TWI412588B - 重組病毒蛋白及顆粒 - Google Patents

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TWI412588B
TWI412588B TW096151519A TW96151519A TWI412588B TW I412588 B TWI412588 B TW I412588B TW 096151519 A TW096151519 A TW 096151519A TW 96151519 A TW96151519 A TW 96151519A TW I412588 B TWI412588 B TW I412588B
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Description

重組病毒蛋白及顆粒
本發明揭示編碼融合多肽的核酸，該等融合多肽含有竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus )鞘蛋白之序列或其區段；及與載體片段融合之免疫原性異源片段。本發明亦揭示相關之嵌合竹嵌紋病毒顆粒、相關之表現載體、相關之宿主細胞及相關之組合物。本發明亦揭示製造及使用融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒之方法。
病毒感染對家畜業造成嚴重損害，譬如口蹄疫病毒(FMDV)經常性的威脅全世界的家畜健康。FMDV屬於小核糖核酸病毒科之口蹄疫病毒屬。各FMDV顆粒在由四種蛋白質(VP1、VP2、VP3及VP4)各60個複本組成之二十面體顆粒內含有單股RNA基因組。VP1、VP2及VP3形成病毒顆粒之殼，而VP4位於顆粒內(參見Acharya等人，1989Nature337(6209)：709-716)。疫苗能保護家畜免於FMDV感染。目前的FMDV疫苗以去活化病毒為主，其安全性不令人滿意。實際上，FMDV因不當去活化病毒而爆發感染。因此，需要製造安全FMDV疫苗之替代方法。
本發明係關於應用竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus , BaMV)顆粒或蛋白質為生產免疫原性組合物(諸如，疫苗)之載體的用途。下文所列為全長竹嵌紋病毒鞘蛋白之胺基酸(amino acid)序列(BaMV CP；SEQ ID NO：1)及編碼其之 核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：2)：
SEQ ID NO：1：MSGAGTGTGRGTGTGVGGTGGTGGTGGGGTGRGQQAAAQPWEAIFTKDDLAAIEPKPAS ANVPNTKQWIGIQAGLIKAGATDONFMKVLLGLSLEAFDRGSSEATTWDGITEGVEHRA AANAIKEANPIHKVTYYLAKPTFAIRQSKNLPPANFAKKNVPSQYKWCAFDAFDGLYDP TCLASELPYDAPSEIDRMAYATFKTIQIKIANDQKGFNLNYNPNVTQARLPNAPLPALP EPTSD
SEQ ID NO：2atgtctggagctggaacgggaactgggcgagggaccgggaccggagtaggaggcactgg gggcacaggtggcacaggcggcggaggaacaggtagagggcaacaagctgcagcccagc cctgggaggaatttttactaaggacgacctggccgcaatcgagccaaaacctgcttcgg caaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggactcatcaaggccgga gccacggacgcaaacttctgaaagtactgctcggcctcagtctcgaagctttcgacagg ggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtggagcaccgtgcagc agccaacgccatcaaggaggcgaactgccaatacacaaggtcacctactacctagccaa accgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaacttcgcaaagaaga atgtgccatcacaatataaatggtgtgcgttcgatgctttgatggcctgtacgatccta cctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatagaccgaatggcgtac gctaccttcaaaactatacagatcaagatcgccaatgaccagaaaggttcaacctcaac tacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaacgcgcccctaccagctcttcccga accaacatcagactaa
本發明特徵為經分離之融合多肽，其含有(i)含有BaMV CP或其區段之載體片段；及(ii)與載體片段融合且長度至少為3胺基酸(例如，具有至少5、10、20、30或37胺基酸)之免疫原性異源片段。除SEQ ID NO：1以外，SEQ ID NO：1之各種片段亦可用作載體片段。
實例包括缺乏SEQ ID NO：1胺基末端35胺基酸之BaMV CP突變體(SEQ ID NO：7；上文加底線者)。較佳者，載體片段之胺基末端與異源片段融合。"異源"核酸、基因或蛋白質為起源自外來品種者，或若其源自相同品種，則係由 其原始形式經實質修飾者。
上述免疫原性異源片段可含有FMDV VP1蛋白質之序列或其免疫原性區段。下文所示為全長FMDV VP1蛋白質之胺基酸序列(SEQ ID NO：3)及編碼其之核苷酸序列(SEQ ID NO：4)：
SEQ ID NO：3TTSAGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDSAFILDRFVKVKPKEQVNVLDLMQIPAH TLVGALLRTATYYFSDLELAVKHEGDLTWVPNGAPETALDNTTNPTAYHKEPLTRLALP YTAPHRVLATVYNGSSKYGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTLPTSFNFGAIKATRVTELL YPMKPAETYCPRPLLAIQPSDARHKQRIVAPAKQLL
