CN101173252A - 披甲rna及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种披甲RNA及其制备方法。本发明提供一种披甲RNA，其特征在于，所述披甲RNA是由MS2包膜蛋白包裹的RNA。本发明还提供所述披甲RNA的制备方法。本发明提供的内含多种病毒RNA片段的披甲RNA和内含病毒负链或正链RNA的披甲RNA，可为多种病毒的核酸检测提供安全稳定的标准品和质控品。

Description

披甲RNA及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种披甲RNA及其制备方法。

背景技术

RNA病毒性传染病具有普遍性、适应性、恶毒性、顽固性和难预防性等特点，常使数以千万的人丧失生命，经济损失巨大。上世纪50年代的流感大流行，2003年SARS引发的严重疫情，这些突发性的公共卫生事件每发生一次，都会对经济和社会稳定带来严重的负面影响。世界卫生组织称，禽流感对亚洲的威胁可能比非典更严重。在病毒检测和基因的表达研究中，常需要RT-PCR来进行定量或定性，这就需要RNA质控品和标准品。

为了更好对传染性疾病进行监控，各个国家甚至全球范围内相继建立了各种网络实验室，并成为一种发展趋势，一些高危险性的RNA病毒传染病的检测工作也逐渐在地方实验室开展。网络实验室需实行统一的检测标准和程序，因此也需要RNA质控品和标准品来对检测的整个过程包括RNA的提取和RT-PCR等进行质量控制。

流感病毒的高度变异性导致流行性感冒每年不同规模的小流行和若干年一次世界范围的大流行。甲型流感病毒广泛存在禽类和哺乳动物中，也是目前致人类和各种动物流感的主型，在人类和动物间流行时可导致高发病率和高死亡率(Potter CW.A History of infuenza [J].JAppl Microbiol，2001，91：572-9.)。人禽流感是由甲型流感病毒某些亚型的毒株引起的急性呼吸道传染病，发病后死亡率高于60％。近年来人感染高致病性禽流感时有发生和流行，使得世界范围内都加大了流感的检测力度，流感/人禽流感网络监测实验室也应运而生。某些地方区县也设立监测点，开展流感的分子生物学检测工作。网络实验室需要进行统一的培训和考核，检测操作需使用统一的程序性文件，使用病原体颗粒或细胞作为标准品和质控品，具有传染的危险性，2005年美国病理学家协会误将含有H2N2病毒的能力验证样品向18个国家中的3747个参与实验室常规发送，后一经发现H2N2病毒，参与能力验证的所有实验室紧急销毁了含有H2N2病毒的样本(http://www.who.int/csr/disease/influenza/h2n2_2005_04_12/zh/index.html)。另外区县级监测点不具有分离培养流感病毒的能力，那么在运送过程中也存在着样品稳定性和生物安全问题，而通常裸露的RNA标准品和质控品不够稳定，这就需要无生物传染危险性和高稳定性的RNA标准品。

披甲RNA(armored RNA)是通过MS2包膜蛋白将目的RNA包裹起来，可耐受DNase和RNase，且没有生物传染危险性的噬菌体样颗粒。MS2/R17(血清I型)噬菌体是二十面体结构，属于正极性单链RNA球形病毒，其RNA因包膜蛋白的保护可以耐受DNase和RNase。MS2噬菌体结构上是由180个包膜蛋白分子、一分子的成熟酶蛋白及包裹着的一分子正链RNA基因组组成，基因组长3569nt。成熟酶蛋白具有保护噬菌体RNA免受核酸酶降解的作用，同时也是大肠杆菌F菌毛的受体。裂解酶蛋白具有裂解大肠杆菌细胞从而释放噬菌体粒子的作用。复制酶和三个大肠杆菌的蛋白形成蛋白质复合体负责噬菌体RNA的复制。包膜蛋白具有表达调控的功能，包膜蛋白二聚体可识别并结合到一个包含有复制酶启动子的茎环序列上，从而可以有效的抑制复制酶的表达(Ni CZ，et al.Structure 1995，3(3)：255-63)。包膜蛋白与此RNA茎环序列组成的RNA-蛋白质复合体通常被认为是引发噬菌体特异性RNA包裹的信号，RNA茎环序列称为packaging位点(即pac位点)，该pac位点同时是复制酶操纵子的一部分。RNA茎环序列为21nt或19nt，并且只有其中几个碱基是非常关键的(Stockley PG.Nucleic Acids Research，1995，23(13)：2512-8)。Pickett GG等(PickettGG Nucleic Acids Research，1993，21(19)：4621-6.)提出其他序列对噬菌体RNA的特异性包裹或许不是必需的。并试图通过实验证明这个pac位点能否在体外介导MS2包膜蛋白对异源性RNA的包裹，选用两个质粒转染同一个细胞，一个质粒表达MS2包膜蛋白，另一个表达含有pac位点的lacZ基因，但由于属于两套表达系统，MS2包膜蛋白的表达和lacZ基因的转录没有一个共同的阻遏调控系统，二者的比例无法有效调控，因而实验中MS2包膜蛋白包裹lacZ基因RNA的效率非常低，并没有得到预期的结果。

