CN105734046B - 无细胞表达系统制备Armored RNA的方法 - Google Patents
无细胞表达系统制备Armored RNA的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105734046B CN105734046B CN201410770769.1A CN201410770769A CN105734046B CN 105734046 B CN105734046 B CN 105734046B CN 201410770769 A CN201410770769 A CN 201410770769A CN 105734046 B CN105734046 B CN 105734046B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rna
- armored rna
- mrna
- pcr
- armored
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 24
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 21
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 5
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 238000011137 process chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241001313855 Bletilla Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 201000005630 leukorrhea Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 206010046901 vaginal discharge Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种无细胞表达系统制备Armored RNA的方法,属于基因工程领域。本发明采用无细胞表达系统,首先将线性化的Armored RNA重组质粒DNA转录成mRNA,去除mRNA中的外源DNA,以mRNA为底物,使用无细胞表达系统表达Armored RNA。表达产物经PCR和RT‑PCR检测,显示Armored RNA溶液中以及蛋白包膜内,都没有外源DNA的污染,PCR检测结果都为阴性;蛋白包膜包裹有外源RNA,可以使用RT‑PCR方法检测到。本发明方法可有效表达Armored RNA,且表达产物无外源DNA污染,可用于制备RNA阳性参考物质以及对RNA纯度要求较高的实验。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,具体地,涉及一种无细胞表达系统制备Armored RNA的方法。
背景技术
Armored RNA,国内通常翻译成假病毒,是一种保护目的RNA的蛋白颗粒。其制备原理是:使用分子生物学技术,将噬菌体MS2的成熟蛋白基因、衣壳蛋白基因和衣壳蛋白基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构克隆到表达载体上,并在其下游处插入外源DNA。该载体在表达过程中能够将插入的外源DNA片段转录成RNA,同时合成的衣壳蛋白单体与成熟蛋白及RNA结合(含有19bp的发夹结构),自发组装成180个衣壳蛋白单体包裹成熟蛋白和RNA的Armored RNA(图1)。Armored RNA颗粒与MS2噬菌体类似,能够耐受核酸酶的降解,具有较好的稳定性,可以有效的保护包裹其中的RNA,且不具复制能力和传染能力。目前,ArmoredRNA越来越多地应用于RNA阳性参考物质的制备、RNA样品的保存等领域。
Armored RNA的制备技术,分为重组质粒制备、Armored RNA蛋白表达和ArmoredRNA提纯3步骤。重组质粒制备基本都通过先酶切再连接的方法,将目的DNA连接入表达载体中;Armored RNA蛋白表达,目前普遍采用原核表达法,即将Armored RNA的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌中,IPTG诱导表达Armored RNA;提纯方法可分为离心法和亲和层析法,离心法是将表达产物经超声波破碎后,再使用差速梯度离心法或蔗糖/氯化铯梯度离心法去除杂质,从而达到提纯Armored RNA的目的;亲和层析法是表达载体具有6×His基因,因此表达的Armored RNA外膜带白带有6×His标签,可使用Ni柱进行亲和层析纯化。
目前普遍采用的原核表达Armored RNA的方法,表达产物中含有大量外源DNA。这些外源DNA可能包裹在蛋白包膜中,因此无法用酶水解法、离心法和亲和层析法完全去除。外源DNA会对RNA实验进行干扰,影响实验结果的可靠性。例如:检测RNA病毒时,以包裹病毒RNA的Armored RNA为阳性对照,若提纯的RNA中混有病毒外源DNA,则不需经过反转录步骤,直接PCR扩增就能扩增出目的基因,而真正的病毒RNAPCR结果反而是阴性,这样以来Armored RNA失去的作为参考RNA的意义;某些RNA实验,需要RNA样品非常纯,外源DNA会干扰RNA的定量,造成实验结果出现偏差。因此迫切需要一种没有外源DNA污染的Armored RNA用于制备RNA阳性参考物质以及满足对RNA纯度要求较高的病原检测的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无细胞表达系统制备Armored RNA的方法,以克服现有技术的不足。
本发明提供的无细胞表达系统制备Armored RNA的方法,包括以下步骤:。
(1)将线性化的Armored RNA重组质粒DNA体外转录成mRNA;
(2)去除mRNA中的外源DNA;
(3)以mRNA为底物,使用无细胞表达系统表达Armored RNA。
本发明方法中,步骤(1)中线性化的Armored RNA重组质粒DNA是使用限制性内切酶将Armored RNA重组质粒切为线性DNA,并确保线性化酶切产物启动子—MS2基因—病毒基因的完整和连贯。