SEQ ID NO：4Accacctctgcgggtgagtctgcggaccccgtgactgccaccgtcgagaactacggtgg tgagacacaagtccagaggcgccagcacacggacagtgcgttcatactggacaggttcg tgaaagtcaagccaaaggaacaagttaatgtgttggacctgatgcagatccctgcccac accttggtaggggcgctcctgcgaacggccacctactacttctctgacctggagctggc cgtcaagcacgagggcgatctcacctgggtcccaaacggcgcccctgagacagcactgg acaacactaccaacccaacagcttaccacaaggaacccctcacacggctggcgctgcct tacacggctccacaccgtgtcttagcgaccgtctacaacgggagcagtaagtacggtga caccagcactaacaacgtgagaggtgaccttcaagtgttagctcagaaggcagaaagaa ctctgcctacctccttcaacttcggtgccatcaaggcaactcgtgttactgaactactc tacagaatgaagagagccgagacatactgtcccaggccccttctcgccattcaaccgag tgacgctagacacaagcagaggattgtggcacccgcaaaacagcttctg
以FMDV VP1片段為免疫原性異源片段之實例包含含有序列5的免疫原性異源性片段(TVYNGSSKYGDTSTN NVRGDLQVLAQKAERTLPTSFN(SEQ ID NO：5))，序列5相對應於SEQ ID NO：3之胺基酸序列為編碼128-164。下文展示例示性融合多肽，即SEQ ID NO：5及7之序列。
MDTVYNGSSKYGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTLPTSFNAAAQPWEAIFTKDDLAAIEP KPASANVPNTKQWIGIQAGLIKAGATDANFMKVLLGLSLEAFDRGSSEATTWDGITEGV EHRAAANAIEANCPIHKVTYYLAKPTFAIRQSKNLPPANFAKKNVPSQYKWCAFDAFDG LYDPTCLASELPYDAPSEIDRMAYATFKTIQIKIANDQKGFNLNYNPNVTQARLPNAPL PALPEPTSD(SEQ ID NO：9)
經分離之多肽係指實質上不含天然相關分子之多肽，亦即以乾重計，純度至少為75%(亦即，介於75%與100%之間的任何數字，包括端點)。可藉由任何適當標準方法量測純度，例如藉由管柱層析法、聚丙烯醯胺凝膠電泳法或HPLC分析法。本發明之經分離之多肽可由天然來源純化，藉由重組DNA技術或藉由化學方法製造。
本發明特徵亦為經分離之核酸，其含有編碼上述融合多肽中之一者的序列。核酸之實例包括分別編碼SEQ ID NO：1、3、5、7及9的SEQ ID NO：2、4、6、8及10。SEQ ID NO：6、8及10之序列如下所示：
accgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacaccagcactaacaacgtgagaggtga ccttcaagtgttagctcagaaggcagaaagaactctgcctacctccttcaac(SEQ ID NO：6)
gcggccgcacagccctgggaggcaatttttactaaggacgacctggccgcaatcgagcc aaaacctgcttcggcaaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggac tcatcaaggcggagccacggacgcaaacttcatgaaagtactgctcggcctcagtctcg aagctttcgacaggggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtg gagcaccgtgcagcagccacgccatcaaggaggcgaactgcccaatacacaaggtcacc tactacctagccaaaccgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaa cttcgcaaagaagaatgtgccatcacatataaatggtgtgcgttcgatgcctttgatgg cctgtacgatcctacctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatag accgaatggcgtacgctaccttcaaaactatacagacaagatcgccaatgaccagaaag ggttcaacctcaactacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaacgcgccccta ccagctcttcccgaaccaacatcagactaa(SEQ ID NO：8)
atggacaccgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacaccagcactaacaacgtgag aggtgaccttcaagtgttagctcagaaggcagaaagaactctgcctacctccttcaacg cggccgcacgccctgggaggcaatttttactaaggacgacctggccgcaatcgagccaa aacctgcttcggcaaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggactc atcaaggccggagccacgacgcaaacttcatgaaagtactgctcggcctcagtctcgaa gctttcgacaggggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtgga gcaccgtgcagcagccaacgccatcaagaggcgaactgcccaatacacaaggtcaccta ctacctagccaaaccgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaact tcgcaaagaagaatgtgccatcacaatataaatggttgcgttcgatgcctttgatggcc tgtacgatcctacctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatagac cgaatggcgtacgctaccttcaaaactatacagatcaagatcgccatgaccagaaaggg ttcaacctcaactacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaacgcgcccctacc agctcttcccgaaccaacatcagactaa(SEQ ID NO：10)
