CN103387615B - 一种基于HBc和EV71 VP4的手足口病疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种手足口病疫苗及其制备方法与应用。本发明所提供的手足口病疫苗的活性成分为多肽；所述多肽的核苷酸序列如序列表中序列1所示。实验证明，本发明所提供的多肽能够在大肠杆菌中自行组装成重组病毒样颗粒；并且该病毒样颗粒经过实验动物免疫后所得到的血清具有中和活性。

Description

一种基于HBc和EV71 VP4的手足口病疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种手足口病疫苗及其制备方法与应用，特别涉及一种将EV71 VP4蛋白整合到HBc中制备而成的手足口病疫苗及其应用。

背景技术

病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）是指由一个或多个结构蛋白组装而成的不含有病毒核酸的空心颗粒，保留了与天然病毒粒子相似的空间构型和抗原表位，具有很强的免疫原性。病毒样颗粒疫苗的出现为研发新型安全有效的疫苗提供了一个新的契机。乙肝病毒核心颗粒（HBc）因其在目前已知的几乎所有同源、异源表达系统，包括细菌中的高水平表达、高效的颗粒自组装能力及高强度的免疫原性，一直被视作分析展示外来肽链的最灵活也是最有希望的模型。

手足口病是全球性传染病（hand foot and mouth disease,HFMD），世界大部分地区均有此病流行的报道。人类是本病的主要传染源，主要是通过人群间的密切接触进行传播。青少年和成年人大多通过隐性感染已获得相应免疫能力。因此，患者主要集中在10岁以下儿童，其中5岁以下儿童比例最高。可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患儿可引起心肌炎、肺水肿、病毒性脑炎等致命性并发症（石燕.小儿手足口病诊治概述(综述)[J].中国城乡企业卫生,2009,(1).）。2010年卫生部的报告显示截至6月22日，全国即已累计报告手足口病病例987779例。重症15501例，死亡573例。仅半年时间重症及死亡人数已超过2009年全年的人数。自2008年起，我国已把手足口病列为丙类传染病，并要求24h内上报卫生部。手足口病的疯狂流行给我国人民身体健康、甚至生命安全，构成了严重威胁。凸显了寻找有效的预防手段和方法的重要性和紧迫性。

引起手足口病的病毒很多，其中以柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16，CoxA16）及肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）最为常见。通常情况下，EV71与CoxA16引起的手足口病在临床症状等方面难以区别，但EV71易致无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统相关性疾病，可危及生命。

肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员。EV71病毒由外层的衣壳和RNA核心构成。衣壳蛋白组成复杂，首先由VP1、VP2、VP3和VP4四种衣壳蛋白各单分子构成原聚体，再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，形成病毒的衣壳，为二十面体立体对称的球形结构。四种结构蛋白中，VP1、VP2和VP3裸露于病毒颗粒的表面，而VP4则包埋在病毒颗粒衣壳内侧与RNA核心紧密连接。因而传统意义上认为病毒的抗原决定簇基本上位于VP1~VP3上（Cardosa M J,Perera D,Brown B A,et al.Molecular epidemiology of humanenterovirus 71 strains andrecent outbreaks in the Asia-Pacific region:comparative analysis of the VP1 and VP4 genes[J].Emerg Infect Dis,2003,9(4):461-468.）。所以目前尚没有将VP4蛋白作为靶抗原研制EV71疫苗的相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗肠道病毒71型感染的多肽。

本发明所提供的多肽命名为HBc-VP4-N20，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

序列1由169个氨基酸组成，其中第79-98位为EV71 VP4蛋白自N末端起前20个氨基酸，其余的序列为全长HbcAg蛋白的编码序列。

所述多肽的衍生物也属于本发明的保护范围。所述衍生物具体EV71 VP4蛋白自N末端起前20个氨基酸，命名为VP4-N20，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

其中，序列2由20个氨基酸组成。

所述多肽或所述衍生物在制备下述任一产品中的应用也属于本发明的保护范围：

a）重组病毒样颗粒；

b）中和肠道病毒71型的产品；

c）预防和/或治疗手足口病的产品；

d）以a）所述重组病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗；

所述重组病毒样颗粒由所述多肽在生物体内自组装而成。

所述重组病毒样颗粒由所述多肽在生物体内自组装而成；在本发明的一个实施例中，所述生物具体为大肠杆菌。

本发明的另一个目的是提供活性成分为所述多肽或所述衍生物的如下产品：

a）重组病毒样颗粒；

b）中和肠道病毒71型的产品；

c）预防和/或治疗手足口病的产品；

d）以a）所述重组病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗；

所述重组病毒样颗粒由所述多肽在生物体内自组装而成；在本发明的一个实施例中，所述生物具体为大肠杆菌。

所述多肽或所述重组病毒样颗粒的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述制备方法可包括如下步骤：将所述多肽的编码基因导入目的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，裂解所述重组大肠杆菌，分离得到重组病毒样颗粒，所述重组病毒样颗粒即为所述多肽。