所述限制性内切酶满足以下条件:
(a)为Armored RNA重组质粒自带的酶切位点;
(b)外源基因和启动子基因序列不能有该酶的酶切位点;
(c)酶切位点不能在启动子与外源基因之间,以及各段外源基因之间。
本发明方法中个,步骤(1)的体外转录成mRNA之前还包括对线性化重组质粒进行鉴定。
具体地,线性化重组质粒鉴定方法为:
1)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。若电泳结果只有1条DNA条带,则凝胶回收;若电泳结果有多条DNA条带,则说明酶切位点不止1个,必须重新选择酶切位点。
2)以回收的酶切产物为模板,使用检测引物进行PCR检测。若能扩增出目的基因,则说明线性化重组质粒中的外源基因完整,可继续实验;若无目的基因,则说明质粒中的外源基因已被破坏,需重新选择酶切位点进行线性化。
本发明方法的步骤1)中将线性化的Armored RNA重组质粒DNA体外转录成mRNA,其100μL转录体系为:15mM的5×Buffer 20μL,25mM的rNTP 30μL,线性化重组质粒DNA 2μg,转录酶10μL,dH2O加至总体积100μL;转录条件为37℃,3-6h。优选地,转录条件为37℃,4h。
本发明上述方法中,步骤(2)的去除mRNA中的外源DNA的方法为:按照与转录体系的体积比1:10-1:20加入无RNA酶的DNase I,37℃0.5h-1h。
优选地,按照与转录体系的体积比1:10加入无RNA酶的DNase I,37℃0.5h。
也可以使用商品化的体外转录试剂盒进行mRNA的转录。需要注意的是体外转录试剂盒分为针对T7启动子的试剂盒和针对SP6启动子的试剂盒,需根据所使用的假病毒特征选择相应的试剂盒。
在上述方法的步骤(2)和(3)之间,还包括提取转录产物中的mRNA,分别对其进行PCR和RT-PCR检测,根据上述两个检测方法的结果判断是否去除外源DNA。
具体地,是使用Trizol或商业化RNA提取试剂盒提取转录产物中的mRNA。以提纯的RNA溶液为模板,使用检测引物,分别进行PCR和RT-PCR检测,检测外源DNA是否去除干净,mRNA是否能扩增出目的基因。
若PCR检测结果为阴性,表明溶液中无外源DNA;若为阳性,则必须重新消化DNA。
若RT-PCR检测结果为阳性,说明溶液中含有外源DNA转录生成的mRNA;若为阴性,则必须重新提取RNA,或重新转录mRNA。
只有当PCR检测结果为阴性,RT-PCR检测结果为阳性时,说明溶液中只有外源DNA转录生成的mRNA,无外源DNA,此时才能进入步骤(3),以mRNA为底物,使用无细胞表达系统表达Armored RNA。
使用无细胞表达系统表达Armored RNA。
表达体系:
反应条件:30℃90min。反应产物4℃保存。
也可以使用商品化无细胞表达试剂盒进行假病毒的表达。
本发明提供的上述方法中,还包括步骤(4)提纯Armored RNA。
若表达的Armored RNA外膜蛋白带有6×His标签,可以使用Ni-NTA亲和层析柱纯化Armored RNA,Ni-NTA亲和层析柱可使用商品化预装柱。
若表达的Armored RNA外膜蛋白无6×His标签,可以使用差速梯度离心法或蔗糖/氯化铯梯度离心法提纯Armored RNA。
本发明还提供了上述无细胞表达系统表达Armored RNA的方法在制备RNA阳性参考物质中的应用。
本发明的无细胞表达系统表达Armored RNA方法获得的表达产物经PCR和RT-PCR检测,显示Armored RNA溶液中以及蛋白包膜内,都没有外源DNA的污染,PCR检测结果都为阴性;蛋白包膜包裹有外源RNA,可以使用RT-PCR方法检测到。本发明方法可有效表达Armored RNA,溶液中和蛋白包膜内都不含有外源DNA,克服了原核表达系统表达的ArmoredRNA含有外源DNA的缺陷,可用于制备RNA阳性参考物质以及对RNA纯度要求较高的病原检测。
附图说明
图1为Armored RNA表达过程示意图。
图2为pAR-IHNV mRNA质量的检测,M:DNA Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1:pAR-IHNV mRNA。
图3为Armored RNA-IHNV溶液的检测,M:DNA Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1、2:Armored RNA-IHNV溶液。
图4为Armored RNA-IHNV RNA的检测,M:DNA Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1、2:Armored RNA-IHNV RNA。
图5为Armored RNA-IHNV核酸酶耐受性检测,M:DNA Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1:未经核酸酶处理的Armored RNA-IHNV;2:核酸酶处理的Armored RNA-IHNV。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
使用无细胞表达系统制备包含有1段传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)RNA片段的Armored RNA。使用表达载体pET-32a改造,多克隆位点中插入了噬菌体MS2的成熟蛋白基因、衣壳蛋白基因、6×His基因和衣壳蛋白基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构,并在下游处插入1段IHNV的693bp的外源cDNA片段。该重组质粒命名为pAR-IHNV。
1、pAR-IHNV的线性化。
使用限制性内切酶Mlu I将pAR-IHNV切为线性DNA。
酶切体系:总体积50ul。
试剂 | 加入量(μL) |
pAR-IHNV | 10 |
Mlu I | 2 |
Buffer | 5 |
BSA | 0.5 |
ddH<sub>2</sub>O | 32.5 |
反应温度:37℃,4h。
2、线性化重组质粒的鉴定。
经凝胶电泳和PCR检测,质粒线性化完全,线性化重组质粒中的外源DNA完整,可继续实验。
