、pH 7.4中。用SDS-PAGE测定样品中病毒颗粒的存在。在Invitrogen Nupage 4-12％Bis-Tris、12孔胶、序列号NP0322上跑SDS-PAGE。用150V电压降将胶跑胶60分钟。跑胶缓冲液是Invitrogen Nupage MES SDS跑胶缓冲液、序列号NP0002。未检测到病毒颗粒。

实施例10-用含有PA表位的灭活CPMV颗粒免疫小鼠

用100μg纯化的灭活CPMV-PA在存在佐剂下腹腔内注射7周龄雌性Balb/c小鼠三次。对照小鼠接受具有不相关肽或仅处于PBS、pH 7.0内的佐剂的灭活CPMV颗粒。使用了同100μl样品混合的100μl Ribi佐剂(R-700；Ribi Immunochem Research，哈密尔顿，蒙大拿)。给药的总体积是200μl。以3-周间隔给予注射。

为了鼻内免疫，将没有佐剂的灭活CPMV-PA给予到麻醉的小鼠。在两个鼻孔内给予100μl的总体积(每个鼻孔50μl)。对照小鼠接受具有不相关肽或仅PBS、pH 7.0的灭活CPMV。

在第一次给予前1天和在两次随后的给予的每一次后2周获取血样。

下面提供了小鼠免疫研究的概述：

实施例11-用含有PA表位的灭活CPMV颗粒免疫非人灵长类

测验当将含有PA表位的灭活CPMV颗粒给予到恒河猴时其产生针对共表达的炭疽表位的抗体反应的能力。用灭活的CPMV-PA肽构建物肌内免疫四只猴子且一只猴子用灭活的野生型CPMV对照进行肌内免疫。每一免疫剂量由2mg的所有16种PA-CPMV构建物的病毒-肽混合物组成。在第0、7、14和28天免疫接种动物。

通过使用ELISA测定用PA蛋白作为目标监控IgG和IgA抗体。在免疫天数的每一天将三到5ml血吸入肝素中。分离并冷藏保存细胞和血浆。在第0、14和28天将氯胺酮麻醉的猴子进行支气管镜手术并获取和冷冻保藏支气管灌洗样。融化支气管冲洗物和血浆并在ELISA测定中测量IgG和IgA抗体。在血浆和支气管灌洗内均检测到了高滴度的IgG和IgA抗体。结果显示在图7和8。

实施例12-用含有流感病毒表位M2e的灭活CPMV颗粒免疫小鼠

用100μg纯化的表达流感肽M2e的灭活CPMV在存在佐剂下腹腔内注射7周龄雌性Balb/c小鼠三次。序列是SLLTEVETPIRNEGCR--CNDSSD(SEQ ID NO：24)。对照小鼠接受具有不相关肽或仅在PBS、pH 7.0内的佐剂的灭活CPMV颗粒。使用同100μl样品混合的100μlRibi佐剂(R-700；Ribi Immunochem Research，哈密尔顿，蒙大拿)。给予的总体积是200μl。以3-周间隔给予注射。

为了鼻内免疫，将没有佐剂的含有流感肽M2e的灭活CPMV给予到麻醉的小鼠。在两个鼻孔内给予100μl的总体积(每个鼻孔50μl)。对照小鼠接受具有不相关肽或仅PBS、pH7.0的灭活CPMV。

