CN104560896A - 一种在大肠杆菌中表达ms2假病毒颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在大肠杆菌中表达MS₂假病毒颗粒的方法，该方法将MS₂噬菌体外壳蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包装位点基因序列依次连接到没有引导肽序列的原核表达载体中，得到重组载体，该重组载体能够在大肠杆菌中表达MS₂噬菌体假病毒颗粒，且具有很高的表达量。

Description

一种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗粒的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在大肠杆菌中表达MS₂假病毒颗粒的方法。

背景技术

大肠杆菌MS₂噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3659bp，由编码成熟酶蛋白(或A蛋白)、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子的基因组成，每个MS₂噬菌体病毒颗粒中包含180拷贝的外壳蛋白，一拷贝的成熟蛋白，及一分子的基因组RNA。研究发现将MS₂噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因以及包含基因调控序列的5′非编码序列克隆到表达载体中，经过诱导表达后能够得到和野生噬菌体形态相同的病毒样颗粒（virusal like particle,VLP），该颗粒内部包裹有RNA分子，且具有耐核酸酶的特性^[2,3,4]。如果将外源基因片段插入到成熟酶包装位点的下游，表达载体表达时将噬菌体基因和外源基因转录成重组RNA，同时外壳蛋白进行包装，得到可以包裹重组RNA的病毒样颗粒，即Armored RNA病毒样颗粒。Armored RNA病毒样颗粒被广泛应用于RNA病毒检测中质控品的构建，此外该病毒外壳还被作为疫苗载体使用，被用于一些病原微生物抗原表位表面展示的载体。研究人员在应用该载体构建高致病性H5N1禽流感病毒多肽疫苗时发现，按照现有技术（Pickett G G，Peabody D S.Encapsidation ofheterologous RNAs by bacteriophage MS₂coat proein[J].Nucleic Acids Res,1993,21(19):4621-4626.；Cheng Yangjian,Niu Jianjun,Zhang Yongyou,et al.Preparation of His-Tagged armored RNA phage particles as a control for real-timereverse transcription-PCR detection of severe acute respiratory syndromecoronavirus[J].Journal of clinical microbiology,2006,44(10):3557-3561；窦敏，张国广，于广福，等。含口蹄疫病毒IRES RNA病毒样颗粒表达载体的构建[J]。中国生物工程杂志，2007，27（9）：31-35）构建的载体在大肠杆菌细胞内诱导表达假病毒颗粒时产量较低，上述文献中均采用将MS₂噬菌体整个基因组利用PCR扩增后连接入原核表达载体pET32a或pET28a等原核表达载体的多克隆位点，这种载体在导入大肠杆菌细胞进行诱导表达时候有几个限制因素会影响假病毒颗粒相关蛋白的表达，首先从MS₂噬菌体基因组结构分析外壳蛋白是位于成熟酶蛋白的下游，原核载体蛋白表达时一般上游的基因先翻译表达，下游的基因后表达，但位于上游的成熟酶蛋白一个病毒颗粒中只需要一个拷贝，若其过多表达肯定对下游的外壳蛋白基因的表达有一定影响，而每一个病毒颗粒的衣壳构成中需要180个拷贝的外壳蛋白，成熟酶蛋白只需要一个拷贝，显然要使表达载体多表达出假病毒颗粒，则外壳蛋白基因的大量表达是前提，原文献这种构建方式显然影响了pET32a等原核表达载体对克隆到其多克隆位点的噬菌体外壳蛋白基因的表达能力。其次MS₂噬菌体基因组插入的是原核表达载体的多克隆位点处，而所使用的原核表达载体多克隆位点前都有较长的引导肽序列，这些引导肽的合成会消耗掉原核细胞的部分翻译能力，也势必影响其下游基因的合成。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种在大肠杆菌中表达MS2假病毒颗粒的方法。