3、pAR-IHNV mRNA的体外转录。
转录体系:
试剂 | 体积(μL) |
5×Buffer(15mM) | 20 |
rNTP(25mM each) | 30 |
线性化pAR-IHNV | 2ug |
转录酶 | 10 |
dH<sub>2</sub>O | 加至总体积100μL |
将各成分吸入PCR管内,使用PCR仪进行转录,条件:37℃4h。
4、转录产物中外源DNA的去除。
在100uL转录体系内加入10uL DNase I(RNase free),37℃0.5h。去除转录产物中的外源DNA。
5、使用Trizol提取转录产物中的mRNA,提取步骤按照Trizol使用说明书进行。
6、pAR-IHNV mRNA质量的检测。
提纯的mRNA溶液为模板,使用世界动物卫生组织(OIE)水生动物疾病诊断手册(2014)推荐的IHNV检测引物,分别进行PCR和RT-PCR检测,检测外源DNA是否去除干净,mRNA是否能扩增出目的基因目的基因长度693bp。
PCR体系:
试剂 | 体积(μL) |
10×PCR Buffer(15mM) | 5 |
dNTP(2.5mM each) | 5 |
Tag polymerase(5U) | 1 |
上游引物(10pmol/ul) | 3.5 |
下游引物(10pmol/ul) | 3.5 |
DNA模版 | 10 |
ddH<sub>2</sub>O | 22 |
总体积 | 50 |
PCR反应条件:95℃2min;30个循环:95℃30s;50℃30s;72℃60s;72℃7min。
RT-PCR体系:
试剂 | 体积(μL) |
10×One Step RNA PCR Buffer | 5 |
dNTP(10mM) | 5 |
MgCL2(25mM) | 10 |
Rnase Inhibitor | 1 |
AMV-Optimized Tag | 1 |
AMV Rtase XL | 1 |
上游引物(10pmol/ul) | 2 |
下游引物(10pmol/ul) | 2 |
RNA模版 | 10 |
无RNA酶的ddH<sub>2</sub>O | 13 |
total | 50 |
RT-PCR反应条件:50℃30min;95℃2min;30个循环:95℃30s,50℃30s,72℃60s;72℃7min。
扩增产物电泳结果显示(图2),PCR检测结果为阴性,表明溶液中无外源DNA;RT-PCR检测结果可以在700bp左右看到明显的目的DNA条带,与阳性对照相同,因此为阳性,说明溶液中含有外源DNA转录生成的mRNA,可以继续实验。
7、Armored RNA-IHNV的表达:
以pAR-IHNV mRNA为底物,使用无细胞表达系统表达Armored RNA-IHNV。
表达体系:
试剂 | 体积(μL) |
兔红细胞溶解产物 | 70 |
氨基酸混合物(亮氨酸),1mM | 1 |
氨基酸混合物(蛋氨酸),1mM | 1 |
RNA酶抑制剂 | 2 |
pAR-IHNV mRNA | 4ug |
DEPC处理过的水 | 加至总体积100μL |
反应条件:30℃90min。
反应产物4℃保存。
8、Armored RNA-IHNV的提纯:
表达的Armored RNA-IHNV外膜蛋白带有6×His标签,使用qiagen Ni-NTA快速纯化试剂盒提纯Armored RNA-IHNV。
9、Armored RNA-IHNV真实性检测
(1)使用Trizol提纯Armored RNA-IHNV的RNA。
(2)使用IHNV检测引物,分别以Armored RNA-IHNV溶液为模板,进行PCR和RT-PCR检测,检测溶液中是否有外源DNA和RNA。反应体系和条件见步骤6。电泳结果显示(图3),PCR和RT-PCR结果都为阴性,表明溶液中无外源DNA污染,也没有游离的外源RNA。
(3)使用IHNV检测引物,分别以提取的Armored RNA-IHNV RNA为模板,进行PCR和RT-PCR检测,检测RNA中是否有外源DNA和RNA。反应体系和条件见步骤6。电泳结果显示(图4),PCR结果为阴性,表明Armored RNA包膜中也没有外源DNA污染;RT-PCR结果为阳性,表明Armored RNA包膜中包裹有IHNV病毒的RNA。
(4)核酸酶耐受性检测。4ml假病毒溶液(约含病毒RNA 12ug),加入10ul(100U,可处理100ug RNA)Benzonase Nuclease(qiagen)核酸酶,孵育1h。取200ul假病毒溶液提取RNA,进行RT-PCR检测。电泳结果显示为阳性(图5),说明IHNV RNA包裹于Armored RNA包膜中,可有效抵抗核酸酶的水解。
综上所述,使用无细胞表达系统制备得Armored RNA-IHNV,无外源DNA污染,具备较高的核酸耐受性,是真实的Armored RNA。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.无细胞表达系统制备Armored RNA的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将线性化的Armored RNA重组质粒DNA体外转录成mRNA;
(2)去除mRNA中的外源DNA;
(3)以mRNA为底物,使用无细胞表达系统表达Armored RNA;
其中,步骤(1)中线性化的Armored RNA重组质粒DNA是使用限制性内切酶将ArmoredRNA重组质粒切为线性DNA,并确保线性化酶切产物中启动子—MS2基因—病毒基因的完整和连贯;
步骤(3)所述无细胞表达系统表达Armored RNA的表达体系为:
表达体系:
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述限制性内切酶满足以下条件:
(a)为Armored RNA重组质粒自带的酶切位点对应的内切酶;
(b)外源基因和启动子基因序列不能有所述限制性内切酶的酶切位点;