Pasloske BL等(Pasloske BL，et al.J Clin Microbiology，1998，36(12)：3590-4.)利用质粒表达系统将HIV-B保守区部分142nt的RNA包裹成披甲RNA；该质粒表达系统包括5’端非编码区、成熟酶蛋白、包膜蛋白及pac位点及预包裹的外源基因的DNA序列。使用同一表达系统表达包膜蛋白和外源核酸序列，可以自行调控基因的表达和转录，因而可以较为高效地实现包膜蛋白的表达和组装。WalkerPeach CR等(WalkerPeach CR.Clin Chem，1999，45(12)：2079-85.)利用质粒表达系统将HCV-2b保守区部分412nt的RNA包裹成披甲RNA；Hietala SK等(HietalaSK，et al.J Clin microbiol，2006，44(1)：67-70.)将口蹄疫病毒、古典型猪瘟病毒、水泡性口炎病毒新泽西血清亚群和印第安血清亚群的部分基因序列共462nt包裹成披甲RNA，作为动物检验检疫中活病毒的替代品。他们包裹的片段均小于500nt，披甲RNA的纯化方法均使用传统的CsCl梯度离心法，均没有为人类呼吸道传染病病毒提供一种耐核糖核酸酶的稳定的病毒替代品。国内李金明等也表达出耐核糖核酸酶的病毒样颗粒，如内含HIV、HCV、SARSRNA的部分序列的耐核糖核酸酶的病毒样颗粒，他表达的均为正链RNA病毒，且为单种RNA。

流感病毒和SARS病毒为可引起严重爆发流行的呼吸道传染病，可通过飞沫传播，易于形成较大的公共卫生事件。现在人感染高致病性禽流感在各个国家包括我们中国均时有发生，流感的监测力度也在逐步加大。流感病毒、SARS病毒等病毒性呼吸道传染病因其危害的严重性、易传播性和难预防性等特点，在呼吸道传染病病毒的监测过程中，使用安全稳定的标准品和质控品的需求更加迫切。此外，在RT-PCR检测过程中，由于实验的影响因素众多，如操作者的习惯差异、批间差异、试剂问题、抑制物的残存问题等都会直接影响实验，容易造成假阴性结果，严重时会贻误疫情，造成不必要的损失。因而使用内含特定RNA的披甲RNA可以为RNA病毒的RT-PCR检测提供一种安全稳定的病毒替代品，具有潜在的应用价值。

发明内容

为了解决现有病毒检测中存在的安全性差和稳定性低的问题，本发明提供一种披甲RNA，本发明还提供所述披甲RNA的制备方法。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种披甲RNA，其特征在于，所述披甲RNA是由MS2包膜蛋白包裹的RNA。

所述披甲RNA由MS2包膜蛋白包裹的RNA包含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

作为优化方案，所述披甲RNA由MS2包膜蛋白包裹的RNA还包含有SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供所述披甲RNA的制备方法，其特征在于，所述制备方法采用的纯化步骤如下：

(1).将RNaseA和DNaseI 37℃消化的披甲RNA于琼脂糖凝胶进行电泳，于双链DNAMarker的900-1000bp处，割胶取目的RNA-蛋白质复合体条带；

(2).将上述目的条带放到电洗脱/透析管中，透析膜与电泳方向垂直，进行电洗脱，先正向电泳后反向电泳，用枪头反复吹打透析膜数次，将透析管置入ddH₂O中，室温放置2-4h。吸出的电洗脱/透析管中的液体即为纯化后的披甲RNA。

含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的披甲RNA的制备方法步骤如下：

(1)以pMS27质粒为模板，SEQ ID No.5所示核苷酸序列与SEQ ID No.6所示核苷酸序列和SEQ ID No.5所示核苷酸序列与SEQ ID No.7所示核苷酸序列为引物进行PCR反应，分别得到SEQ ID No.3所示核苷酸序列和SEQ ID No.4所示核苷酸序列，分别连接到表达载体pET30b中，得到包含SEQ ID No.3所示核苷酸序列的重组载体pAR-1和包含SEQ ID No.4所示核苷酸序列的重组载体pAR-2；

(2)以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示核苷酸序列为引物，以SARS病毒RNA为模板，进行RT-PCR，得RT-PCR产物；

(3)分别以SEQ ID No.8与SEQ ID No.10所示核苷酸序列和SEQ ID No.9与SEQID No.11所示核苷酸序列为引物，步骤(2)所述RT-PCR产物为模板进行PCR反应，SOE法(Gene splicing by over lap extension，overlap PCR)将PCR产物拼接；

(4)分别以SEQ ID No.12与SEQ ID No.13所示核苷酸序列和SEQ ID No.14与SEQ ID No.15所示核苷酸序列为引物，甲型流感病毒和乙型流感病毒RNA为模板，进行RT-PCR，RT-PCR产物通过SOE法拼接起来；

(5)将步骤(3)和步骤(4)经SOE法拼接的产物再经SOE法拼接，得到拼接产物Am-BM-Sars；

(6)步骤(5)所得AM-BM-SARS链接到pAR-1质粒或pAR-2质粒，得到重组质粒pAR-3.1或pAR-3.2；

(7)步骤(6)所得重组质粒pAR-3.1或pAR-3.2转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，诱导表达，得到含SEQ ID No.1所示核苷酸序列的披甲RNA。

含有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列披甲RNA的制备方法步骤如下：

(1)以pMS27质粒为模板，SEQ ID No.5所示核苷酸序列与SEQ ID No.6所示核苷酸序列和SEQ ID No.5所示核苷酸序列与SEQ ID No.7所示核苷酸序列为引物进行PCR反应，分别得到SEQ ID No.3所示核苷酸序列和SEQ ID No.4所示核苷酸序列，分别连接到表达载体pET30b中，得到包含SEQ ID No.3所示核苷酸序列的pAR-1质粒和包含SEQ ID No.4所示核苷酸序列的pAR-2质粒；

(2)以甲型流感病毒为模板，SEQ ID No.16所示核苷酸序列和SEQ ID No.17所示核苷酸序列为引物进行RT-PCR，得到SEQ ID No.2所示核苷酸序列；

(3)步骤(2)所得SEQ ID No.2所示核苷酸序列分别连接到步骤(1)所得pAR-1质粒或pAR-2质粒中，得到重组质粒pAR-4.1或重组质粒pAR-4.2；