核酸可進一步含有BaMV開放閱讀框架1-4之序列(ORFs1-4，例如GenBank編號D26017等其他序列)。
核酸係指DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)或DNA或RNA類似物。可由核苷酸類似物合成DNA或RNA類似物。核酸分子可為單股或雙股，但較佳為雙股DNA。"經分離之核酸"為結構不同於任何天然存在核酸或不同於天然存在基因組核酸之任何片段的核酸。其包含(a)具有天然存在基因組DNA分子之部分序列但不側接編碼序列之DNA，該等編碼序列側接於其所存在之個體基因組的部分分子；(b)以使所得分子不同於任何天然存在之載體或基因組DNA之方式，併入原核生物或真核生物之載體或基因組DNA中之核酸分子；(c)單獨分子，諸如cDNA、基因組片段、由聚合酶鏈反應(PCR)產生之片段，或限制酶片段；及(d)為雜交基因(亦即，編碼融合蛋白質之基因)之部分的重組核苷酸序列。上文所述之核酸可用於表現本發明之多肽。為此，可將核酸與合適調節序列操作性連接以產生表現載體。
載體係指能夠轉運所連接之另一核酸的核酸分子。載體能夠自主複製或併入宿主DNA中。載體之實例包括質體、黏質體或病毒載體。本發明之載體包括適於在宿主細胞中 表現核酸之形式的核酸。較佳地，載體包括與待表現核酸序列操作性連接之一或多種調節序列。"調節序列"包括啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如，花椰菜嵌紋病毒35S(cauliflower mosaic virus 35S)啟動子序列或聚腺苷酸化信號)。調節序列包括直接組成性表現核苷酸序列之彼等，以及組織特異性調節性及/或誘導性序列。表現載體之設計可視諸如待轉形宿主細胞之選擇、所要蛋白質之表現程度及其他類似因素而定。可將表現載體引入宿主細胞中以產生本發明之多肽或病毒顆粒。
含有上述核酸之宿主細胞亦在本發明範疇內。實例包括植物細胞、大腸桿菌細胞(E. coli ce11s )、昆蟲細胞(例如，使用桿狀病毒表現載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞。例如參見Goeddel, (1990)Gene Expression Technology： Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA。較佳地，宿主細胞為植物細胞，諸如白藜(Chenopodium qu inoa )或煙草(Nicotiana benthamiana )之葉細胞。
為產生本發明之多肽，可在允許表現由本發明之核酸編碼之多肽的條件下在培養基中培養宿主細胞，且自經培養細胞或細胞培養基純化多肽。或者，本發明之核酸可使用(例如)T7啟動子調節序列及T7聚合酶活體外轉錄及轉譯。
在另一態樣中，本發明特徵為含有上述融合多肽中之一者的嵌合竹嵌紋病毒顆粒。為製造此嵌合竹嵌紋病毒顆粒，可使宿主植物之葉片與含有竹嵌紋病毒開放閱讀框架 1-4之序列的上述核酸接觸，將葉片保持在允許形成含有由核酸編碼之多肽之病毒顆粒的條件下，且自葉片純化病毒顆粒。
本發明之融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒亦可用於產生特異性結合至所關注多肽(例如，FMDV VP1)之特異性抗體。因此，包括融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒之免疫原性組合物在本發明範疇內。為在個體內引發免疫反應，可向有需要之個體投與有效量之融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒。個體可為人類或非人類動物，諸如豬、牛、馬、綿羊或山羊。
下文所附之說明書中闡述本發明之一或多個實施例之細節。本發明之其他優勢、特徵及目標將由實施方式及申請專利範圍而變得顯而易見。
本發明係至少部分基於以下發現：BaMV CP或BaMV顆粒可用作在個體內對所關注多肽產生免疫反應之載體。
BaMV為馬鈴薯病毒群(Potexvirus group)之絲狀型植物病毒之一員，其感染單子葉植物及雙子葉植物(Lin等人，Phytopathology 1992；82：731-4)。其基因組由具有5'帽結構及3'聚(A)尾之單股正義RNA分子組成。其含有5個主要開放閱讀框架(ORFs)，編碼用於病毒複製、移動及包被之不同蛋白質(Lin等人，J. Gen. Virol. 1994；75：2513-2518)。其中，ORF5編碼鞘蛋白質(CP)，其涉及於病毒包裝及細胞間(cell-to-cell)及長距離移動(Lin等人，Phytopathology 1992；82：731-4及Lin等人，J. Gen. Virol. 1994；75：2513-8)。
如下之融合多肽在本發明範疇內，其具有與含SEQ IDNO：1或其功能等效物(諸如來自其他BaMV病毒株之CP蛋白質的對應序列)之載體融合的所欲免疫原性多肽。
SEQ ID NO：1之功能等效物係指衍生自SEQ ID NO：1之多肽，例如具有一或多個點突變、插入、缺失、截斷或其組合之融合多肽或多肽。所有功能等效物實質上具有BaMV殼體化之活性且不影響病毒複製。此活性可藉由與以下實例中所述之彼等相似的標準檢定來測定。
詳言之，該等功能等效物包括序列與SEQ ID NO：1之區別在於一或多個保守胺基酸經取代或一或多個非保守胺基酸經取代、缺失或插入之多肽。下表列出合適之胺基酸取代：