(c)酶切位点不能在启动子与外源基因之间,以及各段外源基因之间。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)的体外转录成mRNA之前还包括对线性化重组质粒进行鉴定。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)的去除mRNA中的外源DNA的方法为:按照与转录体系的体积比1:10-1:20加入无RNA酶的DNase I,37℃0.5-1h。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,按照与转录体系的体积比1:10加入无RNA酶的DNase I,37℃0.5h。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)和(3)之间,还包括提取转录产物中的mRNA,分别对其进行PCR和RT-PCR检测,根据上述PCR和RT-PCR两个检测方法的结果判断是否去除外源DNA。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括步骤(4)提纯Armored RNA。
8.权利要求1-7任一所述的方法在制备RNA阳性参考物质中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410770769.1A CN105734046B (zh) | 2014-12-12 | 2014-12-12 | 无细胞表达系统制备Armored RNA的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410770769.1A CN105734046B (zh) | 2014-12-12 | 2014-12-12 | 无细胞表达系统制备Armored RNA的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105734046A CN105734046A (zh) | 2016-07-06 |
CN105734046B true CN105734046B (zh) | 2019-04-26 |
Family
ID=56241570
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410770769.1A Expired - Fee Related CN105734046B (zh) | 2014-12-12 | 2014-12-12 | 无细胞表达系统制备Armored RNA的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105734046B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106632648B (zh) * | 2016-12-30 | 2020-04-17 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种助表达基因片段及其无细胞表达adcy2蛋白系统 |
CN107058271A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-08-18 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种改进的腺苷酸环化酶的制备方法 |
WO2018171747A1 (zh) * | 2017-03-23 | 2018-09-27 | 康码(上海)生物科技有限公司 | 一种体外DNA-to-Protein(D2P)的合成体系、制剂、试剂盒及制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101173252A (zh) * | 2006-10-31 | 2008-05-07 | 杭州市疾病预防控制中心 | 披甲rna及其制备方法 |
CN101503700A (zh) * | 2007-11-30 | 2009-08-12 | 卫生部北京医院 | 一种可产生包装大片段rna病毒样颗粒的双质粒表达系统 |
CN102559731A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-11 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种假病毒载体及其制备方法和应用 |
CN103923887A (zh) * | 2014-04-16 | 2014-07-16 | 辽宁医学院 | 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
-
2014
- 2014-12-12 CN CN201410770769.1A patent/CN105734046B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101173252A (zh) * | 2006-10-31 | 2008-05-07 | 杭州市疾病预防控制中心 | 披甲rna及其制备方法 |
CN101503700A (zh) * | 2007-11-30 | 2009-08-12 | 卫生部北京医院 | 一种可产生包装大片段rna病毒样颗粒的双质粒表达系统 |
CN102559731A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-11 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种假病毒载体及其制备方法和应用 |
CN103923887A (zh) * | 2014-04-16 | 2014-07-16 | 辽宁医学院 | 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105734046A (zh) | 2016-07-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lau et al. | Novel partitivirus enhances virulence of and causes aberrant gene expression in Talaromyces marneffei | |
Chang et al. | Visual detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using CRISPR‐Cas13a | |