更为具体的，所述制备方法包括如下步骤：

1）将所述多肽的编码基因（序列4）克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；

2）用步骤1）得到的重组表达载体转化目的大肠杆菌，得到表达所述多肽的重组大肠杆菌；

3）裂解步骤2）得到的重组大肠杆菌，分离得到重组病毒样颗粒；所述重组病毒样颗粒即为所述多肽。

上述步骤1）中，所述多肽的编码基因为经过密码子优化的基因，具体可为按照如下方法得到：按照大肠杆菌偏爱密码子选择编码所述多肽的氨基酸密码子；当然，所述优化还包括对所述编码基因的其他改造，以适合在大肠杆菌中表达。本发明中使用的术语“偏爱密码子”具有本领域公知的含义，也称为密码子的偏好性（CodonPreference），是指某些生物体更偏爱使用某些同义三联密码子（即编码相同氨基酸的密码子）。

在本发明的一个实施例中，所述多肽的编码基因的核苷酸序列具体如序列表中序列4所示。为适合在大肠杆菌中表达，根据本发明描述的方法对所述多肽的编码基因进行改造获得的其他基因序列也属于本发明的保护范围。

所述多肽或所述衍生物的编码基因，或含有所述编码基因的重组载体、重组细胞、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围；所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

在本发明的具体实施例中，以上所有所述重组表达载体中，启动所述多肽的编码基因转录的启动子均为T7启动子；更为具体的，所述重组表达载体为在原核表达载体pET-22b(+)多克隆位点处插入所述多肽的编码基因所得的重组质粒，所述多克隆位点具体为Xho I和Nde I。

所述表达盒由能够启动所述多肽或所述衍生物的编码基因表达的启动子，所述多肽或所述衍生物的编码基因，以及转录终止子组成。在本发明的一个实施例中，所述启动子具体为T7启动子，所述转录终止子具体为T7终止子；当然根据实际需要也可以使用其他启动子和其他终止子。

在本发明的一个实施例中，所述多肽的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列4。

序列4由507个核苷酸组成，其中，第238-297位为EV71 VP4蛋白自N末端起前20个氨基酸的编码序列，其余的序列为全长HbcAg蛋白的编码序列。

实验证明，本发明所提供的多肽能够在大肠杆菌中自行组装成重组病毒样颗粒；并且该病毒样颗粒经过实验动物免疫后所得到的血清具有中和活性。

附图说明

图1为pET-22b(+)的质粒图谱。

图2为PCR扩增目的基因HBc-VP4-N20后的电泳验证图。其中，泳道M为DNAMarker；泳道1和2均为目的片段HBc-VP4-N20经PCR扩增后通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测的结果。

图3为重组质粒pET-22b(+)-HBc-VP4-N20经Xho I和Nde I双酶切后电泳验证图。其中，泳道1-3均为pET-22b(+)-HBc-VP4-N20经Xho I和Nde I双酶切后通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测的结果。

图4为PCR扩增出的融合前HBc基因两片段的电泳验证图。其中，泳道1和2均为HBc基因的下游片段，泳道3和4均为HBc基因上游片段。

图5为融合PCR产物HBc基因的电泳验证图。其中，泳道1-3均为融合PCR产物HBc基因。

图6为重组质粒pET-22b(+)-HBc经Xho I、Nde I双酶切后电泳验证图。其中，泳道1为重组质粒pET-22b(+)-HBc经Xho I和Nde I双酶切后通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测的结果；泳道2为重组质粒pET-22b(+)-HBc-VP4-N20经Xho I和Nde I双酶切后通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测的结果。

图7为目的蛋白经SDS-PAGE验证图。其中，泳道1为未经IPTG诱导的菌体蛋白表达结果；泳道2为IPTG诱导后未经纯化的结果；条带3为IPTG诱导表达的目的蛋白经Ni柱纯化后的结果。

图8为目的蛋白的Western Blotting验证图。其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1为HBc-VP4-N20蛋白；泳道2为HBc蛋白。

图9为通过透射电镜技术显现的重组病毒样颗粒（VLPs）的样品。其中，A为电镜下HBc颗粒形态；B为电镜下HBc-VP4-N20颗粒形态。

图10为ELISA法检测实验动物血清抗Hbcag-VP4-N20效价的结果图。

图11为ELISA法检测实验动物血清抗VP4-N20（合成多肽）效价的结果图。

图12为实验动物血清中和试验结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、HBc-VP4-N20多肽及其重组病毒样颗粒的制备