(4)步骤(3)所得重组质粒pAR-4.1或重组质粒pAR-4.2转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，诱导表达，得到含SEQ ID No.2所示核苷酸序列的披甲RNA。

本发明所实现的技术效果如下：

制备了内含多种病毒RNA片段(约0.4kb)的披甲RNA和内含病毒负链或正链RNA(约1.1kb)的披甲RNA，可为多种病毒的核酸检测提供安全稳定的标准品和质控品。

将甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒M基因和严重急性呼吸综合症冠状病毒CoV基因的部分序列拼接起来，制备了内含三种RNA片段的耐核糖核酸酶的披甲RNA，可以较大程度地提高披甲RNA的利用效率，降低成本，可用于多种病毒的RT-PCR检测和实时RT-PCR检测；通过将约1.1kb的PCR产物正向或反向连接到表达载体下游，既可诱导表达出将甲3型流感M基因正链RNA包裹起来的披甲RNA，也可诱导表达出将甲3型流感M基因负链RNA包裹起来的披甲RNA。包裹的核酸序列几乎囊括了甲3型流感M基因的全长序列，只要是甲型流感M基因相对保守区设计的引物，即可用其作为标准品和质控品，因而具有广泛的应用范围。

本发明提供的披甲RNA的特点：1.稳定，经37℃2天、4℃1个月、-20℃反复冻融，披甲RNA的拷贝数无明显减少，因耐RNase故可以避免被自然界中无所不在的RNase降解。2.无生物传染危险性。披甲RNA仅含有病毒的部分核酸，本身不具有传染性，披甲RNA实际为一种没有感染性的RNA-蛋白质复合体。3.对病毒具有很好的模拟性。病毒RNA由MS2包膜蛋白包裹起来组装成病毒样的颗粒，与病毒有很好的相似性，从RNA的提取到RT-PCR，完全模拟病毒，可对实验的整个过程进行质量控制。

流感病毒血清型众多，血凝素HA抗原有14种(H1～H14)，神经氨酸酶NA抗原有9种(N1～N9)，两者之间可以构成若干血清亚型，给流感的检测工作带来了很大的难度。本发明在引物设计上选择扩增基质蛋白M基因保守区，囊括了几乎所有的甲型、乙型流感病毒血清型，可用于甲型流感病毒和乙型流感病毒的分子筛选检测。

本发明所包裹的SARS-CoV基因既可以用于对样品进行巢式RT-PCR，也可以进行实时RT-PCR或巢式实时RT-PCR检测，对拷贝数较低的样品，可将巢式RT-PCR与实时RT-PCR两种检测方法相结合，用外套RT-PCR产物为模板进行实时PCR检测，可大大提高实验的灵敏度及可靠性。

选用SOE法将不同病毒的核酸拼接起来，简单易行，并为其它病毒拼接进来提供了一个平台，其它病毒核酸可根据需要直接拼接在SEQ ID No.1序列的上游或者下游，即可表达组装成含有更多种病毒RNA的披甲RNA。

通过HindIII单酶切位点将RT-PCR产物连接到表达载体中，既可诱导表达出将甲3型流感M基因正链RNA包裹起来的披甲RNA，也可诱导表达出将甲3型流感M基因负链RNA包裹起来的披甲RNA。可更好地模拟流感病毒粒子。

披甲RNA的纯化方法采用电洗脱法，将披甲RNA作为一种RNA-蛋白质复合体，琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，操作简单，回收率高。

披甲RNA的稳定性研究使用了实时RT-PCR的方法，使披甲RNA的稳定性更为量化、更为直观。

附图说明

图1：AR-1经RNase A和DNase I单酶及双酶切图谱

1.超声后的BL21(DE3)2.超声后的pAR-1表达产物3.RNaseA消化后的pAR-1表达产物4.DNaseI消化后的pAR-1表达产物5.RNaseA和DNaseI消化后的pAR-1表达产物6.空白7.λDNAHINdIII/EcorI；

图2：AR-1、AR-2的表达比较

1-4为AR-2(经RNase A和DNase I消化后的pAR-2表达产物)6-9为AR-1(经RNase A和DNase I消化后的pAR-1表达产物)5.λDNA HindIII/EcorI 10.RNaseA和DNase I消化前的AR-111.RNaseA和DNase I消化前的AR-2；

图3：SOE法扩增SARS-CoV基因和Am-Bm-SARS基因的电泳图谱

1.Am(130bp)2.Bm(81bp)3.Am-Bm(211bp)4.SARS片段1(142bp)5.SARS片段2(157bp)6.SARS(190bp)7.Am-Bm-SARS(401bp)8.100bp DNA ladder；

图4：pAR-3.1和pAR-4.1HindIII/BamHI的双酶切及单酶切图谱

1.100bp DNA ladder 2.pET30b HindIII单酶切3.pAR-4.1HindIII BamHI双酶切4.pAR-4.1HindIII单酶切5.pAR-3.1HindIII BamHI双酶切6.pAR-3.1HindIII单酶切7.λDNA HindIII/EcorI；

图5：AR-3.1、AR-3.2、AR-4.1、AR-4.2的表达及其耐RNaseA和DNaseI的酶切图谱1-8为经RNase A和DNase I消化后的表达产物，其中1-2为AR-3.2，3-4为AR-3.1，5-6为AR-4.2，7-8为AR-4.1，11-18为超生处理后未经RNase A和DNase I消化的表达产物，其中11-12为AR-3.2，13-14为AR-3.1，15-16为AR-4.2，17-18为AR-4.1，9.100bp DNA ladder，10.λDNA HindIII/EcorI；