本发明的技术方案如下：

一种在大肠杆菌中表达MS₂假病毒颗粒的方法，包括如下步骤：

（1）合成下列引物：

CP-F（SEQ ID NO1）：

5′-GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3′

CP-R（SEQ ID NO2）：

5′-GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3′

MP-F（SEQ ID NO3）：

5′-GCGGATCCTCCTAGGAGG TTTGACCTGT-3′

MP-R（SEQ ID NO4）：

5′-GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3′

Pac-F（SEQ ID NO5）：

5′-GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG-3′

Pac-R（SEQ ID NO6）：

5′-CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3′；

（2）用引物CP-F和CP-R通过PCR扩增出MS₂噬菌体的外壳蛋白基因序列；用引物MP-F和MP-R通过PCR扩增出MS₂噬菌体的成熟酶基因序列；用引物Pac-F和Pac-R通过PCR扩增出MS₂噬菌体的包装位点基因序列；

（3）将上述外壳蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包装位点基因序列依次连接到没有引导肽序列的原核表达载体中，得到重组载体；

（4）将重组载体转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，再依次收集菌体、破碎菌体、离心、取上清液、过滤及纯化，即得所述MS₂假病毒颗粒。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（3）具体包括如下步骤：

a、对所述没有引导肽序列的原核表达载体和上述外壳蛋白基因序列用NheI和BamHI双酶切，再连接形成第一中间载体；

b、对上述第一中间载体和上述成熟酶基因序列用BamHI和HindIII双酶切，再连接形成第二中间载体；

c、对上述第二中间载体和上述包装位点基因序列用HindIII和NotI双酶切，再连接形成所述重组载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述没有引导肽序列的原核表达载体为pET21a。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（4）的大肠杆菌为BL21。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（2）的PCR的模板为pMS₂7。

本发明的有益效果是：

本发明的方法将MS₂噬菌体外壳蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包装位点基因序列依次连接到没有引导肽序列的原核表达载体中，得到重组载体，该重组载体能够在大肠杆菌中表达MS₂噬菌体假病毒颗粒，且具有很高的表达量。

附图说明

图1为本发明的实施例1构建的重组载体的序列结构图，其中RBS为核糖体结合位点，pac指噬菌体包装位点；

图2为本发明的实施例2的SDS-PAGE实验结果图，其中1——对照载体pCPES未加IPTG诱导，2——对照载体pCPES加IPTG诱导（箭头所示为诱导表达蛋白条带），3——pET21a-CMPc载体未加IPTG诱导，4——pET21a-CMPc载体加IPTG诱导（箭头所示为诱导表达蛋白条带），M——Marker；

图3为本发明的实施例4中表达的MS₂假病毒颗粒的扫描电镜照片；

图4为本发明的实施例5中RNase和/或DNase消化pET21a-CMPc载体的电泳照片。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

下述实施例中的pCPES来自于文献“窦敏，张国广，于广福，等。含口蹄疫病毒IRES RNA病毒样颗粒表达载体的构建[J]。中国生物工程杂志，2007，27（9）：31-35”构建，该载体是将大肠杆菌噬菌体的基因组构建在载体pET32a中，同时在大肠杆菌基因组后插入了口蹄疫的IRES片段基因。

pMS₂7质粒参见中国发明专利ZL200710008843.6。

BL21购自novagen公司。

实施例1

采用PCR扩增、酶切、连接等方法进行表达载体的构建；

（1）合成以下引物，引物由上海英骏生物公司合成，工具酶等购自大连宝生物公司：

CP-F：5′-GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3′

CP-R：5′-GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3′

MP-F：5′-GCGGATCCTCCTAGGAGG TTTGACCTGT-3′

MP-R：5′-GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3′

Pac-F：5′-GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG-3′

Pac-R：5′-CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3′

（2）以CP-F和CP-R为引物，以pMS₂7为模板（D.S.Pesbody教授惠赠），扩增出外壳蛋白基因序列，预计扩增片段长度为400bp左右，扩增体系为10×PCR buffer1.0μL，CP-F和CP-R（10μmol/L）均为0.5μL，dNTP0.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，质粒pMS₂71.0μL，超纯水补足总体积为20μL，反应程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳确定目的条带。PCR扩增出的特异性片段，用NheI和BamHI双酶切，先进行NheI酶切，酶切体系为PCR产物20μL，10×M buffer4μL，NheI3μL，超纯水补足至40μL体系，37℃酶切4h后，65℃15min终止反应，然后加入10×K buffer6μL，BamHI4μL，超纯水10μL，37℃酶切4h。酶切产物1%凝胶电泳分离后，紫外箱内切割目的条带。凝胶回收试剂盒回收酶切片段（上海华舜生物公司），凝胶回收步骤为1）在紫外灯下切取的相应待回收DNA片段，放入1.5mL的Ep管中，按100mg琼脂糖加入300μL S1液的比例加入S1液，置50-60℃温浴10min，为使胶充分溶解，每隔2min摇晃一次；若琼脂糖重量低于100mg，用水补齐至100mg。务必将琼脂糖充分溶解；2）如果回收片段小于300bp，则加入1/3S1体积的异丙醇，混匀，50-60℃放置1min，如果回收片段大于300bp，此步可跳过；3）将溶解液体加至吸附柱中，10000g离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附管放置同一个收集管中；4）在吸附柱中加入500μL W1液，10000g离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附管放于同一个收集管中；5）在吸附柱中加入500μL W1液，室温静置1min，10000g离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附管放于同一个收集管中；6）10000g离心1min，将吸附柱放于另一个干净的1.5mL EP管中，在吸附膜的中间加30μL T1液，静置1min，10000g离心1min，-20℃保存待用。如果室温低于20℃，可延长室温放置时间，或在37℃温浴1min，以保证DNA充分洗脱。回收的酶切DNA片段与同样酶切凝胶回收纯化（按照上述酶切PCR扩增DNA片段的步骤操作）的原核表达载体pET21a连接（Novagen公司产品），连接反应体系为(总体积为10μL)：pET21a载体片段1μL，T₄DNA连接酶1μL，10×T₄DNA buffer1μL，目的片段7μL，充分混合后16℃连接8h。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，感受态细胞制备程序为：1）挑取DH5α单克隆菌落至1mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜；2）吸取100μL过夜培养菌液，接种于20mL的LB培养基中，37℃振荡培养3-6h至OD₆₀₀为0.3-0.4左右；3）将菌液冰浴降温，转移至1.5mL的EP管中，4℃4000g离心3min；4）弃上清，加入1mL预冷0.1mol/LCaCl₂溶液悬浮沉淀，冰浴30min，4℃4000g离心5min；5)弃上清，加入40μL预冷0.1mol/L CaCl₂溶液，4℃放置12h后使用，转化效率可达到最高；每次可大量制备感受态细胞，放置于-70℃保存待用。连接产物转化程序为：1）将40μL感受态细胞和5μL连接产物(如果是质粒，只要2μL)混合，4℃冰浴30min；2）42℃热休克90s，冰浴2min；3）加入360μL无抗性的LB培养液，37℃振荡培养45-60min；4)吸取200μL上述菌液涂布于具有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中。37℃培养12h，在选择培养液中挑取白色单克隆菌落，接种于5mL LB培养液中培养过夜，吸取少量菌液保种，然后用PCR或碱裂解法少量提取质粒DNA进行酶切鉴定，构建中间载体pET21a-CP（第一中间载体），载体构建完成后测序确认（上海英骏生物公司完成）；

（3）以MP-F和MP-R为引物，pMS₂7为模板（D.S.Pesbody教授惠赠），扩增出噬菌体成熟酶基因，预计扩增片段长度为1200bp左右，扩增体系为10×PCR buffer1.0μL，MP-F和MP-R（10μmol/L）均为0.5μL，dNTP0.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，质粒pMS₂71.0μL，超纯水补足总体积为20μL，反应程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸60s，共32个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳确定目的条带。PCR扩增出的特异性片段，用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系为PCR产物20μL，10×K buffer4μL，BamHI和HindIII均为3μL，超纯水补足至40μL体系，37℃酶切4h。酶切产物1%凝胶电泳分离后，紫外箱内切割目的条带。目的条带的凝胶回收操作与上述步骤一致。同样的BamHI和HindIII双酶切方法酶切载体pET21a-CP，酶切产物经过凝胶电泳分离、凝胶纯化回收凝胶回收操作与上述步骤一致，将PCR扩增酶切纯化后条带与酶切纯化载体pET21a-CP连接，连接体系pET21a-CP载体片段1μL，T₄DNA连接酶1μL，10×T₄DNA buffer1μL，PCR目的片段7μL，充分混合后16℃连接8h。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂抗性平板，挑选阳性克隆，酶切鉴定后测序确认，序列无误的命名为pET21a-CPMP载体（第二中间载体）。

（4）以Pac-F和Pac-R为引物，pMS₂7为模板（D.S.Pesbody教授惠赠），扩增出噬菌体包装位点基因片段，扩增体系为10×PCR buffer1.0μL，Pac-F和Pac-R（10μmol/L）均为0.5μL，dNTP0.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，质粒pMS₂71.0μL，超纯水补足总体积为20μL，反应程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸30s，共32个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳确定目的条带。扩增出的片段和载体pET21a-CPMP分别用HindIII和NotI双酶切，酶切体系为PCR产物20μL，10×K buffer2μL，10×BSA buffer4μL，HindIII和NotI均为3μL，超纯水补足至40μL体系，37℃酶切4h。酶切产物1%凝胶电泳分离后，紫外箱内切割目的条带。目的条带的凝胶回收操作与上述步骤一致。双酶切回收的两种产物进行连接，连接体系为pET21a-CPMP载体片段1μL，T₄DNA连接酶1μL，10×T₄DNA buffer1μL，PCR目的片段7μL，充分混合后16℃连接8h。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂抗性平板，挑选阳性克隆，酶切鉴定后测序确认，序列无误的命名为pET21a-CMPc载体（重组载体），该载体中基因的排列顺序如图1。

实施例2：

pET21a-CMPc载体及对照载体pCPES表达及PEG纯化：

将实施例1测序正确的原核表达载体pET21a-CMPc和原核表达载体pCPES分别转化表达菌株BL21（DE3），鉴定为阳性的克隆分别接种于加有氨苄青霉素的抗性LB培养基中，均振荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，诱导基因表达。诱导条件均设定为：温度37℃，转速为160r/min，诱导4h。诱导结束后分别离心收集两种菌体细胞，各加入1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体至溶液清亮，然后12000r/min离心15min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，滤液中溶解有大量原核表达出的MS₂噬菌体假病毒颗粒。分别从两种滤液中吸取20μL，加入20μL1×蛋白上样缓冲液，100℃沸水中煮沸5min，分别取10μL进行SDS-PAGE电泳。两种表达载体pET21a-CMPc和pCPES外壳蛋白表达量的比较均通过SDS-PAGE电泳后，观察凝胶上外壳蛋白条带的亮度差异进行比较，条带粗的表达量大，条带弱的表达量小。如图2所示，实验结果表明本研究构建的表达载体pET21a-CMPc目的基因外壳蛋白的表达量远远大于传统载体的构建方式构建的pCPES载体。

实施例3

病毒样颗粒的纯化：

纯化采用PEG沉淀噬菌体颗粒的步骤（Joseph Sambrook,Russell David W.著，黄培堂等译。分子克隆实验指南[M]。第三版。北京：科学出版社，2002，186-187），并稍微修改进行纯化

（1）将实施例2中超声波破碎过滤液放入37℃水浴中8h，利用细菌细胞自身的核酸酶消化过滤液中残存的RNA和DNA，病毒样颗粒因为具有耐RNase的特性，所以外壳蛋白包裹的RNA不被消化。

（2）加固体NaCl至浓度为1mol/L，冰浴1h。（加NaCl可以促使病毒样颗粒与细菌碎片分离，也是从聚乙二醇中有效沉淀病毒样颗粒所必需的。4℃12000r/min离心10min，以除去细菌碎片，将上清液转移到另一干净的离心管中。

（3）加固体聚乙二醇PEG8000至终浓度为10％（W/V），室温搅拌使其完全溶解，冰浴1h以使病毒样颗粒形成沉淀。

（4）4℃12000r/min离心10min，回收沉淀的病毒样颗粒，弃去上清并用纸吸去残存的液体。

（5）加适量的水到沉淀中，用枪头不停吸打使其充分混匀。然后加入等体积的氯仿振荡30s，以除去病毒样颗粒悬液里的聚乙二醇和细菌碎片。

（6）4℃5000r/min离心15min，分离有机相和水相，回收含病毒样颗粒的水相，即为纯化的病毒样颗粒，可以将得到的产物用PBS充分透稀，利用冷冻干燥进行假病毒颗粒溶液的浓缩。

实施例4

电镜观察原核表达的融合蛋白：

分别取10μL实施例3中纯化的假病毒颗粒样品加在铜网的碳膜上，经2％的磷钨酸染色5min，自然干燥2h。用JEM2100透射电子显微镜观察原核表达重组蛋白自主包装成的VLP颗粒，电镜观察结果见图3，透射电子显微镜下观察到表达的MS₂假病毒颗粒成圆形颗粒形状，大小25nm左右。

实施例5

病毒样颗粒的双酶消化实验：

分别取4份20μL的实施例3中纯化的假病毒颗粒：第一份不加酶，第二份加2U DNaseⅠ，第三份加100U RNaseA，第四份加100U RNaseA和2U DNaseⅠ。放于37℃水浴锅中保温1h，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测病毒样颗粒对核酸酶的耐受能力。结果表明所表达的假病毒颗粒对核酸酶有很好的耐受作用，能有效保护其内部包裹的RNA片段不受核酸酶的影响，两种酶作用1h后，琼脂糖凝胶上仍然能清楚观察到内部包裹的RNA的清晰条带（图4）。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (5)

1.一种在大肠杆菌中表达MS₂假病毒颗粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）合成下列引物：

CP-F：5′-GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3′

CP-R：5′-GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3′

MP-F：5′-GCGGATCCTCCTAGGAGGTTTGACCTGT-3′

MP-R：5′-GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3′

Pac-F：5′-GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG-3′

Pac-R：5′-CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3′；

（2）用引物CP-F和CP-R通过PCR扩增出MS₂噬菌体的外壳蛋白基因序列；用引物MP-F和MP-R通过PCR扩增出MS₂噬菌体的成熟酶基因序列；用引物Pac-F和Pac-R通过PCR扩增出MS₂噬菌体的包装位点基因序列；

（3）将上述外壳蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包装位点基因序列依次连接到没有引导肽序列的原核表达载体中，得到重组载体；

（4）将重组载体转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，再依次收集菌体、破碎菌体、离心、取上清液、过滤及纯化，即得所述MS₂假病毒颗粒。

2.如权利要求1所述的一种在大肠杆菌中表达MS₂假病毒颗粒的方法，其特征在于：所述步骤（3）具体包括如下步骤：

a、对所述没有引导肽序列的原核表达载体和上述外壳蛋白基因序列用NheI和BamHI双酶切，再连接形成第一中间载体；

b、对上述第一中间载体和上述成熟酶基因序列用BamHI和HindIII双酶切，再连接形成第二中间载体；

c、对上述第二中间载体和上述包装位点基因序列用HindIII和NotI双酶切，再连接形成所述重组载体。

3.如权利要求1所述的一种在大肠杆菌中表达MS₂假病毒颗粒的方法，其特征在于：所述没有引导肽序列的原核表达载体为pET21a。

4.如权利要求1所述的一种在大肠杆菌中表达MS₂假病毒颗粒的方法，其特征在于：所述步骤（4）的大肠杆菌为BL21。

5.如权利要求1所述的一种在大肠杆菌中表达MS₂假病毒颗粒的方法，其特征在于：所述步骤（2）的PCR的模板为pMS₂7。