CN101611144B - 重组病毒蛋白及颗粒 - Google Patents

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CN101611144B CN2007800516314A CN200780051631A CN101611144B CN 101611144 B CN101611144 B CN 101611144B CN 2007800516314 A CN2007800516314 A CN 2007800516314A CN 200780051631 A CN200780051631 A CN 200780051631A CN 101611144 B CN101611144 B CN 101611144B
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Abstract

本发明公开了编码融合多肽的核酸，所述融合多肽含有竹嵌纹病毒(Bamboomosaic virus)鞘蛋白的序列或其区段；及与载体片段融合的免疫原性异源片段。本发明还公开了相关的嵌合竹嵌纹病毒颗粒、相关的表达载体、相关的宿主细胞及相关的组合物。本发明还公开了制造及使用融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒的方法。

Description

重组病毒蛋白及颗粒
技术领域
本发明公开了编码融合多肽的核酸，该融合多肽含有竹嵌纹病毒(Bamboo mosaic virus)鞘蛋白的序列或其区段；及与载体片段融合的免疫原性异源片段。本发明还公开了相关的嵌合竹嵌纹病毒颗粒、相关的表达载体、相关的宿主细胞及相关的组合物。本发明还公开了制造及使用融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒的方法。 
背景技术
病毒感染对家畜业造成严重损害，譬如口蹄疫病毒(FMDV)经常性的威胁全世界的家畜健康。FMDV属于小核糖核酸病毒科，口蹄疫病毒属。各FMDV颗粒在由四种蛋白质(VP1、VP2、VP3及VP4)各60个拷贝组成的二十面体颗粒内含有单链RNA基因组。VP1、VP2及VP3形成病毒颗粒的外壳，而VP4位于颗粒内(参见Acharya等人，1989Nature 337(6209)：709-716)。疫苗能保护家畜免于FMDV感染。目前的FMDV疫苗以去活化病毒为主，其安全性不令人满意。实际上，FMDV因不当去活化病毒而爆发感染。因此，需要制造安全FMDV疫苗的替代方法。 
发明内容
本发明涉及应用竹嵌纹病毒(Bamboo mosaic virus，BaMV)颗粒或蛋白质为生产免疫原性组合物(诸如，疫苗)之载体的用途。下文所列为全长竹嵌纹病毒鞘蛋白之氨基酸(aa)序列(BaMV CP；SEQ ID NO：1)及编码所述氨基酸序列的核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：2)： 
SEQ ID NO：1： 
MSGAGTGTGRGTGTGVGGTGGTGGTGGGGTGRGQQAAAQPWEAIFTKD
DLAAIEPKPASANVPNTKQWIGIQAGLIKAGATDANFMKVLLGLSLEAFD
RGSSEATTWDGITEGVEHRAAANAIKEANPIHKVTYYLAKPTFAIRQSKNL
PPANFAKKNVPSQYKWCAFDAFDGLYDPTCLASELPYDAPSEIDRMAYAT
FKTIQIKIANDQKGFNLNYNPNVTQARLPNAPLPALPEPTSD
SEQ ID NO：2 
atgtctggagctggaacgggaactgggcgagggaccgggaccggagtaggaggcactgggggcacaggtggc 
acaggcggcggaggaacaggtagagggcaacaagctgcagcccagccctgggaggaatttttactaaggacgac 
ctggccgcaatcgagccaaaacctgcttcggcaaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggact 
catcaaggccggagccacggacgcaaacttctgaaagtactgctcggcctcagtctcgaagctttcgacaggggct 
catcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtggagcaccgtgcagcagccaacgccatcaaggagg 
cgaactgccaatacacaaggtcacctactacctagccaaaccgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccc 
cagcgaacttcgcaaagaagaatgtgccatcacaatataaatggtgtgcgttcgatgctttgatggcctgtacgatcct 
acctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatagaccgaatggcgtacgctaccttcaaaactata 
cagatcaagatcgccaatgaccagaaaggttcaacctcaactacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaac 
gcgcccctaccagctcttcccgaaccaacatcagactaa 
一方面，本发明特征为经分离的融合多肽，其含有(i)含有BaMV CP或其区段的载体片段；及(ii)与载体片段融合且长度至少为3个氨基酸(例如，具有至少5、10、20、30或37个氨基酸)的免疫原性异源片段。除SEQ ID NO：1以外，SEQ ID NO：1的各种片段亦可用作载体片段。实例包括缺乏SEQ IDNO：1氨基末端35个氨基酸的BaMV CP突变体(SEQ ID NO：7；上文加底线者)。优选地，载体片段的氨基末端与异源片段融合。″异源″核酸、基因或蛋白质为起源自不同品种，或若其源自相同品种，则为由其原始形式经实质修饰者。 
上述免疫原性异源片段可含有FMDV VP1蛋白质或其免疫原性区段的序列。下文所示为全长FMDV VP1蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)及编码该氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)： 