图6：甲型流感Am基因检测标准曲线图

检测范围为10¹～10⁷拷贝，曲线在Ct值17.02-39.84间呈现较好的线性关系。CT＝-3.847＊log(conc)+43.787；conc＝10^(-0.260＊CT+11.382)。

具体实施方式

1.使用仪器

荧光定量PCR仪(Rotor Gene公司产品，型号为RG-3000)，PCR仪(Biometra Tgradient)，紫外凝胶成像系统(Bio-rad公司)，紫外分光光度计(Bio-rad公司型号为Smart Spec^TM3000)，冷冻离心机(Beckman coulter，型号为Allegra^TM X-22R)，普通离心机(Eppendorf5415D)，超生波细胞粉碎仪(宁波新芝科器研究所，型号：JY92-II型)，恒温金属浴箱(杭州博日科技有限公司)，振荡培养箱(杭州博日科技有限公司)。

2.材料与试剂

本专利申请所涉及生物材料均为生物学实验所常用生物材料，可由商业途径获得。对于申请人保藏之生物材料，自专利申请之日起三十年内，任何以实施本专利为目的之公众均可以免费向申请人所取。

E.coliDH5a(本实验室保存)，E.coliBL21(DE3)、pET30b质粒(全序列见http://www.emdbiosciences.com/docs/NDIS/69910-000.html)购于Novagen公司，甲型流感病毒A/杭州/189/2005(H3N2)株(于2004-2005年流行季节分离)，乙型流感病毒B/杭州/42/2005株(于2004-2005年流行季节分离)，SARS CoV RNA(由本实验室储存，来源于2003年SARS爆发期间病人样本)，pMS27质粒(购于比利时BCCM^TM)，EX taq酶、T4 DNA连接酶试剂盒、one-step Real-time RT-PCR试剂盒、one-step RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司产品)，pGEM-T easy vector、DNaseI、RNaseA(promega公司产品)，BamHI、HindIII内切酶(MBI公司产品)，质粒提取试剂盒(Omega公司产品)，凝胶回收纯化试剂盒(上海生工)，病毒RNA提取试剂盒(Qiagen)，凝胶电洗脱/透析管(以色列GeBA MW12000-16000cut-off)。因为本实验所用引物为所述病毒的保守序列，因此所述流感病毒A/杭州/189/2005(H3N2)株可由任一甲型流感病毒替代，流感病毒B/杭州/42/2005株可由任一乙型流感病毒替代，SARS CoV RNA可由任一SARS病毒RNA替代，以实现本发明。

3.引物

引物设计使用primer premier 5.0软件，由上海生工合成。

实施例1：

披甲RNA表达平台的构建：

1.表达载体的构建

以pMS27质粒为模板，用MS2F(5’ATGGATCCTCCTGCTCAACTTCCTGTCG3’，SEQID No.5)、MS2R1(5’GCAAGCTTTCTTCGACATGGGTAATCCT3’，SEQ ID No.6)，MS2F、MS2R2(5’GCAAGCTTTTAGTAGATGCCGGAGTTT3’，SEQ ID No.7)为引物进行扩增，目的条带分别为1750bp(SEQ ID No.3)和1707bp(SEQ ID No.4)，割胶纯化后，连接到pGEM-Teasy vector，提取质粒，用BamHI、HindIII进行双酶切，同时双酶切pET30b质粒并割胶回收，将两目的片断分别连接到表达载体pET30b中，所得重组质粒分别命名为pAR-1、pAR-2，进行PCR和酶切验证并送上海生工测序验证。

2.披甲RNA的表达及鉴定

将重组质粒pAR-1、pAR-2分别转化到BL21(DE3)感受态细胞中，铺于卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜。挑取单个克隆到2ml LB培养基中(卡那霉素50μg/ml)，37℃200r/min培养过夜。次日，按2％体积的量接种到6ml LB培养基中(卡那霉素50μg/ml)培养到对数生长期，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，终浓度为1mM，诱导表达4h。离心取沉淀，加入2ml超声缓冲液(50mM Tris.cl pH 8.0，2mM EDTA，0.1％Triton X-100)和溶菌酶(终浓度100μg/ml)，室温作用0.5h。然后进行超声碎菌处理。4℃12000r/min离心3min，取上请。各取100μl表达产物分别进行RNase A和DNase I单酶及双酶37℃消化2h，37℃消化过夜。将消化的表达产物各取20μl电泳，均可于900-1000bp处见荧光染色条带，表达产物经RNase A和DNaseI酶切后，大肠杆菌基因组DNA、RNA及质粒均被消化掉，披甲RNA因可耐RNaseA和DNaseI酶切，故仍可于900-1000bp处见清晰荧光条带。pAR-1、pAR-2质粒转化于E.coliBL21(DE3)感受态细胞，均可表达出耐核糖核酸酶的披甲RNA(分别命名为AR-1、AR-2)。

AR-1或AR-2是成熟酶蛋白、包膜蛋白及其基因组装成的噬菌体样粒子，内包裹含有MS2噬菌体的成熟酶蛋白基因和包膜蛋白基因的RNA。AR-1经RNase A和DNase I单酶及双酶切情况见图1。

另分别取80μl经RNase A和DNaseI酶消化过夜的表达产物按Qiagen病毒RNA提取试剂盒操作说明提取RNA，溶解于40μl ddH₂O水中，分别以MS2F、MS2R1和MS2F、MS2R2为引物进行RT-PCR和普通PCR检测。RT-PCR均为阳性，PCR均为阴性，证明表达出的AR-1和AR-2已经分别将本发明SEQ ID No.3所示的核酸序列和SEQ ID No.4所示的核酸序列对应的RNA序列完全包裹进去。