Goodman et al. | Clinical isolates of Trichomonas vaginalis concurrently infected by strains of up to four Trichomonasvirus species (Family Totiviridae) | |
Kuo et al. | Infection with enterovirus 71 or expression of its 2A protease induces apoptotic cell death | |
Flick et al. | Reverse genetics for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus | |
Stang et al. | Characterization of virus isolates by particle-associated nucleic acid PCR | |
Haldipur et al. | Positive regulation of hepatitis E virus replication by microRNA-122 | |
CN105734046B (zh) | 无细胞表达系统制备Armored RNA的方法 | |
Blanc et al. | Deep RNA sequencing reveals hidden features and dynamics of early gene transcription in Paramecium bursaria chlorella virus 1 | |
Besong-Ndika et al. | Cotranslational coat protein-mediated inhibition of potyviral RNA translation | |
CN107988340B (zh) | 一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用 | |
Mihindukulasuriya et al. | Nyamanini and midway viruses define a novel taxon of RNA viruses in the order Mononegavirales | |
Chen et al. | HoBi‐like pestivirus infection leads to bovine death and severe respiratory disease in China | |
Friedman et al. | Gene mapping and phylogenetic analysis of the complete genome from 30 single-stranded RNA male-specific coliphages (family Leviviridae) | |
Wang et al. | Viral and host transcriptomes in SARS-CoV-2-infected human lung cells | |
CN106282415B (zh) | 一种利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法 | |
CN103173568B (zh) | 一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法 | |
WO2020098806A1 (zh) | 鉴定rna分子中2'-o-甲基化修饰的方法及其应用 | |
Liang et al. | Complete genome sequences of two porcine deltacoronavirus strains from Henan Province, China | |
Gustin et al. | Bovine coronavirus nonstructural protein 1 (p28) is an RNA binding protein that binds terminal genomic cis-replication elements | |
CN109136382B (zh) | 一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法和系统 | |
Tozzo et al. | The importance of distinguishing menstrual and peripheral blood in forensic casework: a case report | |
Bokharaei-Salim et al. | The first detection of co-infection of double-stranded RNA virus 1, 2 and 3 in Iranian isolates of Trichomonas vaginalis | |
King et al. | Development of a novel recombinant encapsidated RNA particle: evaluation as an internal control for diagnostic RT-PCR | |
Tangudu et al. | Evidence that Lokern virus (family Peribunyaviridae) is a reassortant that acquired its small and large genome segments from Main Drain virus and its medium genome segment from an undiscovered virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190426 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |