CN105085625A - 一种兼抗肠道病毒71和柯萨奇病毒a16的基因工程疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗原表位肽，该抗原表位肽源自柯萨奇病毒的中和表位PEP71，并且所述的抗原表位肽长度为5-15个氨基酸，并且所述抗原表位肽与载体蛋白融合后所形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的免疫反应。实验证明，包含该抗原表位肽的融合蛋白可以作为兼抗EV71和CA16的基因工程疫苗。

Description

一种兼抗肠道病毒71和柯萨奇病毒A16的基因工程疫苗

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种兼抗肠道病毒71和柯萨奇病毒A16的基因工程疫苗及其应用。

背景技术

手足口病(Hand,footandmouthdisease,HFMD)是在5岁以下儿童中流行的常见疾病，肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxsackievirusA16,CA16)是手足口病的主要致病原，二者均属于小RNA病毒科人类肠道病毒属。流行病学调查显示，EV71感染是导致手足口病重症和死亡的主要原因。CA16感染一般导致较轻的症状，如发热，口部溃疡，手足部疱疹等，但近几年的流行病学调查显示，人感染CA16后导致严重神经症状和死亡的数量正在增加。此外，目前EV71和CA16病毒共同流行，使得部分患者同时感染两种病毒，导致病情加重；而且有可能造成病毒重组，产生毒力强的新病毒。因此，迫切需要开发能够同时预防EV71和CA16感染的疫苗。

目前，手足口病疫苗的开发主要是针对EV71，不论是灭活EV71全病毒疫苗还是EV71病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)疫苗，对CA16都没有交叉保护能力。因此，本领域中需要开发一种能够抗CA16的疫苗产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗原表位肽及其应用。

本发明的另一目的是提供融合有上述抗原表位肽的融合蛋白。

在本发明的第一方面，提供了一种抗原表位肽，所述抗原表位肽源自柯萨奇病毒的中和表位PEP71，并且所述的抗原表位肽长度为5-15个氨基酸，并且所述抗原表位肽与载体蛋白融合后所形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的免疫反应。

在另一优选例中，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16。

在另一优选例中，所述抗原表位肽长度为6-14个氨基酸。

在另一优选例中，所述抗原表位肽其序列与SEQIDNO.:1所示的多肽序列同源，且具有SEQIDNO.:1所示多肽的活性。所述同源是指本发明的抗原表位肽包括SEQIDNO.:1所示多肽的衍生物和类似物。

在另一优选例中，所述抗原表位肽选自下组：

(a)具有SEQIDNO:1氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQIDNO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后所形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的免疫反应的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述抗原表位肽序列如SEQIDNO.:1所示。

本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白是如本发明第一方面所述的抗原表位肽与载体蛋白融合所形成的。

在另一优选例中，所述载体蛋白包含至少一个T辅助细胞表位，所述载体蛋白可以增强所述抗原蛋白的免疫原性。

在另一优选例中，所述载体蛋白选自：乙肝核心抗原(HepatitisBcoreantigen)、白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、霍乱毒素B亚单位(CTB)、沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)、百日咳毒素(PTX)、破伤风毒素、或上述蛋白的免疫原性片段(如破伤风毒素的C片段)。

在另一优选例中，所述乙肝核心抗原(HepatitisBcoreantigen)序列如SEQIDNO.:2所示。

在另一优选例中，通过替换和/或插入将所述引入所述载体蛋白形成所述融合蛋白。

在另一优选例中，通过将所述抗原表位肽连接于所述载体蛋白的C末端或N末端形成融合蛋白。

所述抗原表位和所述载体蛋白之间具有连接肽。优选地，所述连接肽长度为3-30个氨基酸。更优选地，所述连接肽长度为4-20个氨基酸。最优选地，所述连接肽长度为5-10个氨基酸。

在另一优选例中，所述抗原表位和所述载体蛋白之间不具有连接肽。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:3所示。

本发明的第三方面，提供了一种结合分子，所述结合分子能可特异性结合第一方面所述的的抗原表位肽或第二方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述结合分子是抗体。

在另一优选例中，所述抗体是单克隆抗体。

本发明的第四方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明第一方面的抗原表位肽或本发明第二方面所述的融合蛋白。

本发明的第五方面，提供了一种组合物，它含有：

(a)本发明第一方面所述的抗原肽或其药学上可接受的盐、或本发明第二方面所述的融合蛋白；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述所述的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括铝佐剂、MF59、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG佐剂、卡介菌核糖核酸、单磷酰脂A。