3.AR-1和AR-2的表达比较

将pAR-1、p AR-2转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞，各挑取4个克隆到2ml LB培养基中(卡那霉素50μg/ml)，37℃200r/min培养过夜。诱导方法同上。8个克隆培养诱导时间方法完全相同。各取20μl表达产物分别进行RNase A和DNaseI双酶切37℃消化2h。琼脂糖凝胶电泳。

pAR-1表达质粒的4个克隆具有相近的表达和包裹效率，pAR-2表达质粒的4个克隆也具有相近的表达和包裹效率，但pAR-1质粒与pAR-2质粒的表达效率明显不同，pAR-1质粒表达效率较高。见图2。

4.AR-1和AR-2的纯化及稳定性

将RNaseA和DNaseI消化好的AR-1和AR-2分别琼脂糖凝胶电泳，割下目的RNA-蛋白质条带，胶块要尽量小，放到电洗脱/透析管中进行电洗脱，电泳20-30min，反向电泳2min。用枪头反复吹打几次，可吸出备用。

将RNase A和DNaseI消化好的AR-1和AR-2分别置于室温、4℃和-20℃，2周后，电泳观察，目的荧光条带不见明显减弱，两者均具有较好的稳定性。

内含Am-Bm-Sars RNA片段的复合披甲RNA的制备：

以构建好的pAR-1质粒与pAR-2质粒为平台，先通过SOE法(Gene splicing by over lapextension，overlap PCR)将Am、Bm和Sars目的片段拼接起来，将Am-Bm-Sars的拼接DNA片断通过HindIII酶切位点连接到SEQ ID No.3所示核酸序列或SEQ ID No.4所示核酸序列的下游，诱导表达出含有Am-Bm-Sars RNA片段(SEQ ID No.1)的披甲RNA。

1.SOE法扩增Am-Bm-Sars基因

1.1SARS-CoV基因保守区的扩增

选用BN IoutS2(5’AAGGCAAAGCAGATGAATTACCAAGTCAATGGTTAC3’SEQ IDNO.8)、BN IoutAS(5’GTCAAGCTTCATAACCAGTCGGTACAGCTAC3’SEQ ID NO.9)为引物(BN IoutS2引物下划线部分为与Bm基因互补的PCR overlap区，BN IoutAS引物下划线部分为HindIII酶切位点)，以SARS爆发期间病人咽拭子样本RNA为模板，使用one-stepRT-PCR试剂盒进行RT-PCR，产物片段为190bp。具体方案如下：

10×buffer                           2μl

MgCl₂(25mM)                          4μl

dNTP(10mM)                           2μl

RNase inhibitor(40U/μl)             0.4μl

AMV Reverse Transcriptase XL(5U/μl) 0.4μl

AMV-optimized Taq                    0.4μl

P1/P2(20μM)                         0.4μl/0.4μl

RNA模板                              5μl

加水至总体积                         20μl

PCR反应参数为：50℃30min合成cDNA，以94℃10s、66℃10s、72℃30s进行10个循环，每1循环退火温度降1℃；然后以94℃10s、56℃10s、72℃20s进行30个循环。

因模板浓度低，不能满足需要，且反复扩增无法增加其浓度，故应先用半套式PCR对其进行扩增，再应用overlap PCR法将两片段拼接起来。取上述PCR产物2μl为模板，分别以BN IoutS2、BN IinAS(5’CTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG3’SEQ ID No.10)，BNIoutAS、BN IinS(5’GAAGCTATTCGTCACGTTCG3’SEQ ID No.11)为引物进行半套式PCR，PCR反应条件同上。琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化，两PCR片断分别为157bp和142bp。按如下方案配置PCR反应液进行两片段的SOE法拼接。

10×buffer                   5μl

MgCl₂(25mM)                  4μl

dNTP(2.5mM each)             4μl

EXTaq酶                      0.25μl

片段1                        0.5μl(约10ng)

片段2                        0.5μl(约10ng)

加水至总体积                 50μl

PCR反应参数为：94℃3min，以94℃10s、66℃10s、72℃30s进行10个循环，加入引物BN IoutS2、BN IoutAS各1μl。94℃10s、66℃10s、72℃30s进行10个循环每1循环退火温度降1℃；然后以94℃10s、56℃10s、72℃20s进行32循环，94℃10s、72℃20s进行10个循环。电泳检测，在190bp出可见荧光条带，割胶纯化后备用。将纯化好的190bpSARS-CoV保守区连接到pGEM-T easy vector，挑取克隆，测序，测序结果与ZJ0301株部分序列完全一致。

1.2甲型流感、乙型流感M基因保守区的拼接

使用one-step RT-PCR试剂盒，以流感病毒A/杭州/189/2005(H3N2)株和B/杭州/42/2005株RNA为模板，分别使用引物

AM119F-SOE(5’CTCAAGCTTAGGCACTCATGGAATGGCTAAAG3’，SEQ ID No.12)、AM248R-SOE(5’TAAGAAAGTGCCGCATTTTGGACAAAGCGTCTAC3’，SEQ ID No.13)和BM11F-SOE(5’TGTCCAAAATGCGGCACTTTCTTAAAATGTCGCT3’，SEQ ID No.14)、BM91R-SOE(5’TGGTAATTCATCTGCTTTGCCTTCTCCATCT3’SEQ ID No.15)进行RT-PCR，AM119F-SOE引物下划线部分为HindIII酶切位点，AM248R-SOE、BM11F-SOE、BM91R-SOE引物下划线部分为PCRoverlap区。1.2％琼脂糖凝胶电泳回收后，通过SOE法将甲型流感、乙型流感M基因保守区的部分序列(分别为130bp和81bp)拼接起来。反应条件同上。琼脂糖凝胶检测于211bp处可见荧光条带，割胶纯化后备用。

本发明在引物设计上选择扩增流感病毒基质蛋白M基因保守区，囊括了几乎所有的甲型、乙型流感病毒血清型，可用于甲型流感病毒和乙型流感病毒的分子筛选检测。

1.3Am-Bm和SARS-CoV片断的拼接

将割胶纯化后的Am-Bm和SARS-CoV片断进行overlap PCR，反应体系和反应条件同1.1。电泳检测可于401bp处见清晰荧光条带。

overlap区成功退火是SOE法成功拼接目的片段的关键。本发明中使用Touch Down PCR法进行两片段的拼接，解决了空间结构影响overlap区退火的问题，成功地将三种不同的病毒核酸拼接成Am-Bm-Sars片断。

2.pAR-3.1表达载体的构建

将SOE法获得的Am-Bm-Sars片断连接到pGEM-T easy vector，提取其克隆质粒，用HindIII内切酶37℃酶切2h，割胶回收Am-Bm-Sars片断，同时HindIII酶切pAR-1质粒，37℃作用1.5h，加入过量的去磷酸化酶作用0.5h，割胶回收pAR-1大片断。使用T4DNA连接酶试剂盒将Am-Bm-Sars片断接到表达载体pAR-1中，命名为pAR-3.1。测序确定连接方向。pAR-3.1所含的插入DNA片段为：5’非编码区(1-109)、成熟酶蛋白基因(110-1288)、包膜蛋白基因(1315-1704)、pac位点(1724-1744)、裂解酶基因(1658-1750)、HindIII酶切位点(1751-1756)、Am-Bm-Sars片断(1757-2157)。

3.AR-3.1的表达

将构建好pAR-3.1质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，pAR-3.1质粒的诱导表达方法同上进行，仅将IPTG诱导时间从实施例中的4h更改为16h，诱导表达16h，披甲RNA的得率更高。表达产物经鉴定可耐DNase I和RNaseA酶切，将此耐核糖核酸酶内含SEQ IDNo.3所示核酸序列及SEQ ID No.1所示核酸序列的披甲RNA命名为AR-3.1。

4.按2.和3.所述的方法将Am-Bm-Sars片段连接到pAR-2质粒中并诱导表达，将此内含SEQID No.4所示核酸序列及SEQ ID No.1所示核酸序列的披甲RNA命名为AR-3.2。

AM119F和BN IoutAS为引物，提取经DNase I和RNaseA酶消化过夜的AR-3.1和AR-3.2的核酸为模板，分别进行RT-PCR和PCR，RT-PCR为阳性，PCR为阴性。

披甲RNA的纯化：

披甲RNA是一种噬菌体样粒子，即为一种病毒样粒子，Pasloske BL等均使用传统的CsCl梯度离心法、按病毒粒子的回收纯化方法进行披甲RNA的纯化。本发明将披甲RNA作为一种RNA-蛋白质复合体，因可以进行琼脂糖凝胶电泳，故使用电洗脱的方法进行披甲RNA的纯化。

1.在GeBAflex管中加入2-3ml ddH₂O，室温孵育5min检测纯化管是否漏水，把水倒掉。

2.将加入过量RNase A和DNaseI 37℃消化过夜的披甲RNA进行琼脂糖凝胶电泳，割下目的RNA-蛋白质复合体条带，胶块尽量要小。

3.将胶快放到透析管中，加入2-3ml的水，将纯化/透析管固定在水平的托盘架上，透析膜与电泳方向垂直，进行电洗脱，正向电泳20-30min，反向电泳120s。用枪头反复吹打透析膜数次，可吸出备用。

4.如要尽量去除电泳缓冲液中的小分子，可将透析管置入ddH₂O中(体积一般为透析样品体积的100-1000倍)，室温2-4h。纯化/透析后的样品可用于稳定性和定量分析。

披甲RNA的定量和稳定性分析：

1.Real-time RT-PCR对披甲RNA进行定量

1.1提取Am-Bm-Sars基因的克隆质粒，用紫外分光光度计测定其浓度，然后10倍系列稀释，终浓度为10⁰～10⁷拷贝/μl，各取1μl做模板，以Real-time PCR方法检测，绘制标准曲线。conc＝10^(M*CT+B)。反应效率为10^-M-1，1/M＝3.322时，反应效率最高为1。相关系数R值均在0.99以上。本发明选用Am检测标准曲线定量披甲RNA，标准曲线见图6。1.2将纯化好的披甲RNA直接94℃5min处理，可完全释放被包裹的RNA，取1μl做模板，使用one-step实时RT-PCR试剂盒进行定量，并对待测披甲RNA进行10倍和100倍稀释，同时进行one-step实时RT-PCR来评估逆转录的效率。各做3个重复。以10⁵拷贝/μl的克隆质粒为内参来校正批间差异。每1ml LB培养基诱导表达即可获得约7.8×10¹²个拷贝的AR-3.1，约1.4×10¹²个拷贝的AR-3.2。

将披甲RNA直接94℃5min，可以破坏披甲RNA的包膜蛋白，将包裹着的RNA完全释放出来，释放出的RNA可直接用于实时RT-PCR的模板，中间没有任何损耗，RNA得率高。使用Qiagen病毒RNA提取试剂盒提取披甲RNA的核酸，存在着过柱效率、RNA洗脱效率等问题，RNA得率相对变低。因而使用将披甲RNA直接94℃5min提取RNA进行披甲RNA的定量更为准确。