一、重组表达载体pET-22b(+)-HBc-VP4-N20的构建

1、HBc-VP4-N20多肽的设计

HBc-VP4-N20多肽的设计思路如下：将EV71 VP4蛋白相对保守的自N末端起前20个氨基酸（命名为VP4-N20，序列2）融合入HbcAg蛋白的第78-79位点之间，得到重组多肽。将该重组后的多肽命名为HBc-VP4-N20，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2、HbcAg-VP4-N20基因的优化

HbcAg-VP4-N20基因利用大肠杆菌（E.coli）密码子偏好性进行优化，即按照大肠杆菌偏爱密码子选择编码所述HBc-VP4-N20多肽的氨基酸密码子；当然，优化还包括对所述编码基因的其他改造，以适合在大肠杆菌中表达。优化后HbcAg-VP4-N20基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。序列4编码序列表中序列1所示HBc-VP4-N20蛋白。采用全基因合成（北京博迈德科技发展有限公司）序列4，并将其搭载于pGH质粒载体（北京博迈德科技发展有限公司），所得的重组质粒命名为pGH-HBc-VP4-N20。

3、重组表达载体pET-22b(+)-HBc-VP4-N20及pET-22b(+)-HBc的构建

（1）重组表达载体pET-22b(+)-HBc-VP4-N20的构建

根据HBc-VP4-N20目的基因片段的序列信息，及载体pET-22b(+)（Novagen公司，质粒图谱及多克隆位点核苷酸序列图如图1所示）的多克隆位点相关信息设计引物，选定酶切位点Xho I和Nde I，并通过引物设计软件Oligo7的设计得到上下游引物。

上游引物：5'-ggaattccatatggatattgatccgtataaag-3'（下划线处为限制性内切酶Nde I的识别序列，其后的序列为序列4的第4-22位）

下游引物：5'-ccgctcgagcaccacggtggtt-3'（下划线处为限制性内切酶Xho I的识别序列，其后的序列为序列4的第495-507位的反向互补序列）

以步骤2所得的重组质粒命名为pGH-HBc-VP4-N20为模板，用上述引物对进行PCR扩增。反应结束后，将PCR反应后产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

目的基因HBc-VP4-N20应为526b。PCR反应后产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，在500bp位置略微偏上处有明显的目的条带，这与预期结果相一致。这表明PCR反应过程及产物正确。

使用DNA片段纯化试剂盒（Takara公司）对PCR产物（HBc-VP4-N20目的基因片段）进行纯化。用限制性内切酶Xho I和Nde I（NEB公司）双酶切纯化后的HBc-VP4-N20基因，将其与经过相同双酶切的pET-22b(+)载体相连。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京天根生化科技有限公司），进行培养。挑取单克隆菌落，摇菌，采用质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）小量提取重组质粒。用限制性内切酶Xho I和Nde I（NEB公司）对重组质粒进行双酶切鉴定。

重组质粒经Xho I和Nde I双酶切后应得到一条长为511bp HBc-VP4-N20基因片段，一条长为5363bp的pET-22b(+)载体骨架片段。对重组质粒进行双酶切鉴定的结果如图3示，在500bp位置略微偏上处有一较浅的条带，这是HBc-VP4-N20基因；在6kb左右有明显条带，这是pET-22b(+)载体骨架片段。这一结果与预期相符，初步表明HBc-VP4-N20基因成功的插入到了原核表达载体pET-22b(+)的酶切位点Xho I和Nde I之间。进一步对所得的重组质粒进行测序鉴定。将经测序表明含有HBc-VP4-N20基因的重组质粒命名为pET-22b(+)-HBc-VP4-N20。

（2）重组表达载体pET-22b(+)-HBc的构建

根据HBc-VP4-N20目的基因片段的序列信息，及载体pET-22b(+)（Novagen公司，质粒图谱如图1所示）的多克隆位点相关信息设计引物，选定酶切位点Xho I和Nde I，并通过引物设计软件Oligo7的设计得到两组引物。

第一组:下游引物：5'-ggaattccatatggatattgatccgtataaag-3'（下划线处为限制性内切酶Nde I的识别序列，其后的序列为序列4的第4-22位）

正向引物：5'-accagttcgcggctcgccgg-atcttccagattgctgccca-3'（前20位为序列4的第295-314位的反向互补序列；后20位为序列4的第215-234位的反向互补序列）