一般而言，SEQ ID NO：1之功能等效物與SEQ ID NO：1至少50%相同，例如至少60%、70%、80%、90%或95%相同。兩個胺基酸序列或兩個核酸之"相同性%"係使用Karlin and AltschulProc. Natl. Acad.Sci . USA 90：5873-77,1993中所修正之Karlin and AltschulProc. Natl. Acad .Sci . USA 87：2264-68,1990演算法測定。該演算法係併入Altschul等人.J. Mol. Biol . 215：403-10,1990之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)中。可由NBLAST程式，記分=100，字長-12進行BLAST核苷酸研究以獲得與本發明核酸分子同源之核苷酸序列。可由XBLAST程式，記分=50，字長=3進行BLAST蛋白質研究以獲得與本發明蛋白質分子同源之胺基酸序列。當兩個序列之間存在間隙時，可如Altschul等人，Nucleic Acids Res . 25(17)：3389-3402,1997所述利用Gapped BLAST。當利用BLAST及Gapped BLAST程式時，可使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之默認參數。
本發明的融合多肽可由合成多肽或重組多肽之形式獲得。為製備重組多肽，可將編碼其之核酸與編碼融合搭配物之另一核酸(例如，麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、6x-His抗原決定基標籤或M13Gene3蛋白質)連接。所得融合核酸於合適宿主細胞中表現融合蛋白質，該融合蛋白質即可藉由此項技術中已知之方法分離。經分離的融合蛋白質可藉由(例如)酶切割進一步處理以移除融合搭配物而獲得本發明之重組多肽。
含有上述融合多肽之重組嵌合竹嵌紋病毒顆粒亦在本發明範疇內。該顆粒含有或不含野生型BaMV CP。為製備該顆粒，可將編碼上述融合多肽中之一者的核酸及竹嵌紋病毒ORFsl-4序列與5'及3'UTR引入合適宿主植物細胞中，且以下文實例所述之方式產生病毒顆粒。在一實施例中，融合多肽含有SEQ ID NO：1或7序列。
可使用本發明之融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒在動物(用於產生抗體或治療疾病)或人類(用於治療疾病)體內產生抗體。在動物體內製造單株及多株抗體及其片段之方法為此項技術中已知的。例如參見Harlow及Lane，(1988)Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。術語"抗體"包括完整分子以及其片段，諸如Fab、F(ab')2 、Fv、scFv(單鏈抗體)及dAb(域抗體；Ward等人.(1989)Nature,341,544)。
一般而言，為製造針對所欲蛋白質之抗體，可產生包括蛋白質之免疫原性片段的融合多肽或帶有融合多肽之嵌合竹嵌紋病毒顆粒。接著將融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒與佐劑混合，再將混合物注射入宿主動物體內。接著可藉由肽親和層析法純化動物體內產生之抗體。通常採用之宿主動物包括家兔、小鼠、天竺鼠及大鼠。可用於增加免疫反應之各種佐劑視宿主種類而定，其包括MONTANIDE ISA 206佐劑、弗洛伊德佐劑(Freund's adjuvant，完全及不完全)、無機凝膠(諸如氫氧化鋁)、CpGODN、表面活性物質(諸如溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、油乳液、透孔螺血藍蛋白質及二硝基酚。適用人類之佐劑包括BCG(卡介苗)及棒狀桿菌孢子蟲。
多株抗體(抗體分子之異質群體)係存在於經免疫個體之血清中。單株抗體(結合至本發明多肽之抗體的同質群體)可使用標準融合瘤技術(例如參見，Kohler等人(1975)Nature 256,495；Kohler等人(1976)Eur. J. Immunol. 6,511；Kohler等人(1976)Eur. J. Immunol. 6,292；及Hammerling等人(1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y.)製備。詳言之，可使用諸如Kohler等人.(1975)Nature256,495及美國專利第4,376,110號所述之藉由所培養之連續細胞系(continuous cell lines)製造抗體分子的任何技術；人類B細胞融合瘤技術(Kosbor等人.(1983)Immunol Today4,72；Cole等人(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,2026)及EBV融合瘤技術(Cole等人.(1983)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. ，第77-96頁)獲得單株抗體。該等抗體可為任何免疫球蛋白種類，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何子類。可將產生本發明單株抗體之融合瘤於活體外或活體內培養。活體內產生高效價單株抗體之能力使其成為尤其適用之製造方法。
本發明之融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒亦可用於製備免疫原性組合物(例如，疫苗)，該組合物係用於在易受病毒感染之個體內產生針對病毒(例如，FMDV)之抗體。可 (例如)根據下文實例所述之方法或藉由此項技術中已知之任何等效方法製備該等組合物。組合物含有有效量之本發明融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒，及諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水或碳酸氫鹽溶液之醫藥學上可接受之載劑。載劑係基於投藥模式及途徑及標準醫藥常規進行選擇。合適醫藥載劑及稀釋劑以及醫藥輔料描述於Remington's Pharmaceutical Sciences中。若必要，則本發明組合物中亦可包括例如霍亂毒素(cholera toxin)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin，LT)、脂質體、免疫刺激複合物(ISCOM)或免疫刺激序列寡脫氧核苷酸(ISS-ODN)之佐劑。融合多肽、其片段或類似物或嵌合竹嵌紋病毒顆粒可為對抗多種疾病之疫苗之多價組合物的成分。