2.披甲RNA的稳定性分析

本发明中流感病毒和SARS病毒均为呼吸道病毒，故为更好地模拟实际采样情况，将披甲RNA按1×10⁶copies/μl的量加入到正常人咽拭子标本中(不去除其中的上皮细胞、细菌和唾液等)，平分成若干小份，分别置37℃24h和48h，4℃14天和1个月(各3个重复)。置-20℃反复冻融3次、6次、12次(各3个重复)，到时统一置-20℃冰箱储存待测。对不同时间和温度下检测的披甲RNA的Ct值进行统计分析，差异不显著(p＞0.10)，AR-3.1中包裹着的三基因的实时RT-PCR检测结果见表2。说明本发明制备的披甲RNA在上述条件下是稳定的，且-20℃反复冻融对其影响不大。虽然本发明没有得到披甲RNA开始降解的时间限度，但也说明披甲RNA稳定性良好，环境温度和储存条件在一定范围内即使有所变化，也不会影响披甲RNA的使用效能，完全可满足网络实验室中样品和标准品分发和运送所需要的条件。

实施例2：

披甲RNA表达平台的构建：

操作同实施例1。

内含甲3型流感M基因RNA的披甲RNA的制备：

提取甲型流感A/杭州/189/2005(H3N2)株RNA为模板，以M-petF(5’CTCAAGCTTGAAGGTAGATATTGAAAGATG3’SEQ ID NO.16)、M-petR(5’CATAAGCTTGAAACAAGGTAGTTTTTTACTC3’SEQ ID NO.17)为引物进行RT-PCR扩增M基因长片段。引物下划线部分为HindIII酶切位点。RT-PCR参数为：50℃30min合成cDNA，以94℃10s、56℃10s、72℃ 1min 15s进行30个循环。表达载体的构建和表达同实施例1。制备内含甲3型流感病毒M基因保守区1016bp RNA(SEQ ID NO.2)的耐核糖核酸酶的披甲RNA，将此内含SEQ ID No.3所示核酸序列及SEQ ID No.2所示核酸序列的披甲RNA命名为AR-4.1，内含SEQ ID No.4所示核酸序列及SEQ ID No.2所示核酸序列的披甲RNA命名为AR-4.2。

AR-3.1、AR-3.2、AR-4.1、AR-4.2的表达情况及其耐RNase A和DNaseI的酶切图谱见图5。

披甲RNA的纯化：

AR-4.1、AR-4.2的纯化同实施例1进行。

披甲RNA的定量和稳定性分析：

1.Real-time PCR对披甲RNA进行定量

1.1提取Am-Bm-Sars基因的克隆质粒，用紫外分光光度计测定其浓度，然后10倍系列稀释，终浓度为10⁰～10⁷拷贝/μl，各取1μl做模板，以Real-time PCR方法检测，绘制Am检测标准曲线(见图6)。cone＝10^(M*CT+B)。反应效率为10^-M-1，1/M＝3.322时，反应效率最高为1。相关系数R值在0.99以上。

实施例1中制备的披甲RNA内含Am-Bm-Sars片断RNA，其中Am片断部分为甲型流感病毒的保守区，可用于几乎所有甲型流感病毒M基因的检测，故本实施例中的内含甲3型流感病毒M基因RNA的披甲RNA的定量，可选用Am检测标准曲线进行。定量用引物探针亦选用Am片断设计的引物和探针。

1.2将纯化好的披甲RNA直接94℃5min处理，完全释放被包裹的RNA，取1μl做模板，使用one-step实时RT-PCR试剂盒进行定量，做3个重复。以10⁵copies/μl的克隆质粒为内参来校正批间差异。每1ml LB培养基诱导表达即可获得约8.9×10¹¹个拷贝的AR-4.1、约6.4×10¹¹个拷贝的AR-4-2。两种内含甲3型流感M基因RNA(1016bp)的披甲RNA均可得到较高的表达量。

2.披甲RNA的稳定性分析

采用Am片断设计的引物和探针，使用实时RT-PCR方法对AR-4.1、AR-4.2进行稳定性研究。披甲RNA的稳定性研究使用实时RT-PCR的方法，使披甲RNA的稳定性更为量化、更为直观。

流感病毒为呼吸道病毒，故为更好地模拟实际采样情况，将披甲RNA按每1×10⁶copies/μl的量加入到正常人咽拭子标本中(不去除其中的上皮细胞、细菌和唾液等)，平分成若干小份，分别置37℃24h和48h，4℃14天和1个月(各3个重复)。置-20℃反复冻融3次、6次、12次(各3个重复)，到时统一冒-20℃冰箱储存待测。对不同时间和温度下检测的披甲RNA的Ct值进行统计分析，差异不显著(p＞0.10)，具有较好的稳定性。AR-4.1实时RT-PCR检测结果见表2。虽然本发明没有得到披甲RNA开始降解的时间限度，但也说明披甲RNA稳定性良好，环境温度和储存条件在一定范围内即使有所变化，也不会影响披甲RNA的使用效能，完全可满足网络实验室中样品和标准品分发和运送所需要的条件。

表2实时RT-PCR分析披甲RNA的稳定性

(以AR-3.1和AR-4.1为例，浓度为1×10⁶copies/μl，每个样品3个重复。)

实施例3披甲RNA在病毒检测中的应用

披甲RNA可被用作稳定且没有生物传染危险性的标准品和质控品。

披甲RNA是病毒RNA由MS2包膜蛋白包裹起来组装成的噬菌体样颗粒，与病毒有很好的相似性，可直接作为病毒核酸测定中的阳性对照，可为RT-PCR检测试剂盒以及网络实验室培训提供稳定且无生物传染危险性的样本。将披甲RNA加入到血清或PBS或生理盐水中，使用Qiagen病毒RNA提取试剂盒提取RNA，进行RT-PCR，可对实验的整个过程进行质量控制，包括RNA提取效率、逆转录效率、试剂质量以及操作过程中的随机误差等。