本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的抗原肽、第二方面的融合蛋白或第三方面的结合分子的用途，用于制备检测手足口病病毒的试剂或试剂盒；或

用于制备预防或治疗手足口病病毒感染的药物；或

用于检测抗手足口病病毒的抗体。

在另一优选例中，所述手足口病病毒包括肠道病毒和/或柯萨奇病毒。

在另一优选例中，所述手足口病病毒包括肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和/或柯萨奇病毒A16型。

本发明的第七方面，提供了一种免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的抗原表位肽、第二方面的融合蛋白和/或第三方面的结合分子。

本发明的第八方面，提供了一种制备本发明第二方面所述融合蛋白的方法，包括步骤：

(1)构建表达质粒

所述表达质粒中含有编码所述融合蛋白的核酸序列；

(2)融合蛋白的表达；

将所述质粒转入大肠杆菌BL21的感受态细胞进行表达。

本发明的第九方面，提供了一种预防手足口病的方法，向所需要的对象施用本发明的疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的需要的对象包括哺乳动物，较佳地，为人、小鼠、大鼠、兔。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了HBcPEP71在E.coli中的表达。

图2显示了纯化后HBcPEP71蛋白的SDS-PAGE检测结果。

图3显示了HBcPEP71嵌合病毒样颗粒的组装。

图4显示了HBcPEP71免疫小鼠血清对CA16的中和活性。

图5显示了HBcPEP71免疫血清的体内保护效果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，设计和构建了CA16中和表位PEP71与乙肝核心抗原(HepatitisBcoreantigen，HBc)融合蛋白的表达载体，并在大肠杆菌中表达该融合蛋白，命名为HBcPEP71。生化试验和电镜分析证明，纯化的HBcPEP71自发组装成展示PEP71表位的嵌合病毒样颗粒。HBcPEP71嵌合病毒样颗粒免疫小鼠血清能够与PEP71多肽结合，表明抗血清中存在针对PEP71的抗体，而且该抗血清能够在体外中和CA16病毒、在体内保护初生小鼠免于CA16病毒的致死感染。意外的是，本发明人发现HBcPEP71免疫血清还能够在体外结合EV71病毒颗粒并抑制EV71感染。以上结果显示HBcPEP71病毒样颗粒是兼抗EV71和CA16的基因工程疫苗。

活性多肽

如本文所用，术语“抗原表位肽”、“抗原肽”、“活性多肽”、“多肽抗原”可互换使用。指多肽序列来自于柯萨奇病毒(如CA16)的多肽。这些抗原表位肽可结合于抗柯萨奇病毒抗体。与载体蛋白融合后形成的重组蛋白能够诱发机体抗柯萨奇病毒的免疫反应。此外，所述术语还包括具有结合抗柯萨奇病毒的抗体功能的、SEQIDNO：1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括柯萨奇病毒抗原肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与抗柯萨奇病毒的抗体相结合的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I或式II的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基

代表性的取代

优选的

		取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还提供柯萨奇病毒抗原肽的类似物。这些类似物与SEQIDNO:1所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

编码序列

本发明还涉及编码柯萨奇病毒抗原肽的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQIDNO:1或3所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:1或3所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一优选例中，本发明柯萨奇病毒抗原肽，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸来表达或生产本发明的柯萨奇病毒抗原肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码柯萨奇病毒抗原肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

药物组合物和施用方法

本发明的抗原肽或融合蛋白可作为免疫原在体内诱导产生抗柯萨奇病毒的抗体及淋巴T细胞活性，从而达到治疗效果。此外，本发明抗原肽具有优异的特异性和免疫活性，故可用于制备免疫治疗或预防的疫苗。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物(包括疫苗组合物)，它含有(a)安全有效量的本发明多肽(包括抗原肽和含有抗原肽的融合蛋白)或其药学上可接受的盐(或其编码序列)；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为注射剂。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，柯萨奇病毒抗原肽或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入人的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于预防或治疗时，作为活性成分的柯萨奇病毒抗原肽或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待预防或治疗的每个对象(病人)的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现了CA16病毒的保守中和表位PEP71；

(2)成功制备了展示CA16保守中和表位PEP71的嵌合病毒样颗粒,命名为HBcPEP71。

(3)HBcPEP71免疫小鼠所产生的抗体在体外能够中和CA16病毒。

(4)HBcPEP71免疫小鼠所产生的抗体在体内能够抵抗致死剂量CA16病毒攻击。

(5)HBcPEP71免疫小鼠所产生的抗体在体外还能够中和EV71病毒。

(6)HBcPEP71是一个兼抗EV71和CA16的双价疫苗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料和方法

1细胞和毒株

RD细胞和Vero细胞均购自中国科学院细胞库，培养方法参见文献^[3]。所用病毒株包括，CA16/SZ05(GeneBankID:EU262658)^[4]，CA16/G08(GenBankID:KC342228)^[4]和EV71/G082^[3]，所有毒株均在Vero细胞上扩增，并在RD细胞上进行滴度测定，方法参见文献^[4]。

2引物，多肽和病毒颗粒

所有引物均在英俊公司合成。PEP71多肽(FGEHLQANDLDYGQ，SEQIDNO.:1)在上海吉尔生化有限公司合成，PEP71多肽的鼠源抗血清由本实验室制备，详情参见文献^[2]。ELISA实验包被板子用的EV71/G082和CA16/SZ05灭活病毒的制备方法参见文献^[1,5]，将浓缩后的灭活病毒分别用WesternBlot定量^[5]后待用。

3表达质粒的构建

质粒pET28b-HBc参见文献^[1]。融合蛋白HBcPEP71表达质粒通过如下方法得到：先将PEP71表位(氨基酸序列为：FGEHLQANDLDYGQ)的基因序列设计为含有XbaⅠ和BglⅡ限制酶切位点悬臂的互补寡聚核苷酸:

PEP71-XbaⅠ-F

(CTAGAGACCTTTGGCGAACATCTGCAGGCGAATGATCTGGATTATGGCCAGGGA)和PEP71-BglⅡ-R

(GATCTccCTGGCCATAATCCAGATCATTCGCCTGCAGATGTTCGCCAAAGGTCT)，再将互补寡聚核苷酸退火，形成含有XbaⅠ和BglⅡ限制性内切酶粘性末端的双链，然后连接到用XbaⅠ和BglⅡ酶切过的pIBT-HBc载体上^[1]，得到中间体质粒pIBT-HBcPEP71。然后通过PCR方法将HBcPEP71的基因片段用引物

HBc-F-NcoⅠ(CTGCCATGGACATTGACCCTTACAAAG)和

HBc-R-XhoⅠ(GGCCTCGAGACATTGAG-ATTCCCTAGA)

从质粒pIBT-HBcPEP71扩增出来，用限制内切酶NcoⅠ和XhoⅠ酶切后，连接到表达载体pET-28b(+)，得到重组表达质粒pET28b-HBcPEP71，质粒表达图谱如图1-A所示。

4融合蛋白的表达和纯化

将重组质粒pET28b-HBcPEP71转入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单菌落转化子接入5ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基，于37℃，250rpm培养18h。然后按1:100(V/V)转接双份5ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基，继续在37℃，250rpm培养，待OD600nm读数达到0.8-1.0，转移至18℃，200rpm摇床，在其中一管添加IPTG(终浓度为25μM)后继续培养8-12h。之后分别取10μlIPTG诱导的和未诱导的菌液，用HBc特异性的小鼠单抗(货号：ab8638；Abcam)和PEP71抗血清通过WesternBlot检测目的蛋白的表达。再分别取1mlIPTG诱导的和未诱导的菌液，将菌体重悬到100μlPBS进行超声破碎，分为可溶性组分和包涵体(用100μlPBS重悬)两个组分，并用12％SDS-PAGE检测目的蛋白。WesternBlot和SDS-PAGE的实验方法参见文献^[1]。

按照以上培养条件，将HBc和HBcPEP71融合蛋白放大到500ml表达，以进行纯化。将诱导好的培养物在4℃，8000rpm离心8min，收集菌体，用适量预冷的PBS将菌体洗一遍以除去残余培养基。再次将菌体重悬到PBS溶液，进行超声破碎，在4℃，12000rpm离心30min后收集上清，用孔径为0.45μm的滤膜过滤后，铺到20％蔗糖垫上面，进行超速离心(SW28Ti转子，27,000rpm，4℃，3h)。沉淀下来的蛋白用PBS充分溶解，低速离心除去不溶物，将上清用凝胶过滤层析法(Superdex20010/300GL，GE)做进一步纯化。