第二组:反向引物：5'-tgggcagcaatctggaagat-ccggcgagccgcgaactg-3'（前20位为序列4的第215-234位；后18位为序列4的第295-312位）

上游引物：5'-ccgctcgagcaccacggtggtt-3'（下划线处为限制性内切酶Xho I的识别序列，其后的序列为序列4的第495-507位的反向互补序列）

以步骤2所得的重组质粒命名为pGH-HBc-VP4-N20为模板，用上述两对引物进行三次PCR，即融合并扩增HBc基因。第一次PCR反应采用第一组引物对；第二次PCR反应采用第二组引物对；第三次PCR反应采用上游引物和下游引物所组成的引物对。反应结束后，将PCR反应后产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

PCR产物HBc基因的上游目的片段长223bp，下游目的片段长244bp。经前两次PCR，得到融合前HBc的两基因片段，结果如图4所示，图中条带1、2为同一样品，条带3、4为同一样品。四个条带均在250bp左右位置，与预期实验结果相符。条带3、4相比条带1、2电泳迁移更远，为HBc基因的上游片段，而条带1、2为HBc基因下游片段。这表明两次PCR过程及产物正确。

PCR产物HBc基因的全长应为467bp。经第三次PCR，得到融合后HBc基因，结果如图5所示，在500bp偏下的位置得到目的条带，与预期实验结果相符。这说明融合PCR成功，初步验证得到正确的HBc目的基因。

使用DNA片段纯化试剂盒（Takara公司）对PCR产物（HBc目的基因片段）进行纯化。用限制性内切酶Xho I和Nde I（NEB公司）双酶切纯化后的HBc基因，将其与经过相同双酶切的pET-22b(+)载体相连。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京天根生化科技有限公司），进行培养。挑取单克隆菌落，摇菌，采用质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）小量提取重组质粒。用限制性内切酶Xho I和Nde I（NEB公司）对重组质粒进行双酶切鉴定。

重组质粒经Xho I和Nde I双酶切后应得到一条长为451bp HBc基因片段，一条长为5363bp的pET-22b(+)载体骨架片段。对重组质粒进行双酶切鉴定的结果如图6所示，在500bp位置偏下处有一较浅的条带，这是HBc基因；在6kb左右有明显条带，这是pET-22b(+)载体骨架片段。这一结果与预期相符，初步表明HBc基因成功的插入到了原核表达载体pET-22b(+)的酶切位点Xho I和Nde I之间。进一步对所得的重组质粒进行测序鉴定。将经测序表明含有HBc基因的重组质粒命名为pET-22b(+)-HBc。

二、HBc-VP4-N20融合蛋白或HBc蛋白的原核表达

1、转化BL21（DE3）细胞

将步骤3构建好的重组表达载体pET-22b(+)-HBc-VP4-N20和pET-22b(+)-HBc分别转化于E.coliBL21（DE3）感受态细胞（北京天根生化科技有限公司,产品目录号：CB105-01）中。具体实验步骤遵照产品说明书，如下：

1）取100μl E.coli BL21（DE3）感受态细胞置于冰浴中，用无菌吸头向感受态细胞悬液中加入pET22b-HBc-VP4-N20重组质粒1μl（50ng/μl），轻轻旋转混匀，冰浴30min。

2）将离心管置于42℃水浴中放置90s热激，然后快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却3min，该过程不要摇动离心管。

3）向离心管中加入900μl不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后置于37℃摇床上温育培养45min（150r/min），使菌体复苏。

4）将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞加到含氨苄青霉素（Amp）的LB固体琼脂培养基上，用无菌弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。

5）将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，于37℃电热恒温培养箱中培养过夜（12~16h）。

同理重复以上步骤将重组质粒pET22b-HBc转化至BL21（DE3）感受态细胞中。

2、种子液的制备与IPTG诱导表达

具体步骤如下：

1）挑取含重组质粒pET-22b(+)-HBc-VP4-N20的单克隆加入至5ml含氨苄青霉素（Amp）的液体LB培养基中，于37℃、180rpm条件下摇菌过夜（12~16h）。

2）次日清晨于锥形瓶中加入含氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基1L，按体积比1:400的比例取250μl种子液接种，于37℃、180rpm摇菌，实时监测菌液OD值。分别检测种子液经过摇菌培养不同时间后的OD600值，以寻找IPTG诱导的最佳时间，结果见下表：

诱导时间	菌液#1 OD600值	菌液#2 OD600值
			1h	0.065	0.076
1.5h	0.237	0.260
			2h	0.556	0.567