製備疫苗之方法一般為此項技術中所熟知，如美國專利第4,601,903號；第4,599,231號；第4,599,230號；及第4,596,792號所例示。疫苗可製備為可注射液體溶液或乳液。本發明之融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒可與生理學上可接受且與賦形劑相容之物混合。賦形劑可包括水、生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其組合。疫苗可進一步含有微量助劑物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑或增強疫苗效用之佐劑。達成疫苗之佐劑作用的方法包括使用諸如氫氧化鋁或磷酸鋁(礬)之藥劑，通常以0.05至0.1%磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液形式使用。疫苗可藉由非經腸投與、皮下注射或肌肉注射。或者，包括栓劑及口服調配物 之其他投藥模式可為所要的。對於栓劑而言，黏合劑及載劑可包括(例如)聚烷二醇或甘油三酯。口服調配物可包括通常採用之初始劑(incipient)，諸如醫藥級之醣類、纖維素、碳酸鎂及其類似物。此等組合物為溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或散劑形式且含有10-95%融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒。
疫苗係以與劑量調配物相容之方式投與，且以治療有效、保護及免疫原性之量投與。投與之量視待治療之個體而定，包括(例如)個體免疫系統合成抗體之能力及(若需要)製造細胞介導之免疫反應之能力。需要投與之活性成份的精確量視從業者之判斷而定。然而，由熟習此項技術者可容易地判定本發明多肽之合適劑量範圍，且其可為微克級。初始投藥及輔助給藥的合適方案亦可變，但可包括起始投藥，接著後續投藥。疫苗之劑量亦可視投藥途徑而定，且其可視宿主體型而變。
如下文實例所述，上述融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒可在個體內引發針對病毒感染(諸如，FMDV感染)之免疫反應。易受FMDV感染之個體經鑑別後可投與本發明組合物。誠如熟習此項技術者可判定者，組合物之劑量可視(例如)特定多肽/病毒顆粒、是否與佐劑共投與、共投與之佐劑的類型、投藥模式及頻率而定。誠如熟習此項技術者所能判定者，在必要時可重複投藥。舉例而言，可以每週間隔初次免疫給藥(priming dose)，隨後三次輔助給藥。可在第一次免疫後4至8週給與輔助注射，且在8至12週使用 相同調配物給與第二次輔助。可自受檢者取樣血清或T細胞，以測量組合物針對FMDV所引發之免疫反應。分析針對蛋白質或感染之抗體或細胞毒性T細胞之方法為此項技術中所熟知的。可視需要給與其他輔助劑。藉由改變多肽/病毒顆粒之量，組合物劑量及投藥頻率，可使免疫方案最佳化以引發最大免疫反應。在大範圍投藥前，需要進行效用測試。在效用測試中，可經由口服或非口服的方式向非人類受檢者投與本發明組合物。初始投藥後或視情況之輔助投藥後，可藉由皮下注射(例如)0.5 mL之1×105 TCID50 FMDV O/Taiwan/97以挑戰測試受檢者及對照受檢者(接受模擬投藥)。接著對受檢者監測FMD症狀，歷時14天。FMD症狀包括連續三天高於40℃之高體溫，跛行、口周圍水泡性損傷及腿部冠狀帶。
上述BaMV CP多肽可用作載體，並可與所欲之其他抗原連接以產生對抗抗原之抗體。多肽片段一般可用於製備對抗病源性細菌(包括囊封細菌)的嵌合分子及共軛組合物。
下文之特定實例應僅解釋為說明性的，而非以任何方式顯示本揭示案之其餘部分。無需進一步詳細描述，咸信熟習此項技術者可以本文之說明為基礎以最充分程度利用本發明。本文引用之所有公開案係以引用的方式全部併入本文中。
實例1
在此實例中，使VP1抗原決定基與BaMV經截斷鞘蛋白之胺基末端融合產生融合蛋白質。亦產生具有融合蛋白質 之嵌合BaMV。
以Lin等人.J. Gen. Virol. 2004；85：251-9所述之方式將具有上游花椰菜嵌紋病毒35S啟動子序列之BaMV-S的全長傳染性cDNA選殖入質體pUC119中。載體pBS-d35CP係源自上述BaMV cDNA純系，其中編碼CP之N-末端35胺基酸序列的序列缺失，且藉由基於聚合酶鏈反應(PCR)之方法插入多個選殖位點(Age I-Nhe I-Not I)。使用質體pVP1/Q15作為模板，藉由pCR將編碼FMDV VP1(O/Taiwan/97)之胺基酸128-164的序列插入至pBS-d35CP(Wang等人，Vaccine2003；21：3721-9.)。所用之引子為pr128164N(5'-GGgctagcAccatgg-ACACCGTCTACAACGGGAG-3';該等序列在有些情況下被視為Nhe I及Nco I位點；Nco I識別序列提供AUG起始密碼子)及pr128164C(5'-TTgcggccgc-GTTGAAGGAGGTAGGC-3'；該等序列在有些情況下被視為Not I位點)。PCR反應係在94℃之起始溫度下進行5分鐘，隨後在94℃下歷時30秒，在50℃下歷時30秒及在72℃下延長歷時30秒，循環25次。將對應於VP1抗原決定基之擴增片段純化且將其選殖入質體pBS-d35CP之Nhe I及Not I位點以產生pBVP1質體。此載體編碼嵌合BaMV之基因組，亦即BVP1。
為檢驗此嵌合病毒對植物之傳染性，以全身性宿主煙草(N. benthamiana )及局部病斑宿主白藜(C. quinoa )進行測試。