SEQ ID NO：3 
TTSAGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDSAFILDRFVKVKPKEQVNV 
LDLMQIPAHTLVGALLRTATYYF SDLELAVKHEGDLTWVPNGAPETALDN 
TTNPTAYHKEPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGS SKYGDTSTNNVRGDLQV 
LAQKAERTLPTSFNFGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAIQPSDARH 
KQRIVAPAKQLL 
SEQ ID NO：4 
Accacctctgcgggtgagtctgcggaccccgtgactgccaccgtcgagaactacggtggtgagacacaagtccag 
aggcgccagcacacggacagtgcgttcatactggacaggttcgtgaaagtcaagccaaaggaacaagttaatgtgtt 
ggacctgatgcagatccctgcccacaccttggtaggggcgctcctgcgaacggccacctactacttctctgacctgg 
agctggccgtcaagcacgagggcgatctcacctgggtcccaaacggcgcccctgagacagcactggacaacacta 
ccaacccaacagcttaccacaaggaacccctcacacggctggcgctgccttacacggctccacaccgtgtcttagc 
gaccgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacaccagcactaacaacgtgagaggtgaccttcaagtgttagct 
cagaaggcagaaagaactctgcctacctccttcaacttcggtgccatcaaggcaactcgtgttactgaactactctaca 
gaatgaagagagccgagacatactgtcccaggccccttctcgccattcaaccgagtgacgctagacacaagcagag 
gattgtggcacccgcaaaacagcttctg 
以FMDV VP1片段为免疫原性异源片段的实例包含含有序列5的免疫原性异源性片段(TVYNGSSKYGDTSTN NVRGDLQVLAQKAERTLPTSFN(SEQ ID NO：5))，序列5相对应于SEQ ID NO：3之氨基酸序列为编码128-164。下文展示例示性融合多肽，即SEQ ID NO：5及7之序列。 
MDTVYNGSSKYGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTLPTSFNAAAQPWEAIF 
TKDDLAAIEPKPASANVPNTKQWIGIQAGLIKAGATDANFMKVLLGLSLE 
AFDRGSSEATTWDGITEGVEHRAAANAIEANCPIHKVTYYLAKPTFAIRQS 
KNLPPANFAKKNVPSQYKWCAFDAFDGLYDPTCLASELPYDAPSEIDRMA 
YATFKTIQIKIANDQKGFNLNYNPNVTQARLPNAPLPALPEPTSD(SEQ ID 
NO：9) 
经分离的多肽是指实质上不含天然相关分子的多肽，以干重计，纯度至少为75％(即，介于75％与100％之间的任何数字，包括端点)。可藉由任何适当标准方法量测纯度，例如藉由柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法或HPLC分析法。本发明经分离的多肽可由天然来源纯化，藉由重组DNA技术或藉由化学方法制造。 
本发明特征亦为经分离的核酸，其含有编码上述融合多肽中之一的序列。核酸的实例包括分别编码SEQ ID NO：1、3、5、7及9的SEQ ID NO：2、4、6、8及10。SEQ ID NO：6、8及10的序列如下所示： 
accgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacaccagcactaacaacgtgagaggtgaccttcaagtgttagctca 
gaaggcagaaagaactctgcctacctccttcaac(SEQ ID NO：6) 
gcggccgcacagccctgggaggcaatttttactaaggacgacctggccgcaatcgagccaaaacctgcttcggcaa 
atgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggactcatcaaggcggagccacggacgcaaacttcatga 
aagtactgctcggcctcagtctcgaagctttcgacaggggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgag 
ggcgtggagcaccgtgcagcagccacgccatcaaggaggcgaactgcccaatacacaaggtcacctactacctag 
ccaaaccgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaacttcgcaaagaagaatgtgccatcacat 
ataaatggtgtgcgttcgatgcctttgatggcctgtacgatcctacctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccc 
tcagaaatagaccgaatggcgtacgctaccttcaaaactatacagacaagatcgccaatgaccagaaagggttcaac 
ctcaactacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaacgcgcccctaccagctcttcccgaaccaacatcaga 
ctaa(SEQ ID NO：8) 
atggacaccgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacaccagcactaacaacgtgagaggtgaccttcaagtgt 
tagctcagaaggcagaaagaactctgcctacctccttcaacgcggccgcacgccctgggaggcaatttttactaagg 
acgacctggccgcaatcgagccaaaacctgcttcggcaaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagct 
ggactcatcaaggccggagccacgacgcaaacttcatgaaagtactgctcggcctcagtctcgaagctttcgacagg 
ggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtggagcaccgtgcagcagccaacgccatcaag 
aggcgaactgcccaatacacaaggtcacctactacctagccaaaccgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctc 
cccccagcgaacttcgcaaagaagaatgtgccatcacaatataaatggttgcgttcgatgcctttgatggcctgtacga 
tcctacctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatagaccgaatggcgtacgctaccttcaaaac 
tatacagatcaagatcgccatgaccagaaagggttcaacctcaactacaaccctaacgtcacccaggctcgactccc 
caacgcgcccctaccagctcttcccgaaccaacatcagactaa(SEQ ID NO：10) 
核酸可进一步含有BaMV开放阅读框架1-4的序列(ORFs 1-4，例如GenBank编号D26017等其它序列)。 
核酸是指DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)或DNA或RNA类似物。可由核苷酸类似物合成DNA或RNA类似物。核酸分子可为单链或双链，但优选为双链DNA。″经分离的核酸″为结构不同于任何天然存在核酸或不同于天然存在基因组核酸之任何片段的核酸。 其包含(a)具有天然存在基因组DNA分子的部分序列但不侧接原本天然侧接于其所存在之个体基因组的该部分序列的编码序列；(b)以使所得分子不同于任何天然存在之载体或基因组DNA的方式，并入原核生物或真核生物载体或基因组DNA中的核酸分子；(c)单独分子，诸如cDNA、基因组片段、由聚合酶链反应(PCR)产生的片段，或限制酶片段；及(d)为杂交基因(即，编码融合蛋白质的基因)之部分的重组核苷酸序列。上文所述核酸可用于表达本发明的多肽。为此，可将核酸与合适调节序列操作性连接以产生表达载体。 
载体是指能够转运所连接之另一核酸的核酸分子。载体能够自主复制或并入宿主DNA中。载体之实例包括质粒、粘粒(cosmid)或病毒载体。本发明的载体包括适于在宿主细胞中表达核酸之形式的核酸。优选地，载体包括与待表达核酸序列操作性连接的一种或多种调节序列。″调节序列″包括启动子、强化子及其它表达控制组件(例如，花椰菜嵌纹病毒35S(cauliflower mosaicvirus 35S)启动子序列或聚腺苷酸化信号)。调节序列包括直接组成性表达核苷酸序列，以及组织特异性调节性及/或诱导性序列。表达载体之设计可视诸如待转形宿主细胞之选择、所要蛋白质之表达程度及其它类似因素而定。可将表达载体引入宿主细胞中以产生本发明之多肽或病毒颗粒。 
含有上述核酸之宿主细胞亦在本发明范畴内。实例包括植物细胞、大肠杆菌细胞(E.coli cells)、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞。例如参见Goeddel，(1990)Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。优选地，宿主细胞为植物细胞，诸如白藜(Chenopodium quinoa)或烟草(Nicotiana benthamiana)的叶细胞。 
为产生本发明的多肽，可在允许表达由本发明核酸编码的多肽的条件下在培养基中培养宿主细胞，且自经培养细胞或细胞培养基纯化多肽。或者，本发明之核酸可使用(例如)T7启动子调节序列及T7聚合酶活体外转录及翻译。 
另一方面，本发明特征为含有上述融合多肽中之一的嵌合竹嵌纹病毒颗粒。为制造此嵌合竹嵌纹病毒颗粒，可使宿主植物的叶片与含有竹嵌纹病毒开放阅读框架1-4之序列的上述核酸接触，将叶片保持在允许形成含有由核酸编码之多肽的病毒颗粒的条件下，且自叶片纯化病毒颗粒。 
本发明之融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒亦可用于产生特异性结合至所关注多肽(例如，FMDV VP1)的特异性抗体。因此，包括融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒的免疫原性组合物在本发明范畴内。为在个体内引发免疫反应，可向有需要的个体施用有效量的融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒。个体可为人类或非人类动物，诸如猪、牛、马、绵羊或山羊。 
下文所附说明书中阐述了本发明的一个或多个实施例之细节。本发明的其它优势、特征及目标将由实施方式及权利要求书而变得显而易见。 
具体实施方式
本发明至少部分基于以下发现：BaMV CP或BaMV颗粒可用作在个体内对所关注多肽产生免疫反应的载体。 
BaMV为马铃薯病毒群(Potexvirus group)之丝状型植物病毒成员，其感染单子叶植物及双子叶植物(Lin等人，Phytopathology 1992；82：731-4)。其基因组由具有5′帽结构及3′聚(A)尾的单链正义RNA分子组成。其含有5个主要开放阅读框架(ORFs)，编码用于病毒复制、移动及组装的不同蛋白质(Lin等人，J.Gen.Virol.1994；75：2513-2518)。其中，ORF5编码鞘蛋白质(CP)，其涉及于病毒包装及细胞间(cell-to-cell)及长距离移动(Lin等人，Phytopathology1992；82：731-4及Lin等人，J.Gen.Virol.1994；75：2513-8)。 