由上表数据可见，摇菌2h后菌液OD600值已至0.4~0.6，可以继续进行接下来的IPTG诱导操作。

3）菌液OD₆₀₀值至0.4~0.6时（约2小时左右）向锥形瓶中加入IPTG（北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号：CW0603）诱导，使IPTG终浓度约为0.1mM，再次于37℃、180rpm条件下摇菌5h，诱导目的蛋白HBc的表达。

同理重复以上步骤完成目的蛋白HBc的诱导表达。

3、超声裂解菌体

由前期实验分析得知，所获得的目的蛋白为可溶性表达无包涵体形成，故可直接将菌体裂解即可获得目的蛋白。具体操作步骤如下：

1）IPTG诱导完成后，分别将菌液于4℃、13000rpm离心1min收菌，小心弃去上清。

2）按10ml/g湿重比例加入平衡液（pH 8.0，50mM Tris，100mM NaCl，20mM咪唑）轻轻摇晃以重悬细菌。

3）将装有重悬菌液的50ml离心管置于冰上，在超声裂解仪下超声裂解15min直至菌液澄清透亮。

4）将超声裂解后的菌液于4℃、13000rpm下离心15min，保留上清。

5）将上清液经过0.22μm的滤膜过滤以备纯化。

三、HBc-VP4-N20融合蛋白或HBc蛋白的纯化

1、镍（Ni）柱分离纯化重组蛋白

1）首先用洗脱液（pH8.0，50mM Tris，100mM NaCl，500mM咪唑）冲洗Ni柱至OD280、电导率均至最高水平并保持持平，再用平衡液（pH8.0，50mM Tris，100mMNaCl，20mM咪唑）洗柱至OD280、电导率至最低水平并保持持平。

2）上样，流速为1ml/min。

3）上样完毕立即用结合液（pH8.0，50mM Tris，100mM NaCl，40mM咪唑）淋洗Ni柱，去除非特异性结合的蛋白，直至OD280、电导率数值稳定。

4）用梯度浓度的洗脱液洗脱目的蛋白，从出峰起开始接收组分直至出峰结束。

2、超滤纯化重组蛋白

1）先加入纯水浸泡100kD超滤管（Millipore，产品目录号：MFC910008，购自北京欣经科生物技术有限公司）中的滤膜约0.5h以活化滤膜，离心后将水弃去。

2）在超滤管中加入纯化后蛋白样品15ml，于5000g离心10min，离心后滤膜上液体量应不低于1.5ml，弃去滤膜下超滤管中的液体。重复此步骤直至将蛋白样品超滤完成。

3）在超滤管中加入PBS溶液10ml，于5000g离心10min，弃去滤膜下超滤管中的液体，重复此步骤5-8次。

4）最后将滤膜上液体吸出转移至15ml离心管中用于分装，于-80℃下保存。

四、HBc-VP4-N20融合蛋白或HBc蛋白的验证

1、SDS-PAGE验证目的蛋白

对IPTG诱导表达出的蛋白进行SDS-PAGE验证，具体步骤如下：

1）先将10%的分离胶（Separating Gel）配好后，加入至凝胶槽中，加入75%酒精压线。待胶凝固后，用枪小心将酒精吸出。用纸将残余酒精吸干，加入5%积层胶（Stacking Gel）至胶槽上沿，吸出泡沫，并小心将梳子插入，静置使胶凝固。

2）将各蛋白样品（未经IPTG诱导的蛋白样品，经IPTG诱导纯化前的蛋白样品，以及经IPTG诱导纯化后的蛋白样品）分别和5×Loading buffer（蛋白marker中提供）混合，煮沸5min，瞬时离心混匀后上样到SDS聚丙烯酰胺凝胶中，最后在凝胶的最左侧加入蛋白marker（Fermentas，产品目录号：SM0671）。

3）在电泳槽中加入Running buffer，并吸出泡沫，于100V电压下跑电泳约1.5h。

4）电泳结束后，将PAGE胶（8cm×10cm）取出放置在一玻璃皿中，加入50ml去离子水，加热至沸腾后停止。

5）加入20ml~25ml考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液（北京天根生化科技有限公司，产品目录号：PA101-01），使整个凝胶浸染于其中，加热至沸腾后保持沸腾状态30~60s，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5~10min，弃去染液。

6）加入约50ml去离子水，加热至沸腾后保持沸腾状态30~60s，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5~10min，换水即可完成脱色。

7）将胶取出，在凝胶成像分析系统下观察电泳情况。

pET-22b(+)载体上在终止密码子之前、目的基因插入位点之后自带有6个His的标签，所以诱导表达出来的目的蛋白HBc-VP4-N20大小应为177个氨基酸，一个氨基酸的平均分子量约为110道尔顿（Da），所以由此计算出目的蛋白HBc-VP4-N20的分子量大小约为19.5kDa。同理，HBc蛋白共157个氨基酸，计算目的蛋白HBc的分子量大小约为17.3kD。