局部病斑宿主白藜及全身性宿主煙草植物係生長於暴露 在日光中之溫室中。對於傳染性之檢定而言，將約1μg純pBVP1 DNA溶於10 μl體積之雙蒸餾H2 O中，並接種於在6片葉階段測試植物之各葉片(Lin等人，J. Gen. Virol. 2004；85：251-9)。在接種10天後進行對局部病斑之觀測。對於抗原製備而言，將具有8至10片完全擴展之葉片的白藜植物以來自經BaMV-S或BVP1感染之白藜植物的葉片萃取液接種。在接種第10天後採集經接種之葉片。隨後以Lin等人.Phytopathology, 1992；82：731-4所述之方式自新鮮葉片純化病毒粒子。藉由紫外線吸收測定經純化病毒之產率(假定每毫克(mg)病毒吸收率(0.1%，260 nm)為3.0)。嵌合病毒BVP1中表現之VP1抗原決定基之量經估算為總病毒重量的約14.3%。將經純化病毒粒子溶解於BE緩衝液(10mM Borate, pH 9.0,1 mM EDTA)中，且接著在-20℃下儲存以用於免疫豬隻。
結果發現，BVP1感染之煙草之嵌紋症狀比BaMV-S感染之煙草輕微。在白藜中，由BVP1形成之萎黃局部病斑與野生型BaMV-S引起之壞死性局部病斑不同。然而，結果顯示嵌合突變病毒的確具有感染健康煙草或白藜植物的能力。
實例2
上述嵌合病毒BVP1經檢驗以測定其是否能表現VP1抗原決定基。將白藜葉片分別以模擬對照組、野生型BaMV-S、BS-d35CP及BVP1接種，分離上述白藜葉片之總蛋白質並進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。
結果發現，來自BVP1之嵌合CP的移動比野生型CP或N-末端截斷之CP的移動慢，而在模擬接種之葉片中未發現CP。結果顯示野生型與嵌合BVP1之CP之尺寸有明顯差異，且VP1抗原決定基與BVP1之CP融合。
為進一步確認BVP1之CP含有VP1抗原決定基，使用家兔抗FMDV VP1血清或來自FMDV感染之豬的血清進行西方墨點檢定。家兔抗FMDV VP1血清係根據Wang等人，2003,Vaccine 2003；21：3721-9所述之方式製備。來自FMDV豬之血清係購自Animal Health Research Institute, COA, R.O.C。總蛋白質係利用1：2(重量/體積)萃取緩衝液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0,10 mM KCl, 10 mM MgCl2 , 1 mMEDTA，20%甘油及2%SDS)，由以模擬對照組或病毒接種之白擊所萃取，且在100℃下加熱5分鐘。接著將蛋白質樣本藉由12%SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離且在4℃下以200mA電泳轉移至Immobilon-P膜(Bio-Rad)，歷時1′小、時。以脫脂奶粉蛋白填阻(blocking)後，將膜以抗BaMV-S CP或抗FMDV VP1抗體探測(Lin等人，Phytopathology 1992；82：731-4及Lin等人，J. Gen. Virol. 2004；85：251-9)
發現兩血清均識別出對應於嵌合CP之蛋白質帶，其預期之大小為31 kDa。相反的，在BaMV-S之野生型CP或BS-d35CP之截斷CP中未偵測到VP1蛋白質帶。其他免疫墨點研究顯示，即使BVP1在白藜經過5個隨後繼代(passage)之後，自白藜葉片提取之BVP1的CP仍含有相同之主要蛋白質帶。總之，此等結果顯示嵌合病毒BVP1能在其CP中以 融合蛋白質形式穩定表現FMDV之VP1抗原決定基。
實例3
對上述BVP1嵌合病毒測試其在豬體內引發特異性抗體之能力。
將嵌合BVP1病毒顆粒自BVP1感染之白藜葉片組織分離。純化病毒之產率為約0.2-0.5毫克/公克新鮮葉片組織。無特定病原體(SPF)雌性或閹割雄性豬(2個月大，體重約為25 kg)係購自臺灣。藉由肌肉注射，分別以5mg及10mg BVP1嵌合病毒製劑免疫兩組SPF豬(每組3隻)。更特定言之，在除了耳朵以外之頸部肌肉以10mg或5mg BVP1病毒粒子(經等體積之Montanide ISA 206佐劑(Seppic, France)乳化)注射。此外，兩隻豬注射野生型病毒BaMV-S，另外兩隻豬注射無菌磷酸鹽緩衝之生理食鹽水緩衝液(PBS；140 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM Na2 HPO4 ,1,8mM KH2 PO4, pH 7.3)作為負對照組。
於所有豬之初次免疫(Priming)6週後，再對所有豬進行相同劑量之增幅(boosting)注射。於第0天、第28天、第42天、第56天及第63天自經免疫豬收集血清進行分析。輔助劑注射3週後，將0.5 mL1×105 TCID50 之FMDV O/Taiwan/97注射入豬右前足跟，以感染所有豬隻。接著監測豬隻FMD症狀，歷時14天。FMD之症狀包括連續3天高於40℃之高體溫、跛行、口周圍水泡性損傷及腿部冠狀帶(Wang等人，Vaccine 2003；21：3721-9)。
為檢驗免疫作用，以Shieh等人(Vaccine 2001；19：4002- 10)所述方法作微小修正後的方式進行ELISA。簡言之，在形成培養盤結合抗原抗體複合物後，將培養盤以含有0.1%Tween-20之PBS(pBST)洗滌3次，且在37℃下與經結合生物素之山羊抗豬IgG抗體反應1′小時。隨後洗滌培養盤且添加抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)：過氧化酶(1：3000倍稀釋)。在室溫下反應1小時候，將培養盤再次洗滌。接著添加酶受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(Sigma)，且在室溫下使反應進行10分鐘。最後，添加等體積之1N H2 SO4 以使反應停止，且藉由ELISA讀取器量測450 nm下之吸光率。
ELISA顯示於初次免疫4週後，經免疫豬引發顯著抗-VP1抗體之效價(對5mg組而言為880±434且對於10mg組而言為2382±1098)。且特異性抗-VP1抗體含量增加，並在2週後達到平穩狀態。相反地，ELISA結果顯示注射野生型病毒BaMV-S或PBS緩衝液之豬僅產生少量抗-VP1抗體。此結果顯示嵌合BVP1病毒在豬體內會誘發特異性抗-VP1抗體。
根據Shieh等人(Vaccine 2001；19：4002-10)所述之方法確認經BVP1免疫之豬血清中中和抗體(NA)之存在。簡言之，將來自測試動物之血清在56℃下去活化30分鐘。在96孔組織培養盤各列之末端孔中添加各血清樣本或對照血清(50μ1)，且接著整個培養盤以2倍連續稀釋率來稀釋。於各孔中添加50μ1100 TCID50 病毒懸浮液，且接著使培養盤震盪1分鐘。在37℃下在5%CO2 中培育90分鐘後，於各孔中添加100μ1懸浮於含有3%胎牛血清(FBS)之Eagle's MEM中之BHK-21細胞懸浮液(每毫升106 細胞)，且培育48小時。接著在顯微鏡下觀測細胞。孔中細胞單層的破壞及細胞由軸形至圓形之變化顯示病毒之細胞病變效應。
在濕度飽和、5%CO2 及37℃下培育48小時後測定效價，且該效價係以50%終點中和病毒之細胞病變效應的血清最終稀釋率之倒數表示。結果概述於下表2中：
如表2中所示，經野生型BaMV-S病毒或PBS緩衝液免疫之豬未產生任何針對FMDV之NA。反言之，經5 mg或10mg BVP1免疫的豬在初次免疫4週後產生NA。甚至在初次免疫6週後效價亦增加。然而，在初次免疫6週後以類似量之BVP1輔助注射未顯著增加NA。此結果顯示將豬以BVP1病毒接種一次即足以引起高含量之針對FMDV之NA。
實例4
在上述豬體內分析外周血單核細胞(PBMC)產生IFN-γ之 能力以評估BVP1免疫除體液反應外是否能引發細胞性免疫反應。IFN-γ為在細胞性免疫反應中起關鍵作用之細胞激素(cytokine)。
特定言之，自測試豬分離PBMC，且在6孔培養盤中以每孔1×107 個細胞(於含有10%FBS及1%盤尼西林(penicillin)及鏈黴素(streptomycin)之2 mL DMEM培養基中)之濃度三重複接種。隔夜培養後，在37℃下及5%CO2 中將細胞與5μg/mL重組VP1(rVP1)或1 μg/mL植物性凝血球素(phytohemagglutinins，PHA，Sigma)培育6小時。將以PHA培育之細胞用作正對照。培育後，將細胞溶解於TRIzolTM 試劑(Invitrogen)中，且根據製造商說明分離細胞總RNA。細胞總RNA之濃度係藉由在260nm下測定光學密度來定量。接著藉由SuperScript IIITM 反轉錄酶(Invitrogen)將細胞總RNA反轉錄為互補DNA(cDNA)。將所得cDNA進行即時PCR。
藉由即時PCR定量全部IFN-γ mRNA。即時PCR係利用在LightCycler儀器中之SYBR Green系統與FastStart DNA Master SYBR Green I套組(Roche)建立(RocheApplied Science)，其最終體積為20μL(其中包括可熱活化之Taq 聚合酶、4mM MgCl2 、濃度各為0.5 μM之引子(引子序列為SW-IFN γ(F4)：5'-GCT CTG GGA AAC TGA ATG ACT TCG 及SW-IFN γ(R4)：5'-GAC TTC TCT TCC GCT TTC TTA GGT TAG )及2 μL以如上文所述方法製備之cDNA)。聚合酶活化(95℃，10分鐘)後，進行40次循環之95℃下變 性15秒，60℃下黏合2秒及72℃下延長15秒。所有步驟之溫度轉移率為每秒20℃。PCR產物之量藉由偵測SYBR Green I與擴增產物之結合所產生的螢光來測量，在每次循環中在72℃培育(延長步驟)後立即量測一次。以LightCycler軟體3.0版(RocheApplied Science)分析發光曲線。引子係由Invitrogen Life Technology公司合成。對於各樣本而言，藉由與標準曲線比較且藉由使用β-肌動蛋白作為內源參照標準化來測定IFN-γ之量。所有樣本三重複處理。
發現經由BVP1免疫之豬產生的PBMC在藉由重組VP1(rVP1)刺激後，其IFN-γ增加3倍。相反的，由經BaMV-S免疫或注射PBS之豬產生的PBMC，其IFN-γ表現量在rVP1刺激後並未增加。作為對照組，來自所有豬之PBMC在經PHA刺激後產生類似量之IFN-γ。此等結果顯示經BVP1免疫之豬的免疫細胞能在rVP1刺激時產生IFN-γ。
實例5
為測定BVP1免疫之功效，在輔助注射三週後，以1×155 TCID50 之FMDV(O/Taiwan/97)挑戰接種或未接種BVP1的豬，且接著監測FMD症狀歷時2週。彼等無症狀者判定為受到保護。結果概述於下表3中：
如表3中所示，經5mg或10mg BVP1免疫的豬無症狀且在挑戰後兩週期間完全受保護。相反的，經BaMV-S免疫或注射PBS(負對照)的豬在FMDV挑戰後第二天出現嚴重FMD症狀。此結果顯示嵌合病毒BVP1適合用作豬對抗FMDV的疫苗。
已知以大腸桿菌產生之rVP1使豬免疫可有效保護豬免於FMDV挑戰。比較BVP1及類似量之大腸桿菌產生之rVP1之功效。更特定言之，以Wang等人(Vaccine 2003；21：3721-9)所述之方式，以6週間隔將豬以乳化於等體積ISA206佐劑中的8mg或4mgrVP1兩次肌肉內注射接種。以上述相同方式評估rVP1引發中和抗體(NA)之作用及對抗FMDV之保護。結果概述於下表4中：
如表4中所示，rVP1使所有經免疫豬受到完全保護。但是，在一些(而非所有)經免疫豬體內產生NA。同樣，由rVP1引發之平均NA不如BVP1免疫之彼等高(參見表2及4)。結果顯示表現37-aa VP1片段之BVP1引發體液免疫反應之效果比大腸桿菌產生之全長rVP1好。
先前，源於大腸桿菌之重組VP1(rVP1)(26kDa多肽)經純化，其在豬體內可引發保護性免疫性。與上文所述之組合 物相比，rVP1在一些(而非所有)經免疫豬體內引發中和抗體。由rVP1引發之平均中和抗體效價不如BVP1之彼等高(參見表2及4)。BVP1(僅含有VP1的37個胺基酸及BaMV CP)產生比rVP1佳之中和抗體反應。缺乏N末端至少35胺基酸殘基之BVP1 CP突變體仍可形成能感染全身性宿主(煙草)及局部病斑宿主(白藜)植物之病毒。
上述結果顯示，由於BaMV有容納及有效表現外來肽之靈活性，本文所述之BaMV表現載體系統及嵌合病毒可有效產生中和抗體。此外，BaMV具有優於其他植物病毒之其他優勢。舉例而言，因為未發現BaMV之自然界傳播媒介，所以BaMV較安全(Lin等人.Phytopathology 1992；82：731-4)。相反的，許多植物病毒對於多數作物而言為病原體。同樣的，作為載體之BaMV具有容納較長異源多肽之較大能力。
其他實施例
本說明書中所揭示之所有特徵可以任何組合形式組合。本說明書中所揭示之各特徵可用於相同、等效或類似目的之替代特徵置換。因此，除非另外明確說明，否則所揭示之各特徵僅為等效或類似特徵之一般系列的實例。
熟習此項技術者自上述說明可容易地確定本發明之基本特徵，且不悖離其精神及範疇之狀況下可對本發明作出各種改變及修正以使其適於各種用途及條件。因此，其他實施例亦在以下申請專利範圍之範疇內。
<110>中央研究院 <120>重組病毒蛋白及顆粒 <140>096151519 <141>2007-12-31 <150>EP07100073.1 <151>2007-01-03 <160>14 <170>FastSEQ for Windows Version 4.0 <210>1 <211>241 <212>PRT <213>竹嵌紋病毒 <400>1<210>2 <211>724 <212>DNA <213>竹嵌紋病毒 <400>2<210>3 <211>213 <212>PRT <213>口蹄疫病毒 <400>3<210>4 <211>639 <212>DNA <213>口蹄疫病毒 <400>4 <210>5 <211>37 <212>PRT <213>口蹄疫病毒 <400>5<210>6 <211>111 <212>DNA <213>口蹄疫病毒 <400>6<210>7 <211>206 <212>PRT <213>竹嵌紋病毒 <400>7 <210>8 <211>620 <212>DNA <213>竹嵌紋病毒 <400>8<210>9 <211>245 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <400>9 <210>10 <211>736 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成寡核苷酸 <400>10<210>11 <211>34 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400>11<210>12 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400>12<210>13 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400>13<210>14 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400>14

Claims (27)

  1. 一種編碼融合多肽之經分離核酸，其中該融合多肽包括：含有竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus)鞘蛋白之序列之載體片段；及與該載體片段融合之免疫原性異源片段，其中該免疫原性異源片段含有口蹄疫病毒VP 1蛋白質之序列或含有其免疫原性區段。
  2. 如請求項1之核酸，其中該免疫原性異源片段含有SEQ ID NO：3。
  3. 如請求項2之核酸，其中該免疫原性區段含有SEQ ID NO：5。
  4. 如請求項1之核酸，其中該異源片段係與該載體片段之胺基末端融合。
  5. 如請求項1之核酸，其中該載體片段含有SEQ ID NO：7。
  6. 如請求項1之核酸，其中該免疫原性異源片段長度為至少37個胺基酸。
  7. 如請求項1之核酸，其中該多肽包括SEQ ID NO：9之序列。
  8. 如請求項1之核酸，其中該核酸進一步包含竹嵌紋病毒開放閱讀框架1-4之序列。
  9. 一種由如請求項1之核酸編碼之經分離多肽。
  10. 一種包含如請求項1之核酸的表現載體。
  11. 一種包含如請求項1之核酸的宿主細胞。
  12. 如請求項11之宿主細胞，其中該宿主細胞為植物細胞。
  13. 如請求項12之宿主細胞，其中該植物為白藜(Chenopodium quinoa )或煙草(Nicotiana benthamiana )。
  14. 如請求項12之宿主細胞，其中該細胞為葉片細胞。
  15. 一種製造融合多肽之方法，其包含在允許表達由核酸編碼之多肽的條件下將如請求項11之宿主細胞在培養基中培養，且自經培養細胞或培養基純化該多肽。
  16. 一種嵌合竹嵌紋病毒顆粒，其包含由如請求項1之核酸編碼之融合多肽。
  17. 一種製造嵌合竹嵌紋病毒顆粒之方法，其包含：提供如請求項1之核酸，該核酸具有竹嵌紋病毒開放閱讀框架1-4之序列；使該核酸與宿主植物之葉片接觸；將該葉片保持於允許形成具有由該核酸編碼之多肽的病毒顆粒之條件下，及自該葉片純化該病毒顆粒。
  18. 一種免疫原性醫藥組合物，其包含如請求項9之融合多肽。
  19. 一種免疫原性醫藥組合物，其包含如請求項16之嵌合竹嵌紋病毒顆粒。
  20. 如請求項18或19之免疫原性醫藥組合物，其係用於在動物體內引發免疫反應。
  21. 如請求項20之免疫原性醫藥組合物，其中該動物為豬。
  22. 一種如請求項9之融合多肽之用途，其係用於製造在個體內引發免疫反應之藥物。
  23. 如請求項22之用途，其中該個體為非人類動物。
  24. 如請求項23之用途，其中該非人類動物為豬。
  25. 一種如請求項16之嵌合竹嵌紋病毒顆粒之用途，其係用於製造在個體內引發免疫反應之疫苗。
  26. 如請求項25之用途，其中該個體為動物。
  27. 如請求項26之用途，其中該動物為豬。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996002649A1 (en) * 1994-07-13 1996-02-01 Axis Genetics Ltd. Modified plant viruses as vectors of heterologous peptides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dus Santos MJ et al., A novel methodology to develop a foot and mouth disease virus (FMDV) peptide-based vaccine in transgenic plants. Vaccine. 2002 Jan 15 20(7-8):1141-7. *
Lin NS et al., Nucleotide sequence of the genomic RNA of bamboo mosaic potexvirus. J Gen Virol. 1994 Sep 75 ( Pt 9):2513-8. *
林銘裕, 利用竹嵌紋病毒載體表現口蹄疫病毒抗原決定基,國立中興大學生物科技學研究所碩士論文, 2004年7月。 *

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