如下的融合多肽在本发明范畴内：其具有与含SEQ ID NO：1或其功能等效物(诸如来自其它BaMV病毒株之CP蛋白质的对应序列)的载体相融合的所需免疫原性多肽。 
SEQ ID NO：1的功能等效物是指衍生自SEQ ID NO：1的多肽，例如具有一个或多个点突变、插入、缺失、截短或其组合之融合多肽或多肽。所有功能等效物实质上具有BaMV的包装活性且不影响病毒复制。此活性可藉由与以下实例中所述相似的标准检定来测定。 
具体而言，该功能等效物包括序列与SEQ ID NO：1的区别为一个或多个保守氨基酸经取代或一个或多个非保守氨基酸经取代、缺失或插入的多肽。下表列出合适的氨基酸取代： 
表1.保守氨基酸置换 
  氨基酸   编码   与以下任一者置换
  丙氨酸   A   Gly、Ala、Cys
  精氨酸   R   Lys、Met、Ile，
  天冬酰氨酸   N   Asp、Glu、Gln，
  天冬氨酸   D   Asn、Glu、Gln
  半胱氨酸   C   Met、Thr
  谷氨酰胺   Q   Asn、Glu、Asp
  谷氨酸   E   Asp、Asn、Gln
  甘氨酸   G   Ala、Pro
  异亮氨酸   I   Val、Leu、Met
  亮氨酸   L   Val、Leu、Met
  离氨酸   K   Arg、Met、Ile
  甲硫氨酸   M   Ile、Leu、Val
  苯丙氨酸   F   Tyr、His、Trp
  脯氨酸   P  
  丝氨酸   S   Thr、Met、Cys
  苏氨酸   T   Ser、Met、Val
  酪氨酸   Y   Phe、His
  缬氨酸   V   Leu、Ile、Met
一般而言，SEQ ID NO：1的功能等效物与SEQ ID NO：1至少50％相同，例如至少60％、70％、80％、90％或95％相同。两个氨基酸序列或两个核酸之″相同性％″使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77，1993中所修正的Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68，1990算法测定。该算法被并入Altschul等人.J.Mol.Biol.215：403-10，1990的NBLAST及XBLAST程序(2.0版)中。可由NBLAST程序，记分＝100，字长-12进行BLAST核苷酸研究以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可由XBLAST程序，记分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质研究以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在间隙时，可如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402，1997所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST及Gapped BLAST程序时，可使用各程序(例如，XBLAST及 NBLAST)的默认参数。 
本发明的融合多肽可由合成多肽或重组多肽获得。为制备重组多肽，可将其编码核酸与编码融合搭配物的另一核酸(例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6x-His抗原表位标签或M13 Gene 3蛋白质)连接。所得融合核酸于合适的宿主细胞中表达融合蛋白质，该融合蛋白质即可藉由本领域中已知的方法分离。经分离的融合蛋白质可藉由(例如)酶切割进一步处理以移除融合搭配物而获得本发明的重组多肽。 
含有上述融合多肽的重组嵌合竹嵌纹病毒颗粒亦在本发明范畴内。该颗粒含有或不含野生型BaMV CP。为制备该颗粒，可将编码上述融合多肽之一的核酸及竹嵌纹病毒ORFs 1-4序列与5′及3′UTR引入合适宿主植物细胞中，且以下文实施例所述的方式产生病毒颗粒。在一个实施例中，融合多肽含有SEQ ID NO：1或7序列。 
可使用本发明融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒在动物(用于产生抗体或治疗疾病)或人类(用于治疗疾病)体内产生抗体。在动物体内制造单克隆抗体及多克隆抗体及其片段之方法是本领域已知的。例如参见Harlow及Lane，(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork。术语″抗体″包括完整分子以及其片段，诸如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv(单链抗体)及dAb(域抗体；Ward等人.(1989)Nature，341，544)。 
一般而言，为制造针对所需蛋白质的抗体，可产生包括蛋白质之免疫原性片段的融合多肽或带有融合多肽的嵌合竹嵌纹病毒颗粒。接着将融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒与佐剂混合，再将混合物注射入宿主动物体内。接着可藉由肽亲和层析法纯化动物体内产生的抗体。通常采用的宿主动物包括家兔、小鼠、天竺鼠及大鼠。可用于增加免疫反应的各种佐剂视宿主种类而定，其包括MONTANIDE ISA 206佐剂、弗氏佐剂(Freund′s adjuvant，完全及不完全)、无机凝胶(诸如氢氧化铝)、CpGODN、表面活性物质(诸如溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔虫戚血蓝蛋白及二硝基酚。适用人类的佐剂包括BCG(卡介苗)及棒状杆菌孢子虫。 
多克隆抗体(抗体分子的异质群体)存在于经免疫个体的血清中。单克隆抗体(结合至本发明多肽的抗体的同质群体)可使用标准杂交瘤技术(例如参见，Kohler等人(1975)Nature 256，495；Kohler等人(1976)Eur.J.Immunol.6， 511；Kohler等人(1976)Eur.J.Immunol.6，292；及Hammerling等人(1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.)制备。详言之，可使用诸如Kohler等人(1975)Nature 256，495及美国专利第4,376,110号所述之藉由所培养连续细胞系(continuous cell lines)制造抗体分子的任何技术；人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人.(1983)Immunol Today 4，72；Cole等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2026)及EBV杂交瘤技术(Cole等人.(1983)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)获得单克隆抗体。该等抗体可为任何免疫球蛋白种类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何子类。可将产生本发明单克隆抗体的杂交瘤于体外或体内培养。在体内产生高效价单克隆抗体的能力使其成为尤其适用的制造方法。 
本发明融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒亦可用于制备免疫原性组合物(例如，疫苗)，该组合物是用于在易受病毒感染之个体内产生针对病毒(例如，FMDV)的抗体。可(例如)根据下文实例所述的方法或藉由本领域已知的任何等效方法制备该组合物。组合物含有有效量的本发明融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒，及诸如磷酸盐缓冲生理食盐水或碳酸氢盐溶液的医药学上可接受的载剂。载剂基于给药模式及途径及标准医药常规进行选择。合适医药载剂及稀释剂以及医药辅料描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences中。若必要，则本发明组合物中亦可包括例如霍乱毒素(cholera toxin)、大肠杆菌不耐热肠毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin，LT)、脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)或免疫刺激序列寡脱氧核苷酸(ISS-ODN)的佐剂。融合多肽、其片段或类似物或嵌合竹嵌纹病毒颗粒可为对抗多种疾病之疫苗的多价组合物的成分。 
制备疫苗的方法一般为本领域所熟知，如美国专利第4,601,903号；第4,599,231号；第4,599,230号；及第4,596,792号所例示。疫苗可制备为可注射液体溶液或乳液。本发明融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒可与生理学上可接受且与之相容的赋形剂混合。赋形剂可包括水、生理食盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合。疫苗可进一步含有微量助剂物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强疫苗效用的佐剂。达成疫苗之佐剂作用的方法包括使用诸如氢氧化铝或磷酸铝(矾)之药剂，通常以0.05至0.1％磷酸盐缓冲生理食盐水溶液形式使用。疫苗可藉由胃肠外施用、皮下注射或肌肉注射。或者，包括栓 剂及口服制剂的其它施用模式可为所要的。对于栓剂而言，粘合剂及载剂可包括(例如)聚烷二醇或甘油三酯。口服制剂可包括通常采用之初始剂(incipient)，诸如医药级之糖类、纤维素、碳酸镁及其类似物。此等组合物为溶液、悬浮液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或散剂形式且含有10-95％融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒。 
疫苗以与剂型相容的方式施用，且以治疗有效、保护及免疫原性之量施用。施用量视待治疗的个体而定，包括(例如)个体免疫系统合成抗体的能力及(若需要)制造细胞介导之免疫反应的能力。需要施用的活性成份的精确量视从业者之判断而定。然而，本领域技术人员可容易地判定本发明多肽的合适剂量范围，且其可为微克级。起始施用及强化给药的合适方案亦可变，但可包括起始施用，接着后续施用。疫苗剂量亦可视给药途径而定，且其可视宿主体型而变。 
如下文实例所述，上述融合多肽或嵌合竹嵌纹病毒颗粒可在个体内引发针对病毒感染(诸如，FMDV感染)的免疫反应。易受FMDV感染之个体经鉴别后可施用本发明组合物。诚如本领域技术人员可判定者，组合物的剂量可视(例如)特定多肽/病毒颗粒、是否与佐剂共施用、共施用的佐剂的类型、给药模式及频率而定。诚如本领域技术人员所能判定者，在必要时可重复给药。举例而言，可以每周间隔初次免疫给药(priming dose)，随后三次强化给药。可在第一次免疫后4至8周给与强化注射，且在8至12周使用相同制剂给与第二次强化。可自受检者取样血清或T细胞，以测量组合物针对FMDV所引发的免疫反应。分析针对蛋白质或感染的抗体或细胞毒性T细胞的方法为本领域中所熟知。可视需要给与其它强化剂(booster)。藉由改变多肽/病毒颗粒之量，组合物剂量及给药频率，可使免疫方案最佳化以引发最大免疫反应。在大范围给药前，需要进行效用测试。在效用测试中，可经由口服或非口服的方式向非人类受检者施用本发明组合物。起始施用后或视情况进行辅助给药后，可藉由皮下注射(例如)0.5mL之1×105TCID50FMDV O/Taiwan/97以挑战测试受检者及对照受检者(接受模拟给药)。接着对受检者监测FMD症状，历时14天。FMD症状包括连续三天高于40℃的高体温，跛行、口周围水泡性损伤及腿部冠状带。 
上述BaMV CP多肽可用作载体，并可与其它目的抗原连接以产生对抗抗原的抗体。多肽片段一般可用于制备对抗病源性细菌(包括包膜细菌)的嵌合分子及共轭组合物。 
下文的具体实施例应仅解释为说明性的，而非以任何方式限制本文公开的其余部分。无需进一步详细描述，相信本领域技术人员可以本文的说明为基础以最充分程度利用本发明。本文引用的所有公开案以引用的方式全部并入本文中。 
实施例1 
在此实施例中，使VP1抗原表位与BaMV经截短鞘蛋白的氨基末端融合产生融合蛋白质。亦产生具有融合蛋白质的嵌合BaMV。 
以Lin等人.J.Gen.Virol.2004；85：251-9所述之方式将具有上游花椰菜嵌纹病毒35S启动子序列之BaMV-S的全长传染性cDNA克隆到质粒pUC119中。载体pBS-d35CP源自上述BaMV cDNA克隆(clone)，其中编码CP的N-末端35氨基酸序列的序列缺失，且藉由基于聚合酶链反应(PCR)的方法插入多克隆位点(AgeI-NheI-NotI)。使用质粒pVP1/Q15作为模板，藉由PCR将编码FMDV VP1(O/Taiwan/97)中氨基酸128-164的序列插入至pBS-d35CP(Wang等人，Vaccine 2003；21：3721-9.)。所用的引物为pr128164N(5′-GGgctagcAccatgg-ACACCGTCTACAACGGGAG-3′(SEQ ID No.11)；该序列在有些情况下被视为NheI及NcoI位点；NcoI识别序列提供AUG起始密码子)及pr128164C(5′-TTgcggccgc-GTTGAAGGAGGTAGGC-3′(SEQ ID No.12)；该序列在有些情况下被视为NotI位点)。PCR反应在94℃的起始温度下进行5分钟，随后在94℃下历时30秒，在50℃下历时30秒及在72℃下延长历时30秒，循环25次。将对应于VP1抗原表位的扩增片段纯化且将其克隆入质粒pBS-d35CP的NheI及NotI位点以产生pBVP1质粒。此载体编码嵌合BaMV的基因组，亦即BVP1。 
为检验此嵌合病毒对植物之传染性，以全身性宿主烟草(N.benthamiana)及局部病斑宿主白藜(C.quinoa)进行测试。 
局部病斑宿主白藜及全身性宿主烟草植物生长于暴露在日光中的温室中。对于传染性的检定而言，将约1μg纯pBVP1DNA溶于10μl体积的双蒸馏H2O中，并接种于在6片叶阶段测试植物的各叶片(Lin等人，J.Gen.Virol.2004；85：251-9)。在接种10天后进行对局部病斑的观测。对于抗原制备而言， 使用来自被BaMV-S或BVP1感染的白藜植物的叶片萃取液接种具有8至10片完全扩展叶片的白藜植物。在接种第10天后采集经接种的叶片。随后以Lin等人.Phytopathology，1992；82：731-4所述的方式自新鲜叶片纯化病毒粒子。藉由紫外线吸收测定经纯化病毒之产率(假定每毫克(mg)病毒吸收率(0.1％，260nm)为3.0)。嵌合病毒BVP1中表达VP1抗原表位的量经估算为总病毒重量的约14.3％。将经纯化病毒粒子溶解于BE缓冲液(10mM Borate，pH 9.0，1mM EDTA)中，且接着在-20℃下储存以用于免疫猪只。 
结果发现，BVP1感染的烟草之嵌纹症状比BaMV-S感染之烟草轻微。在白藜中，由BVP1形成的萎黄局部病斑与野生型BaMV-S引起的坏死性局部病斑不同。然而，结果显示嵌合突变病毒的确具有感染健康烟草或白藜植物的能力。 
实施例2 
上述嵌合病毒BVP1经检验以测定其是否能表达VP1抗原表位。将白藜叶片分别以模拟对照组、野生型BaMV-S、BS-d35CP及BVP1接种，分离上述白藜叶片的总蛋白质并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 
结果发现，来自BVP1的嵌合CP的移动比野生型CP或N-末端截短的CP的移动慢，而在模拟接种的叶片中未发现CP。结果显示野生型与嵌合BVP1的CP在大小上有明显差异，且VP1抗原表位与BVP1的CP融合。 
为进一步确认BVP1的CP含有VP1抗原表位，使用家兔抗FMDV VP1血清或来自FMDV感染猪的血清进行Western印记检定。家兔抗FMDV VP1血清是根据Wang等人，2003，Vaccine 2003；21：3721-9所述的方式制备。来自FMDV猪的血清购自Animal Health Research Institute，COA，R.O.C。总蛋白质是利用1∶2(重量/体积)萃取缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM KCl，10mM MgCl2，1mM EDTA，20％甘油及2％SDS)，由以仿真对照组或病毒接种的白藜所萃取，且在100℃下加热5分钟。接着将蛋白质样本藉由12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离且在4℃下以200mA电泳转移至Immobilon-P膜(Bio-Rad)，历时1小时。以脱脂奶粉蛋白封闭(blocking)后，将膜以抗BaMV-SCP或抗FMDV VP1抗体探测(Lin等人，Phytopathology 1992；82：731-4及Lin等人，J.Gen.Virol.2004；85：251-9)。 
发现两血清均识别出对应于嵌合CP的蛋白质带，其预期之大小为31kDa。相反的，在BaMV-S的野生型CP或BS-d35CP的截短CP中未侦测到VP1蛋白质带。其它免疫印记研究显示，即使BVP1在白藜经过5个连续继代(passage)之后，自白藜叶片提取的BVP1的CP仍含有相同的主要蛋白质带。总之，此等结果显示嵌合病毒BVP1能在其CP中以融合蛋白质形式稳定表达FMDV的VP1抗原表位。 
实施例3 
对上述BVP1嵌合病毒测试其在猪体内引发特异性抗体的能力。 
将嵌合BVP1病毒颗粒自BVP1感染的白藜叶片组织分离。纯化病毒的产率为约0.2-0.5毫克/克新鲜叶片组织。无特定病原体(SPF)雌性或阉割雄性猪(2个月龄，体重约为25kg)购自台湾。藉由肌肉注射，分别以5mg及10mgBVP1嵌合病毒制剂免疫两组SPF猪(每组3只)。具体而言，在除了耳朵以外之颈部肌肉以10mg或5mg BVP1病毒粒子(经等体积Montanide ISA 206佐剂(Seppic，France)乳化)注射。此外，两只猪注射野生型病毒BaMV-S，另外两只猪注射无菌磷酸盐缓冲的生理食盐水缓冲液(PBS；140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.3)作为负对照组。 
于所有猪经初次免疫(priming)6周后，再对所有猪进行相同剂量之强化(boosting)注射。于第0天、第28天、第42天、第56天及第63天自经免疫猪收集血清进行分析。强化剂注射3周后，将0.5mL 1×105TCID50的FMDVO/Taiwan/97注射入猪右前足跟，以感染所有猪只。接着监测猪只FMD症状，历时14天。FMD之症状包括连续3天高于40℃之高体温、跛行、口周围水泡性损伤及腿部冠状带(Wang等人，Vaccine 2003；21：3721-9)。 
为检验免疫作用，以Shieh等人(Vaccine 2001；19：4002-10)所述方法作微小修正后的方式进行ELISA。简而言之，在形成培养盘结合抗原抗体复合物后，将培养盘以含有0.1％Tween-20的PBS(PBST)洗涤3次，且在37℃下与生物素标记的山羊抗猪IgG抗体反应1小时。随后洗涤培养板且添加抗生蛋白链菌素(streptavidin)：过氧化酶(1∶3000倍稀释)。在室温下反应1小时后，将培养板再次洗涤。接着添加酶底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Sigma)，且在室温下使反应进行10分钟。最后，添加等体积的1N H2SO4以使反应停止，且 藉由ELISA读取器量测450nm下的吸光率。 
ELISA显示于初次免疫4周后，经免疫猪引发显著抗-VPl抗体的效价(对5mg组而言为880±434且对于10mg组而言为2382±1098)。且特异性抗-VP1抗体含量增加，并在2周后达到平稳状态。相反地，ELISA结果显示注射野生型病毒BaMV-S或PBS缓冲液的猪仅产生少量抗-VP1抗体。此结果显示嵌合BVP1病毒在猪体内会诱发特异性抗-VP1抗体。 
根据Shieh等人(Vaccine 2001；19：4002-10)所述的方法确认经BVP1免疫的猪血清中存在中和抗体(NA)。简而言之，将来自测试动物的血清在56℃下去活化30分钟。在96孔组织培养板各列之末端孔中添加各血清样本或对照血清(50μl)，且接着整个培养板以2倍连续稀释率来稀释。于各孔中添加50μl 100 TCID50病毒悬浮液，且接着使培养盘震荡1分钟。在37℃下在5％CO2中培育90分钟后，于各孔中添加100μl悬浮于含有3％胎牛血清(FBS)的Eagle′s MEM中之BHK-21细胞悬浮液(每毫升106细胞)，且培育48小时。接着在显微镜下观测细胞。孔中细胞单层的破坏及细胞由纺锤形至圆形之变化显示病毒之细胞病变效应。 
在湿度饱和、5％CO2及37℃下培育48小时后测定效价，且该效价以50％终点中和病毒之细胞病变效应的血清最终稀释率之倒数表示。结果概述于下表2中： 
表2经BVP1免疫之猪体内中和抗体(NA)的效价 
Figure RE-G2007800516314D00141
a将猪以6周间隔使用乳化于等量ISA206佐剂中的10mg或5mg BVP1或5mg BaMV-S病毒粒子进行两次肌肉内注射接种。将以PBS缓冲液免疫的猪用作负对照组。 
b如材料及方法中所述，对各猪的NA效价以造成测试病毒活性减少 50％的血清最终稀释率之倒数表示。(-)表示未侦测到NA。 
cWPP：初次免疫后的周数。 
如表2中所示，经野生型BaMV-S病毒或PBS缓冲液免疫的猪未产生任何针对FMDV之NA。与此相反，经5mg或10mg BVP1免疫的猪在初次免疫4周后产生NA。甚至在初次免疫6周后效价亦增加。然而，在初次免疫6周后以类似量的BVP1加强注射未显著增加NA。此结果显示将猪以BVP1病毒接种一次即足以引起高含量的针对FMDV之NA。 
实例4 
在上述猪体内分析外周血单核细胞(PBMC)产生IFN-γ的能力以评估BVP1免疫除体液反应外是否能引发细胞性免疫反应。IFN-γ为在细胞性免疫反应中起关键作用的细胞因子(cytokine)。 
具体而言，自测试猪分离PBMC，且在6孔培养板中以每孔1×107个细胞(于含有10％FBS及1％青霉素(penicillin)及链霉素(streptomycin)的2mLDMEM培养基中)的浓度接种，一式三份。培养过夜后，在37℃下及5％CO2中将细胞与5μg/mL重组VP1(rVP1)或1μg/mL植物性凝血球素(phytohemagglutinins，PHA，Sigma)培育6小时。将以PHA培育的细胞用作正对照。培育后，将细胞溶解于TRIzolTM试剂(Invitrogen)中，且根据制造商说明分离细胞总RNA。细胞总RNA之浓度藉由在260nm下测定光学密度来定量。接着藉由SuperScript IIITM反转录酶(Invitrogen)将细胞总RNA反转录为互补DNA(cDNA)。将所得cDNA进行实时PCR。 
藉由实时PCR定量全部IFN-γmRNA。实时PCR是利用在LightCycler仪器(RocheApplied Science)中的SYBR Green系统与FastStart DNA MasterSYBR Green I试剂盒(Roche)构成的，其最终体积为20μL(其中包括可热活化的Taq聚合酶、4mM MgCl2、浓度各为0.5μM之引物(引物序列为SW-IFNγ(F4)：5′-GCTCTGGGAAACTGAATGACTTCG(SEQ ID No.13)及SW-IFNγ(R4)：5′-GACTTCTCTTCCGCTTTCTTAGGTTAG(SEQ ID No.14))及2μL以如上文所述方法制备之cDNA)。聚合酶活化(95℃，10分钟)后，进行40次循环之95℃下变性15秒，60℃下退火2秒及72℃下延长15秒。所有步骤的温度转移率为每秒20℃。PCR产物的量藉由侦测SYBR Green I与扩增产物结合所产生的荧光来测量，在每次循环中在72℃培育(延长步骤)后立即量测一次。以LightCycler软件3.0版(RocheApplied Science)分析发光曲线。引物是由Invitrogen Life Technology公司合成。对于各样本而言，藉由与标准曲线比较且藉由使用β-肌动蛋白作为内源参照标准化来测定IFN-γ之量。所有样本处理均一式三份。 
发现经由BVP1免疫之猪产生的PBMC在藉由重组VP1(rVP1)刺激后，其IFN-γ增加3倍。相反的，由经BaMV-S免疫或注射PBS之猪产生的PBMC，其IFN-γ表达量在rVP1刺激后并未增加。作为对照组，来自所有猪之PBMC在经PHA刺激后产生类似量之IFN-γ。此等结果显示经BVP1免疫之猪的免疫细胞能在rVP1刺激时产生IFN-γ。 
实例5 
为测定BVP1免疫的功效，在强化注射三周后，以1×105TCID50的FMDV(O/Taiwan/97)挑战接种或未接种BVP1的猪，且接着监测FMD症状历时2周。将无症状者判定为受到保护。结果概述于下表3中： 
表3.重组病毒BVP1于猪体内抵抗FMDV挑战之保护 
Figure 941342DEST_PATH_G60081392150138000D000041
如表3中所示，经5mg或10mg BVP1免疫的猪无症状且在挑战后两周期间完全受保护。相反的，经BaMV-S免疫或注射PBS(负对照)的猪在FMDV挑战后第二天出现严重FMD症状。此结果显示嵌合病毒BVP1适合用作猪对抗FMDV的疫苗。 
已知以大肠杆菌产生的rVP1对猪进行免疫可有效保护猪免于FMDV挑战。比较BVP1及类似量大肠杆菌产生的rVP1的功效。具体而言，以Wang等人(Vaccine 2003；21：3721-9)所述的方式，以6周间隔将猪以乳化于等体积ISA206佐剂中的8mg或4mg rVP1两次肌肉内注射接种。以上述相同方式评估rVP1引发中和抗体(NA)的作用及对抗FMDV的保护。结果概述于下表4中： 
表4.rVP1免疫作用 
a：如材料及方法中所述，各猪的NA效价以造成测试病毒活性减少50％的血清最终稀释率之倒数表示。(-)表示NA不存在。 
如表4中所示，rVP1使所有经免疫猪受到完全保护。但是，在一些(而非所有)经免疫猪体内产生NA。同样，由rVP1引发的平均NA不如BVP1免疫引发的平均NA高(参见表2及4)。结果显示表达37-aa VP1片段的BVP1引发体液免疫反应的效果比大肠杆菌产生的全长rVP1好。 
先前，源于大肠杆菌的重组VP1(rVP1)(26kDa多肽)经纯化，其在猪体内可引发保护性免疫性。与上文所述组合物相比，rVP1在一些(而非所有)经免疫猪体内引发中和抗体。由rVP1引发的平均中和抗体效价不如BVP1引发的平均中和抗体效价高(参见表2及4)。BVP1(仅含有VP1的37个氨基酸及BaMV CP)产生优于rVP1的中和抗体反应。缺乏N末端至少35个氨基酸残基的BVP1 CP突变体仍可形成能感染全身性宿主(烟草)及局部病斑宿主(白藜)植物之病毒。 
上述结果显示，由于BaMV有容纳及有效表达外源肽的灵活性，本文所述的BaMV表达载体系统及嵌合病毒可有效产生中和抗体。此外，BaMV具有优于其它植物病毒之其它优势。举例而言，因为未发现BaMV在自然界的传播媒介，所以BaMV较安全(Lin等人.Phytopathology 1992；82：731-4)。相反的，许多植物病毒对于多数作物而言为病原体。同样的，作为载体之BaMV具有容纳较长异源多肽的较大能力。 
其它实施例 
本说明书中所揭示之所有特征可以任何组合形式组合。本说明书中所揭示之各特征可用于相同、等效或类似目的之替代特征置换。因此，除非另外明确说明，否则所揭示之各特征仅为等效或类似特征之一般系列的实例。 
本领域技术人员自上述说明可容易地确定本发明之基本特征，且不悖离其精神及范畴之状况下可对本发明作出各种改变及修正以使其适于各种用途及条件。因此，其它实施例亦在以下权利要求书的范畴内。 
Figure IYZ000006008139100031
Figure IYZ000006008139100041
Figure IYZ000006008139100051
Figure IYZ000006008139100061

Claims (30)

1.一种编码融合多肽的经分离核酸，其中该融合多肽由以下组成：
SEQ ID NO：7的载体片段；和
与该载体片段融合且长度为至少10个氨基酸的免疫原性异源片段；
其中，所述融合多肽引发针对所述免疫原性异源片段的免疫反应。
2.如权利要求1所述的核酸，其中所述免疫原性异源片段含有口蹄疫病毒VP 1蛋白质的免疫原性区段。
3.如权利要求2所述的核酸，其中所述口蹄疫病毒VP1是SEQ ID NO：3。
4.如权利要求2所述的核酸，其中所述免疫原性区段含有SEQ ID NO：5。
5.如权利要求1所述的核酸，其中所述异源片段与该载体片段的氨基末端融合。
6.如权利要求1所述的核酸，其中所述免疫原性异源片段长度为37个氨基酸。
7.如权利要求1所述的核酸，其中所述融合多肽的序列为SEQ ID NO：9。
8.如权利要求1所述的核酸，其中所述核酸进一步包含序列竹嵌纹病毒开放阅读框架1-4。
9.一种由权利要求1所述的核酸编码的经分离多肽。
10.一种包含如权利要求1所述的核酸的表达载体。
11.一种包含如权利要求1所述的核酸的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其中所述植物为白藜(Chenopodium quinoa)或烟草(Nicotiana benthamiana)。
14.如权利要求12所述的宿主细胞，其中所述细胞为叶片细胞。
15.一种制造融合多肽的方法，其包含在允许表达由核酸编码的多肽的条件下，将权利要求11-14中任一项所述的细胞在培养基中培养，且自经培养细胞或培养基纯化所述多肽。
16.一种嵌合竹嵌纹病毒颗粒，其包含权利要求1的核酸编码的融合多肽。
17.一种制造嵌合竹嵌纹病毒颗粒的方法，其包含：
提供权利要求8的核酸；
使所述核酸与宿主植物的叶片接触；
将所述叶片保持于允许形成具有由所述核酸编码的多肽的病毒颗粒的条件下，和
自所述叶片纯化所述病毒颗粒。
18.一种免疫原性组合物，其包含权利要求9的融合多肽。
19.一种免疫原性组合物，其包含权利要求16的嵌合竹嵌纹病毒颗粒。
20.如权利要求18或19所述的免疫原性组合物，其用于在人体内引发免疫反应。
21.如权利要求18或19所述的免疫原性组合物，其用于在非人类动物体内引发免疫反应。
22.如权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述非人类动物为猪。
23.权利要求9所述的融合多肽的用途，其用于制造在个体内引发免疫反应的药物。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述个体为人类。
25.如权利要求23所述的用途，其中所述个体为非人类动物。
26.如权利要求25所述的用途，其中所述非人类动物为猪。
27.权利要求16的嵌合竹嵌纹病毒颗粒的用途，其用于制造在个体内引发免疫反应的药物。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述个体为人类。
29.如权利要求27所述的用途，其中所述个体为非人类动物。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述非人类动物为猪。
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