目的蛋白HBc-VP4-N20经纯化前后的SDS-PAGE结果如图7所示，经IPTG诱导表达后在17kDa偏上处得到一明显目的条带，即为目的蛋白HBc-VP4-N20（泳道2）；IPTG诱导表达的目的蛋白经Ni柱纯化后，在17kDa偏上处可见唯一明显目的条带（泳道3）。这说明目的蛋白HBc-VP4-N20诱导表达成功且纯化效果较好。

2、Western Blotting检测目的蛋白

1）先将10%的分离胶（Separating Gel）配好后，加入至凝胶槽中，加入75%酒精压线。待胶凝固后，用枪小心将酒精吸出，用纸将残余酒精吸干，加入5%积层胶（Stacking Gel）至胶槽上沿，吸出泡沫，并小心将梳子插入，静置使胶凝固。

2）将纯化后的蛋白样品（HBc-VP4-N20融合蛋白或HBc蛋白）和5×Loading buffer（蛋白marker中提供）混合，煮沸5min，瞬时离心混匀后上样到SDS聚丙烯酰胺凝胶中，最后在凝胶的最左侧加入蛋白marker（Fermentas,产品目录号:SM0671）。

3）在电泳槽中加入电泳缓冲液，并吸出泡沫，于100V电压下跑电泳约1.5h。

4）半干法转膜：根据胶的大小，将PVDF膜（Bio-Rad，产品目录号：#162-0177）和滤纸剪好，PVDF膜要稍大于滤纸。用无水甲醇浸泡PVDF膜15秒。将膜、滤纸等摆好，顺序依次为滤纸、膜、胶、滤纸，中间不可有气泡，按1mA/cm2根据膜的面积大小调整电流，本实验使用的电流为18mA。转膜40min。

5）转膜后将膜取出置于封闭液（市售脱脂奶粉溶于PBS中，浓度为5%）中，于室温下封闭反应3h。

6）加入稀释后抗His标签鼠单克隆抗体一抗（北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号：CW0286）5ml，一抗与封闭液的比例为1:1000，在摇床上慢摇反应过夜。

7）将一抗吸出，将膜置于玻璃皿中，用PBST洗3次，每次10min，并用摇床慢摇。

8）加入羊抗鼠二抗（KPL，产品目录号：072-07-18-06），稀释比例为1:10000，加入后在摇床上避光孵育45min。

9）将二抗吸出，将膜置于玻璃皿中，用PBST洗2次，再用PBS洗膜1次，每次10min，并用摇床慢摇。

10）将PVDF膜置于PBS溶液中，在Odyssey红外荧光扫描成像仪下观察分析结果。

结果如图8所示，在泳道1约19.5kD的位置上可见较亮的目的条带，为HBc-VP4-N20蛋白；在泳道2约17.3kD的位置上可见较亮的目的条带，为HBc蛋白。这进一步说明经上述表达纯化出的蛋白为目的蛋白，且产量较高。

3、透射电子显微镜观察HBc-VP4-N20和HBc蛋白

1）将封口膜固定于试验台上，滴10μl蛋白样品（HBc-VP4-N20或HBc蛋白）于封口膜上，将230目铜网浸入样品中，静置1min，取出，吸干铜网表面液滴

2）将铜网浸于2%磷钨酸中，45s后取出吸干，留待观察。

3）将已完成负染色的电镜样品送电镜（HITACHI-7650）观察重组病毒样颗粒的形态。

电镜结果见图9，透射电镜下观察HBc或HBc-VP4-N20蛋白，可见看到直径30nm左右的球形颗粒，形态大小与文献报道一致。这证明HBc和VP4-N20蛋白都得到有效表达，并且在大肠杆菌中自行组装成病毒样颗粒。

实施例2、实施例1所得HBc-VP4-N20蛋白或HBc蛋白的动物免疫试验

试验动物：15只雌性健康的BALB/c小鼠（北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物质量合格证明许可证编号：SCXK(京)2009-0007），鼠龄为6-8周，饲养于中国中医科学院中药研究所新药研发中心动物房。