5蔗糖密度梯度和电镜分析

先用10％，20％，30％，40％及50％(W/V)的蔗糖溶液制备梯度，将40μg纯化的HBc和HBcPEP71铺到最上层，进行超速离心(SW60Ti转子，4℃，39,000rpm)，之后从上至下等体积收集10个组分，并对各组分样品分别进行WesternBlot和ELISA分析。从各组分取20μl样品，用HBc特异性单抗(货号：ab8638；Abcam)进行Westernblot分析，方法参见文献^[1]。从各组分取1μl样品稀释到50μlPBS后，包被到96孔ELISA板的单孔，每个样品两个重复，用5％脱脂奶粉(溶于PBST)在37℃封闭1h，以下每步操作后，都需要用PBST洗三次板子以除去非特异性结合。先添加1/1000稀释的PEP71抗血清(50μl/孔)，37℃孵育2h，再添加1/5000稀释的HRP标记的抗鼠IgG(50μl/孔)，37℃孵育1h，最后用TMB溶液显色，用酶标仪测定OD450nm读值，方法参见文献^[1]。

对于电镜分析，将纯化的蛋白稀释为0.1mg/ml，用0.75％(W/V)的甲酸铀染色后，用TecnaiG2Spirit电镜，在120kV电压，×67,000放大倍数下观察并采集图像。

6小鼠免疫及血清抗体测定

动物免疫实验采用6-8周龄的雌性ICR小鼠，每组6只小鼠。将铝佐剂(ImjectAlum，Pierce)与纯化的HBc或HBcPEP71按1:3(V/V)混合，涡旋振荡30min后进行腹腔注射，每只小鼠注射100μl抗原佐剂混合物(含10μg抗原)，添加同样体积佐剂的PBS作为阴性对照组。各组小鼠分别免疫四次，间隔两周。在第一次免疫前两周和每次免疫后两周分别采血。通过ELISA法测定血清中的抗体水平，主要步骤为：用PBS稀释的合成多肽PEP71(200ng/孔)，灭活CA16病毒(10ng/孔)或者灭活EV71病毒(10ng/孔)包被96孔ELISA板(50μl/孔)，4℃孵育12h；将板子用5％脱脂奶粉(200μl/孔)在37℃封闭1h；添加1/500稀释的血清样本，每孔加50μl，做两个重复；ELISA实验的其它操作步骤与前面相同。

7中和试验

中和试验的操作步骤及评判标准请参见文献^[3]。EV71/G082和CA16/G08毒株每个孔添加100个TCID50的病毒，CA16/SZ05毒株每个孔添加50个TCID50的病毒。

8被动免疫及攻毒实验

两组初生ICR小鼠(年龄小于12h，每组小鼠均来自同一母鼠)分别腹腔注射(100μl/只)抗PBS或抗HBcPEP71血清。24h后，腹腔注射8×10⁷TCID50的CA16/G08毒株。对攻毒后的小鼠连续观察16天，每天记录其存亡情况并进行临床症状打分，临床症状评定标准为：0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。

实施例1HBcPEP71融合蛋白的表达及纯化

HBc分子的第77-83位氨基酸位于其α螺旋发夹结构的顶端，是形成HBc病毒样颗粒表面刺突的部分，也是HBc蛋白的主要免疫显性区(MajorImmunodominantRegion，MIR)。如图1-A所示，HBc分子MIR区的第77-83位氨基酸被替换为CA16的中和表位PEP71(FGEHLQANDLDYGQ；SEQIDNO.:1)，得到表达融合蛋白HBcPEP71的重组质粒，经测序确定序列正确。

Hbc的氨基酸序列为：

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNVGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC(SEQIDNO.:2)

HBcPEP71的氨基酸序列为：

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLETFGEHLQANDLDYGQGDLVVNYVNTNVGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC(SEQIDNO.:3)

将重组质粒pET8b-HBcPEP71转入E.coli表达菌株BL21，用IPTG诱导表达，并分别用HBc单抗和PEP71多肽抗血清通过Westernblot检测菌体中目的蛋白的表达，发现在IPTG诱导的菌体中可同时检测到HBc和PEP71特异性信号，而未经IPTG诱导的菌体里则没有(图1-B)，这些结果表明融合蛋白HBcPEP71正确表达。

将菌体超声破碎后，通过离心分为可溶性组分和包涵体，并用SDS-PAGE检测目的蛋白的分布，发现HBcPEP71在IPTG诱导后菌体的可溶性组分中有大量富集，而在包涵体中则只有少量分布(图1-C)，这些结果表明HBcPEP71主要以可溶性形式表达。将HBc和HBcPEP71分别纯化后，用SDS-PAGE检测目的蛋白，都可以达到较高的纯度(图2)。

图1显示了HBcPEP71在E.coli中的表达。(A)融合蛋白HBcPEP71的表达质粒图谱。(B)分别取10μlIPTG诱导的和未诱导的菌液，加上样缓冲液，在100℃煮10min后在12％SDS-PAGE上分离并转印到PVDF膜，之后用HBc单抗和PEP71抗血清进行Westernblot检测。M：Marker；泳道1：未诱导菌体；泳道2：IPTG诱导菌体。(C)分别取1mlIPTG诱导的和未诱导的菌体，用100μlPBS重悬，进行超声破碎，离心后将可溶性组分和包涵体分别在12％SDS-PAGE分离后进行考马斯亮蓝染色。M：Marker；泳道1：未诱导菌体可溶性组分；泳道2：诱导菌体的可溶性组分；泳道3：未诱导菌体的包涵体；泳道4：诱导菌体的包涵体。

图2显示了纯化后HBcPEP71蛋白的SDS-PAGE检测结果。各取2μg纯化后HBc和HBcPEP71，加SDS上样缓冲液，在100℃煮10min，在12％SDS-PAGE上分离后进行考马斯亮蓝染色。M：Marker；泳道1：HBc；泳道2：HBcPEP71。

实施例2HBcPEP71融合蛋白组装为嵌合病毒样颗粒

为了鉴定HBcPEP71的组装情况，将纯化后的蛋白铺到10-50％蔗糖密度梯度最上层，进行超速离心，之后从上至下取10个组分，用HBc特异性单抗进行WesternBlot检测。如图3-A所示，与未经改造的HBc一致，HBcPEP71融合蛋白信号在靠后的几个组分中有特异性信号，并且第7个组分的信号最强，说明HBcPEP71以颗粒形式存在。为了检测表位PEP71在HBcPEP71颗粒表面的展示情况，用PEP71特异性血清通过ELISA检测各组分，发现HBcPEP71可被PEP71特异性血清较好识别，而HBc则不能(图3-B)，并且与WesternBlot结果一致，第7个组分的信号最强。为了得到HBcPEP71形成病毒样颗粒的直接证据，对HBc和HBcPEP71进行负染，并用透射电镜进行观察，如图3-C,D所示，可清晰看到HBcPEP71形成了与HBc类似的直径约为30nm的颗粒。这些结果证明，插入CA16中和表位PEP71的HBc融合蛋白能成功组装成颗粒，并将外源表位展示在颗粒表面。

图3显示了HBcPEP71嵌合病毒样颗粒的组装。将40μg纯化的HBc和HBcPEP71分别加到10-50％蔗糖密度梯度最上层，进行超速离心后等体积取10个组分，分别取20μl样品在12％的SDS-PAGE上分离后用HBc单抗进行WesternBlot分析(A)或者将各组分样品包被到96孔板(每个孔包被1μl样品)，用PEP71特异性血清进行ELISA分析(B)。所示数据为两个复孔OD450nm读数的平均值。(C)HBcVLPs的电镜分析，(D)HBcPEP71VLPs的电镜分析，Bar＝50nm。

实施例3HBcPEP71免疫小鼠血清能够中和CA16

用3组(6只/组)6-8周龄的雌性ICR小鼠检测嵌合VLPs的免疫原性，各组小鼠分别腹腔注射铝佐剂吸附的PBS，HBc或HBcPEP71，其中HBc和PBS组为对照。测定四免后两周各组小鼠的混合血清对CA16/SZ05的中和活性，发现PBS和HBc组的免疫血清在1:8稀释时都没有中和活性，而HBcPEP71组的免疫血清的中和效价为16(表1)。进一步测定单只小鼠血清对CA16/SZ05的中和活性，结果显示6只HBcPEP71免疫小鼠中有2只的血清在1/8稀释时没有中和，另外四只的中和效价最低为8，最高为64(图4)。本发明人还测定了混合血清对另一病毒株CA16/G08的中和活性，结果显示PBS和HBc组的混合血清不能够中和CA16/G08，而HBcPEP71的中和效价为8(表1)。以上结果表明HBcPEP71免疫能够诱导出针对CA16的中和抗体。

表1.四次免疫后各组小鼠混合血清的中和活性测定

最低血清稀释度为1:8。

图4显示了HBcPEP71免疫小鼠血清对CA16的中和活性。在第0，2，4和6周对ICR小鼠进行腹腔免疫(10μg/只)，第8周采血，将各组小鼠血清从1:8稀释开始，按2倍梯度系列稀释后测定对CA16/SZ05毒株的中和能力。图中每个符号代表一只小鼠，为了方便计算，将1:8稀释不能产生保护的血清的中和滴度定为4，横线表示各组小鼠血清中和滴度的几何平均数。

实施例4HBcPEP71免疫血清在体内能够抵抗CA16病毒攻击

两组1日龄ICR初生小鼠分别腹腔注射PBS(对照)或HBcPEP71组混合血清(100μl/只)，24h后腹腔注射CA16/G08病毒(8×10⁷TCID₅₀/只)，病毒攻击后对小鼠的存亡及临床症状进行连续16天的观察和记录。注射PBS组抗血清的小鼠从攻毒后第3天开始逐渐显示临床症状，在第8天达到最高平均临床等级打分，之后一直在2级症状附近徘徊；而HBcPEP71抗血清注射组在16天观察期间临床症状等级几乎一直接近或为0级(图5-B)。从死亡率上看，注射PBS组抗血清小鼠的最终死亡率为20％(15只中死亡两只)，而注射HBcPEP71组免疫血清的小鼠死亡率为零(12只全部存活)(图5-A)。这些结果表明，HBcPEP71免疫血清在体内具有预防CA16病毒感染的保护效果。

图5显示了HBcPEP71免疫血清的体内保护效果。两组1日龄的ICR小鼠先分别腹腔注射100μlHBcPEP71或PBS组混合血清，24h后再腹腔注射8×10⁷TCID50的CA16/G08毒株，之后每天观察记录攻毒小鼠的存亡(A)和临床症状等级(B)，连续16天。临床症状等级评定标准为：0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。

实施例5HBcPEP71免疫小鼠血清还能够中和EV71

本发明人还测定了各组小鼠混合血清对EV71/G082(C4基因型)的中和活性，结果显示PBS和HBc组免疫血清在1:8稀释时(最低稀释倍数)不能中和EV71/G082；意外的是，本发明人发现HBcPEP71免疫血清能够中和EV71/G082，中和效价为16(表1)。该结果提示HBcPEP71疫苗不仅能够预防CA16病毒感染，还能够预防EV71病毒感染，因此是一个兼抗EV71和CA16的双价疫苗。

对比例1融合蛋白HBcPEP32、HBcPEP37、HBcPEP63、HBcPEP91

融合蛋白的表达及及纯化

采用上述实施例中的方法，本发明人将HBc的MIR区分别替换为CA16的中和表位PEP32，PEP37，PEP63和PEP91，得到融合蛋白HBcPEP32，HBcPEP37，HBcPEP63，和HBcPEP91。为了制备上述各融合蛋白，本发明人分别构建了用来表达各融合蛋白的重组质粒，所得质粒经测序确定正确。表达出的融合蛋白，并分别用HBc单抗和PEP32，PEP37，PEP63，及PEP91表位特异性的抗血清通过Westernblot试验检测目的蛋白是否正确表达，实验结果表明所有融合蛋白均被正确表达。

中和表位PEP32氨基酸序列(SEQIDNO.:4)：

TMPTMGTQNTDGYAN

中和表位PEP37氨基酸序列(SEQIDNO.:5)：

WDIDLMGYAQLRRKC

中和表位PEP63氨基酸序列(SEQIDNO.:6)：

PAQVSVPFMSPASAY

中和表位PEP91氨基酸序列(SEQIDNO.:7)：

YLFKTNPNYKGNDIK

HBcPEP32氨基酸序列(SEQIDNO.:8)：

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLETMPTMGTQNTDGYANGDLVVNYVNTNVGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC；

HBcPEP37氨基酸序列(SEQIDNO.:9)：

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLENWDIDLMGYAQLRRKGDLVVNYVNTNVGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC

HBcPEP63氨基酸序列(SEQIDNO.:10)：

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEPAQVSVPFMSPASAYGDLVVNYVNTNVGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC

HBcPEP91氨基酸序列(SEQIDNO.:11)：

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEYLFKTNPNYKGNDIKGDLVVNYVNTNVGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC

在低温(18℃)和低IPTG浓度(0.025mM)条件下诱导表达含CA16中和表位的各融合蛋白，并用SDS-PAGE进行，结果显示，HBcPEP32，HBcPEP63和HBcPEP71在菌体可溶性组分中有大量富集，而HBcPEP37和HBcPEP91则几乎只存在于包涵体中。

融合蛋白的组装及表位展示

为了鉴定融合蛋白的组装情况，对融合蛋白进行纯化并将纯化后的蛋白用HBc特异性单抗进行WesternBlot检测，实验结果显示，各融合蛋白都组装成了颗粒形态。然后用表位肽特异性血清做ELISA检测，实验结果，HBcPEP32，HBcPEP63和HBcPEP71可分别被各自所展示多肽的特异性血清所识别，并且都与WesternBlot检测的结果一致。经透射电镜分析，可清晰看到各融合蛋白形成了直径约为30nm的颗粒。这些结果证明，插入CA16中和表位PEP32和PEP63的HBc融合蛋白都能组装成颗粒，并且将外源表位成功展示在颗粒表面。

免疫原性及抗血清在体外的中和活性

用雌性ICR小鼠检测嵌合VLPs的免疫原性，实验证明，HBcPEP32和HBcPEP63VLPs抗血清对CA16/SZ05毒株没有任何中和活性，但是对EV71/G082却有较弱的中和。

表2.第四次免疫后各组小鼠混合血清的中和测定

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

1.YeX,KuZ,LiuQ,WangX,ShiJ,ZhangY,KongL,CongY,HuangZ:Chimericvirus-likeparticlevaccinesdisplayingconservedenterovirus71epitopeselicitprotectiveneutralizingantibodiesinmicethroughdivergentmechanisms.JVirol2014,88(1):72-81.

2.ShiJ,HuangX,LiuQ,HuangZ:IdentificationofconservedneutralizinglinearepitopeswithintheVP1proteinofcoxsackievirusA16.Vaccine2013,31(17):2130-2136.

3.KuZ,YeX,HuangX,CaiY,LiuQ,LiY,SuZ,HuangZ:Neutralizingantibodiesinducedbyrecombinantvirus-likeparticlesofenterovirus71genotypeC4inhibitinfectionatpre-andpost-attachmentsteps.PLoSOne2013,8(2):e57601.

4.LiuQ,YanK,FengY,HuangX,KuZ,CaiY,LiuF,ShiJ,HuangZ:Avirus-likeparticlevaccineforcoxsackievirusA16potentlyelicitsneutralizingantibodiesthatprotectmiceagainstlethalchallenge.Vaccine2012,30(47):6642-6648.

5.LiuQ,KuZ,CaiY,SunB,LengQ,HuangZ:Detection,characterizationandquantitationofcoxsackievirusA16usingpolyclonalantibodiesagainstrecombinantcapsidsubunitproteins.JVirolMethods2011,173(1):115-120.

Claims (10)

1.一种抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽源自柯萨奇病毒的中和表位PEP71，并且所述的抗原表位肽长度为5-15个氨基酸，并且所述抗原表位肽与载体蛋白融合后所形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的免疫反应。

2.如权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽选自下组：

(a)具有SEQIDNO:1氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQIDNO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后所形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的免疫反应的由(a)衍生的多肽。

3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是如权利要求1中所述的抗原表位肽与载体蛋白融合所形成的。

4.一种结合分子，其特征在于，所述结合分子能可特异性结合权利要求1所述的的抗原表位肽或权利要求3所述的融合蛋白。

5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1的抗原表位肽或权利要求3所述的融合蛋白。

6.一种组合物，其特征在于，它含有：

(a)权利要求1所述的抗原肽或其药学上可接受的盐、或权利要求3所述的融合蛋白；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

8.如权利要求1所述的抗原肽、权利要求3所述的融合蛋白或权利要求4所述的结合分子的用途，其特征在于，用于制备检测手足口病病毒的试剂或试剂盒；或

用于制备预防或治疗手足口病病毒感染的药物。

9.一种免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1-2任一所述的抗原表位肽、权利要求3所述融合蛋白或权利要求4所述的结合分子。

10.一种制备权利要求3所述融合蛋白的方法，包括步骤：

(1)构建表达质粒

所述表达质粒中含有编码所述融合蛋白的核酸序列；

(2)融合蛋白的表达；

将所述质粒转入大肠杆菌BL21的感受态细胞进行表达。