在RNA病毒的定量中，可将披甲RNA作为检测的内参，可以更准确地对病毒进行定量，具体方法如下：将披甲RNA按确定的量加入到标本中去(如咽拭子液或生理盐水等)，完全模拟病毒的采样，使用Qiagen病毒RNA提取试剂盒提取病毒及披甲RNA中的RNA，然后同时进行实时RT-PCR。将披甲RNA作为内参来调整real-time PCR Threshold值，确定病毒检测的Ct值，从而对病毒进行定量。使用披甲RNA作为内参定量RNA病毒，可以最大程度地消除RNA提取效率、逆转录效率以及操作过程中的随机误差对结果的影响，使得对RNA病毒的定量更为准确。

SEQUENCE LISTING

<110>杭州市疾病预防控制中心

<120>披甲RNA及其制备方法

<130>001

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>401

<212>DNA

<213>gene by pcr

<400>1

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<210>2

<211>1016

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<400>2

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<210>3

<211>1750

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<211>1707

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<213>ARTIFICAL

<400>15

tggtaattca tctgctttgc cttctccatc t                  31

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>ARTIFICAL

<400>16

ctcaagcttg aaggtagata ttgaaagatg                    30

<210>17

<211>31

<212>DNA

<213>ARTIFICAL

<400>17

cataagcttg aaacaaggta gttttttact c                  31

Claims (6)

1.一种披甲RNA，其特征在于，所述披甲RNA是由MS2包膜蛋白包裹的RNA。

2.根据权利要求1所述的披甲RNA，其特征在于，所述披甲RNA由MS2包膜蛋白包裹的RNA包含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的披甲RNA，其特征在于，所述披甲RNA由MS2包膜蛋白包裹的RNA还包含有SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

4.权利要求1-3任意一项所述披甲RNA的制备方法，其特征在于，所述制备方法采用的纯化步骤如下：

(1).将RNaseA和DNaseI 37℃消化的披甲RNA于琼脂糖凝胶进行电泳，于双链DNA Marker的900-1000bp处，割胶取目的RNA-蛋白质复合体条带；

(2).将上述目的条带放到电洗脱/透析管中，透析膜与电泳方向垂直，进行电洗脱，先正向电泳后反向电泳，用枪头反复吹打透析膜数次，将透析管置入ddH₂O中，室温放置2-4h。吸出的电洗脱/透析管中的液体即为纯化后的披甲RNA。

5.根据权利要求4所述的披甲RNA，其特征在于，含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的披甲RNA的制备方法步骤如下：

(1)以pMS27质粒为模板，SEQ ID No.5所示核苷酸序列与SEQ ID No.6所示核苷酸序列和SEQ ID No.5所示核苷酸序列与SEQ ID No.7所示核苷酸序列为引物进行PCR反应，分别得到SEQ ID No.3所示核苷酸序列和SEQ ID No.4所示核苷酸序列，分别连接到表达载体pET30b中，得到包含SEQ ID No.3所示核苷酸序列的重组载体pAR-1和包含SEQID No.4所示核苷酸序列的重组载体pAR-2；

(2)以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示核苷酸序列为引物，以SARS病毒RNA为模板，进行RT-PCR，得RT-PCR产物；

(3)分别以SEQ ID No.8与SEQ ID No.10所示核苷酸序列和SEQ ID No.9与SEQ iD No.11所示核苷酸序列为引物，步骤(2)所述RT-PCR产物为模板进行PCR反应，SOE法(Gene splicing by over lap extension，overlap PCR)将PCR产物拼接；

(4)分别以SEQ ID No.12与SEQ ID No.13所示核苷酸序列和SEQ IDNo.14与SEQ ID No.15所示核苷酸序列为引物，甲型流感病毒和乙型流感病毒RNA为模板，进行RT-PCR，RT-PCR产物通过SOE法拼接起来；

(5)将步骤(3)和步骤(4)经SOE法拼接的产物再经SOE法拼接，得到拼接产物Am-Bm-Sars；

(6)步骤(5)所得Am-Bm-Sars链接到pAR-1质粒或pAR-2质粒，得到重组质粒pAR-3.1或pAR-3.2；

(7)步骤(6)所得重组质粒pAR-3.1或pAR-3.2转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，诱导表达，得到含SEQ ID No.1所示核苷酸序列的披甲RNA。

6.根据权利要求4所述的披甲RNA，其特征在于，含有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列披甲RNA的制备方法步骤如下：

(1)以pMS27质粒为模板，SEQ ID No.5所示核苷酸序列与SEQ ID No.6所示核苷酸序列和SEQ ID No.5所示核苷酸序列与SEQ ID No.7所示核苷酸序列为引物进行PCR反应，分别得到SEQ ID No.3所示核苷酸序列和SEQ ID No.4所示核苷酸序列，分别连接到表达载体pET30b中，得到包含SEQ ID No.3所示核苷酸序列的pAR-1质粒和包含SEQ IDNo.4所示核苷酸序列的pAR-2质粒；

(2)以甲型流感病毒为模板，SEQ ID No.16所示核苷酸序列和SEQ IDNo.17所示核苷酸序列为引物进行RT-PCR，得到SEQ ID No.2所示核苷酸序列；

(3)步骤(2)所得SEQ ID No.2所示核苷酸序列分别连接到步骤(1)所得pAR-1质粒或pAR-2质粒中，得到重组质粒pAR-4.1或重组质粒pAR-4.2；

(4)步骤(3)所得重组质粒pAR-4.1或重组质粒pAR-4.2转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，诱导表达，得到含SEQ ID No.2所示核苷酸序列的披甲RNA。

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