一、动物免疫

将15只小鼠分为3个实验组，每组5只，编号分别为HBc组、HBc-VP4-N20组、PBS组。

首次免疫（0周），HBc组每只小鼠注射实施例1制备并纯化的HBc蛋白50微克（50微升），采用弗氏完全佐剂（Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇中国，产品目录号：F5881）等体积混合；HBc-VP4-N20组每只小鼠注射实施例1制备并纯化的HBc-VP4-N20蛋白50微克（50微升），采用弗氏完全佐剂等体积混合；PBS组每只小鼠注射100微升PBS溶液。注射方式均采用皮下注射。

加强免疫（2周、5周），HBc组每只小鼠注射实施例1制备并纯化的HBc蛋白25微克（50微升），采用弗氏非完全佐剂（Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇中国，产品目录号：F5506）等体积混合；HBc-VP4-N20组每只小鼠注射实施例1制备并纯化的HBc-VP4-N20蛋白25微克（50微升），采用弗氏非完全佐剂等体积混合；PBS组每只小鼠注射100微升PBS溶液。注射方式均采用皮下注射。

二、免疫动物的血清采集

通过小鼠眼眶内眦采集实验动物血清，血清采集的周数为0、2、4、6、8、10、12周。每次采血完毕后室温静置2-3小时，待实验动物血液凝固后以5000g、10min离心，收获血清，分装，保存于-80℃以备血清学检测。

三、ELISA法检测实验动物血清抗Hbc-VP4-N20效价

（1）抗原包被：将存于-80°C中的实施例1制备并纯化的Hbc-VP4-N20蛋白取出放在冰上融化，检测蛋白浓度。用包被稀释液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号：ELA-0011）稀释Hbc-VP4-N20蛋白，保证96孔酶标板（NMNC，MAXISORP，产品目录号：442404，购自于北京中生华美科技有限公司）每孔蛋白总量为200ng。每孔包被液总体积为100μl。用封口膜封闭板子4°C过夜包被。

（2）洗涤：将已包被板中的液体吸净并拍干。每孔中加入100μl的ELISA洗涤液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号：ELA-0021），置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复洗涤两遍即可。

（3）封闭：每孔中加入200μl的ELISA封闭液（BSA Blocking Buffer，北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号：CW0054），37°C孵育1小时。

（4）洗涤：将已封闭板中的液体吸净并拍干。每孔中加入100μl的ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复洗涤两遍即可。

（5）实验动物抗血清孵育：将步骤二采集的血清用含10%FBS（invitrogen，产品目录号：16000-044，购自于北京茂健联星科技有限公司）的PBS进行稀释，起始稀释倍数为10倍，之后采用2倍稀释法进行稀释。每孔中加入稀释好的抗血清100μl。待测孔中加入Hbc-VP4-N20组实验动物抗血清、阴性孔中加入PBS组实验动物抗血清、空白对照中加入等量的稀释液（含10%FBS的PBS）。37°C孵育1h。

（6）洗涤：将板中的抗血清吸净并拍干。每孔中加入100μl的ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复洗涤两遍即可。

（7）二抗孵育：将羊抗鼠二抗（Goat Anti-Mouse IgG HRPConjugated，北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号：CW0102）用含10%FBS的PBS进行稀释，稀释倍数为2000。每孔中加入稀释好的二抗100μl。37°C孵育1h。

（8）洗涤：将板中的二抗吸净并拍干。每孔中加入100μl的ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复洗涤两遍即可。

（9）显色：将板中的残余液体吸净并拍干。每孔中加入100μl的TMB底物溶液（北京天根生化科技有限公司，产品目录号：PA107-01）。37°C孵育20min。向每孔中加入100μl ELISA终止液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号：ELA-0031）。将酶标板置于酶标仪中，450nm、630nm双波长读取OD值。

（10）数据处理：数据的处理采用P/N值大于2.1即为阳性结果，血清效价为阳性结果的最低稀释倍数。

ELISA结果见图10，可见在第三次免疫后，即第二次加强后血清抗Hbc-VP4-N20效价升至最高。

四、ELISA法检测实验动物血清抗VP4-N20效价

（1）抗原包被：将存于-20°C中的VP4-N20抗原多肽（序列2，由中科亚光合成、干粉状、1mg/管)取出放在离心机上离心。用1ml PBS溶液溶解1mg干粉状抗原多肽（1mg/ml）。充分溶解后分装。用包被稀释液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号：ELA-0011）稀释蛋白抗原到相应的浓度。保证96孔酶标板（NMNC，Immobilizer-氨基酶标板，产品目录号：436006，购自于北京中生华美科技有限公司）每孔蛋白总量为1μg。每孔包被液总体积为100μl。用封口膜封闭板子4°C过夜包被。

（2）洗涤：将已包被板中的液体吸净并拍干。每孔中加入100μl的ELISA洗涤液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号：ELA-0021），置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复洗涤两遍即可。

（3）封闭：每孔中加入100μl的ELISA封闭液（10mM乙醇胺，100mM碳酸钠，pH 9.6），37°C孵育1小时。

（4）洗涤：将已封闭板中的液体吸净并拍干。每孔中加入200μl的ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复洗涤两遍即可。

（5）实验动物抗血清孵育：将抗血清用含10%FBS的PBS进行稀释，起始稀释倍数为10倍，之后采用2倍稀释法进行稀释。每孔中加入稀释好的抗血清100μl。待测阳性孔中加入Hbc-VP4-N20组实验动物抗血清、阴性孔中加入Hbc组实验动物抗血清、空白对照中加入等量的稀释液（含10%FBS的PBS）。37°C孵育1h。

（6）洗涤：将板中的抗血清吸净并拍干。每孔中加入100μl的ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复洗涤两遍即可。

（7）二抗孵育：将羊抗鼠二抗（Goat Anti-Mouse IgG HRP Conjugated，北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号：CW0102）用含10%FBS的PBS进行稀释，稀释倍数为2000。每孔中加入稀释好的二抗100μl。37°C孵育1h。

（8）洗涤：将板中的二抗吸净并拍干。每孔中加入100μl的ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复洗涤两遍即可。

（9）显色：将板中的残余液体吸净并拍干。每孔中加入100μl的TMB底物溶液（北京天根生化科技有限公司，产品目录号：PA107-01）。37°C孵育20min。向每孔中加入100μl ELISA终止液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号：ELA-0031）。将酶标板置于酶标仪中，450nm、630nm双波长读取OD值。

（10）数据处理：数据的处理采用P/N值大于2.1即为阳性结果，血清效价为阳性结果的最低稀释倍数。

ELISA结果见图11，可见在第三次免疫后，即第二次加强后血清抗VP4-N20效价升至最高。

五、实验动物血清中和试验

EV71病毒毒株FY-02T（郝春生,赵敏,张晨，等.肠病毒71型空斑检测方法的建立[J].中国生物制品学杂志,2009,(10).）。

（1）将存于－80°C分装好的EV71病毒毒株FY-02T和存于－20°C的小鼠血清取出在4°C中缓慢融化。

（2）将小鼠血清于60℃加热灭活补体30min。

（3）稀释融化好的EV71病毒，保证稀释后每50μl液体中含有100倍CCID50（cellculture infective dose 50%，细胞培养半数感染量）病毒。稀释液为细胞维持液，即含有2%FBS（invitrogen，产品目录号：16000-044，购自于北京茂健联星科技有限公司）的MEM Hank's（invitrogen，产品目录号：11575-032，购自于北京茂健联星科技有限公司）。

（4）稀释融化好的小鼠血清，将血清用含2%FBS的MEM Hank's进行稀释，起始稀释倍数为10倍，之后采用2倍稀释法进行稀释。

（5）在细胞培养用96孔板中（greinerbio-one，产品目录号：655180）加入50μl病毒稀释液和50μl血清系列稀释液，混合后放入37℃孵育8小时。病变阳性孔中只加病毒不加血清，血清对照孔中只加血清不加病毒，阴性孔中病毒、血清均不加入。

（6）孵育完成后，每孔加RD细胞（中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，资源编号：3111C0001CCC000293）悬液100μl（15000个/孔），36℃培养。

（7）使用倒置显微镜每天观察细胞病变情况并记录，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当病变阳性孔中出现完全病变时，判定最终结果（约5~7d）。

中和试验结果见图12，可见在第三次免疫后，即第二次加强后血清中和效价升至最高。

Claims (6)

1.多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.权利要求1所述多肽的衍生物，其特征在于：所述衍生物的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.权利要1所述多肽或权利要求2所述衍生物在制备下述任一产品中的应用：

a)重组病毒样颗粒；

b)中和肠道病毒71型的产品；

c)预防和/或治疗手足口病的产品；

d)以a)所述重组病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗；

所述重组病毒样颗粒由权利要求1所述多肽在生物体内自组装而成。

4.活性成分为权利要求1所述多肽或权利要求2所述衍生物的如下任一产品：

a)重组病毒样颗粒；

b)中和肠道病毒71型的产品；

c)预防和/或治疗手足口病的产品；

d)以a)所述重组病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗；

所述重组病毒样颗粒由所述多肽在生物体内自组装而成。

5.权利要求1所述多肽，或权利要求3或4中步骤a)所述重组病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：将所述多肽的编码基因导入目的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，裂解所述重组大肠杆菌，分离得到重组病毒样颗粒，所述重组病毒样颗粒即为所述多肽。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述多肽的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4所示。