下面提供了小鼠免疫研究的概述：

上述内容说明了本发明，不应解释为对其进行限制。通过下述权利要求确定本发明，在那里具有待总结的权利要求的同等物。

序列表

<110>陶氏环球技术公司

<120>新植物病毒颗粒及其灭活方法

<130>DOW-200P

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>1

Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro

1 5 10 15

Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp

20 25

<210>2

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>2

Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val His

1 5 10 15

Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser

20 25

<210>3

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>3

Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile

1 5 10 15

Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu

20 25

<210>4

<211>26

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>4

Glu Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg

1 5 10 15

Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu

20 25

<210>5

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>5

Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys

1 5 10 15

Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn

20 25

<210>6

<211>21

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>6

Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro

1 5 10 15

Glu Ala Arg His Pro

20

<210>7

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>7

His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn Glu Asp Gln Ser

1 5 10 15

Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg

20 25

<210>8

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>8

Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg

1 5 10 15

Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn

20 25

<210>9

<211>26

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>9

Glu Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser

1 5 10 15

Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn

20 25

<210>10

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>10

His Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser

1 5 10 15

Val Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn

20 25

<210>11

<211>21

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>11

Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser Leu

1 5 10 15

Ala Gly Glu Arg Thr

20

<210>12

<211>18

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>12

Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn

1 5 10 15

Ile Arg

<210>13

<211>24

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>13

Glu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr

1 5 10 15

Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Glu

20

<210>14

<211>24

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>14

Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe

1 5 10 15

Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn

20

<210>15

<211>20

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>15

Ser Glu Val Leu Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe

1 5 10 15

Asn Gly Lys Asp

20

<210>16

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>16

Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn

1 5 10 15

Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys

20 25

<210>17

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>17

Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala

1 5 10 15

Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn

20 25

<210>18

<211>23

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>18

Gln Gly Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr

1 5 10 15

Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln

20

<210>19

<211>20

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>19

Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu

1 5 10 15

Ala His Arg Glu

20

<210>20

<211>25

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>20

Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp

1 5 10 15

Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly

20 25

<210>21

<211>19

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>21

Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile

1 5 10 15

Asp Phe Lys

<210>22

<211>22

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>22

Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser

1 5 10 15

Thr Asn Gly Ile Lys Lys

20

<210>23

<211>764

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>23

Met Lys Lys Arg Lys Val Leu Ile Pro Leu Met Ala Leu Ser Thr Ile

1 5 10 15

Leu Val Ser Ser Thr Gly Asn Leu Glu Val Ile Gln Ala Glu Val Lys

20 25 30

Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser Gln Gly Leu

35 40 45

Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro Met Val Val

50 55 60

Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu Glu

65 70 75 80

Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Ala Ile Trp Ser Gly

85 90 95

Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala Thr Ser Ala

100 105 110

Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val Ile Asn Lys

115 120 125

Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg Leu Tyr Gln

130 135 140

Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys Gly Leu Asp

145 150 155 160

Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu Val Ile Ser

165 170 175

Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser Ser Asn Ser

180 185 190

Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp

195 200 205

Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp

210 215 220

Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His

225 230 235 240

Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser

245 250 255

Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile

260 265 270

Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr

275 280 285

Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn Glu

290 295 300

Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Glu Thr Arg Thr Ile Ser Lys

305 310 315 320

Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn Ala

325 330 335

Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly

340 345 350

Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser

355 360 365

Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala

370 375 380

Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr

385 390 395 400

Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys

405 410 415

Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser Gln

420 425 430

Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile

435 440 445

Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn

450 455 460

Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu Asp

465 470 475 480

Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn Gly

485 490 495

Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro Gln

500 505 510

Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn

515 520 525

Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu

530 535 540

Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe

545 550 555 560

Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile

565 570 575

Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys

580 585 590

Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp

595 600 605

Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg

610 615 620

Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val

625 630 635 640

Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu

645 650 655

Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile

660 665 670

Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg

675 680 685

Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe

690 695 700

Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn

705 710 715 720

Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile

725 730 735

Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys

740 745 750

Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

755 760

<210>24

<211>22

<212>PRT

<213>炭疽杆菌

<400>24

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Gly Cys Arg

1 5 10 15

Cys Asn Asp Ser Ser Asp

20

Claims

1、灭活植物病毒的方法，包括：

pH值大于8.0时，向表达病毒样颗粒的植物材料给予硫酸铵，其中，植物材料选自植物、植物组织、植物细胞或原生质体；

孵育植物材料至少十个小时以生产灭活病毒样颗粒；和

从植物材料收获灭活病毒样颗粒。

2、根据权利要求1所述的方法，进一步包括至少一条整合入病毒的外源肽。

3、根据权利要求1所述的方法，其中所述的病毒是非包膜RNA病毒。

4、根据权利要求1所述的方法，其中所述的灭活病毒样颗粒提呈异源生物活性肽。

5、根据权利要求1所述的方法，其中所述的肽是抗原。

6、根据权利要求1所述的方法，其中所述的肽是表位。

7、根据权利要求1所述的方法，其中以0.5M到1.0M浓度给予硫酸铵。

8、根据权利要求1所述的方法，其中pH是9.0。

9、根据权利要求1的方法，其中在10℃到40℃间孵育植物材料。

10、根据权利要求2所述的方法，其中所述的方法包括在pH7的0.7M(NH₄)₂SO₄中将植物病毒结合到疏水相互作用色谱柱上、用pH9的0.7M(NH₄)₂SO₄洗涤结合的病毒，并用pH9的0.7M(NH₄)₂SO₄洗脱所述病毒。

11、根据权利要求1所述的方法，其中该病毒具有二十面体的衣壳。

12、根据权利要求1所述的方法，其中该病毒是来自选自雀麦花叶病毒科、豇豆花叶病毒科或番茄丛矮病毒科的科的病毒。

13、根据权利要求1所述的方法，其中病毒是来自选自雀麦花叶病毒组、豇豆花叶病毒组、番茄丛矮病毒组、苜蓿花叶病毒组或南方菜豆花叶病毒组的属的病毒。

14、根据权利要求1所述的方法，其中病毒选自豇豆花叶病毒、豇豆褪绿斑驳病毒、番茄丛矮病毒、苜蓿花叶病毒、雀麦草花叶病毒或南方菜豆花叶病毒。

15、根据权利要求1所述的方法，其中病毒包括衣壳蛋白，且肽是融合到衣壳蛋白的抗原。

16、根据权利要求1所述的方法，其中肽选自肽类激素、酶、生长因子、抗体、免疫调节剂或细胞因子。

17、根据权利要求3所述的方法，其中所述方法进一步包括将病毒RNA序列转变成全长cDNA转录物、将所述cDNA克隆入载体和通过在能容忍这样的插入而没有瓦解RNA复制、颗粒形成或感染性的区域内插入外源DNA片段修饰所述cDNA。

18、根据权利要求1所述的方法，其中整合入病毒的外源肽选自流感病毒亚基、东方马脑炎病毒、犬细小病毒或炭疽杆菌。

19、生产非感染性病毒样颗粒的方法，包括：

pH值大于8.0时，向选自植物、植物组织、植物细胞或原生质体且缺少至少一部分存在于植物病毒内的RNA的植物材料给予硫酸铵；

孵育植物材料至少十个小时；和

从植物材料收获灭活病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒不能复制。

20、含有病毒样颗粒的疫苗，其中所述疫苗包括植物病毒，而所述植物病毒包括至少一种整合入该病毒的外源肽，pH值大于8.0时，采用包括向，选自植物、植物组织、植物细胞或原生质体的植物材料给予硫酸铵，生产灭活病毒样颗粒；孵育植物材料至少十个小时；和从植物材料收获灭活病毒样颗粒的方法生产疫苗。

21、根据权利要求20所述的疫苗，其中当将所述病毒样颗粒给予哺乳动物时提呈的VLP肽诱导免疫反应。

22、根据权利要求20所述的疫苗，其中疫苗是为了流感病毒、东方马脑炎病毒、犬细小病毒或炭疽杆菌。

23、根据权利要求20所述的疫苗，其中肽是表位。

24、根据权利要求23所述的疫苗，其中表位是病毒病原体、细菌病原体或癌症。

25、根据权利要求20所述的疫苗，其中所述疫苗是亚单位疫苗，其中所述肽是部分抗原且所述部分作为疫苗是有效的。

26、根据权利要求20所述的疫苗，其中所述外源肽包括SEQ ID NO：23。