CN102559731A - 一种假病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种假病毒载体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102559731A CN102559731A CN2011104450225A CN201110445022A CN102559731A CN 102559731 A CN102559731 A CN 102559731A CN 2011104450225 A CN2011104450225 A CN 2011104450225A CN 201110445022 A CN201110445022 A CN 201110445022A CN 102559731 A CN102559731 A CN 102559731A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- carrier
- pseudovirus
- pseudovirion
- sequence
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 title abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 claims description 57
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 9
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 7
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 102100026503 Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Human genes 0.000 claims description 5
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 claims description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 abstract description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 abstract 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- -1 amine acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 abstract 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 5
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012858 packaging process Methods 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000001998 small-angle neutron scattering Methods 0.000 description 1
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 description 1
- 230000010512 thermal transition Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种动物病原微生物假病毒载体及其制备技术。本发明将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5′非编码序列相应的cDNA序列连接到pTrcHis2A载体启动子的下游，构建了前假病毒载体。然后通过基因插入方法，将MS2噬菌体中外壳蛋白的第15-16个氨基酸之间加入6His纯化标签，这样含外源基因的假病毒颗粒表达后为RNA-蛋白质复合体，利用纯化蛋白方法捕获假病毒颗粒，可以减化假病毒颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的质量。本发明假病毒载体为pTrcMS，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，涉及一种动物病原微生物假病毒载体的制备方法及其应用。
背景技术
二十世纪末，Pasloske等人提出了一种新的RNA质控品制备技术，即装甲RNA(Armored RNA)技术(Pasloske B L，et al.Armored RNAtechnology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls andstandards[J].J Clin Microbiol，1998，36(12)：3590-3594；W alker Peach C R，et al.Ribonuclease resistant RNA controls(Armored RNA)for reversetranscription-PCR，branched DNA，and genotyping assays for hepatitis C virus[J].Clin Chem，1999，45(12)：2079-2085)。该技术解决了传统RNA质控品存在的问题(或者稳定性差，或存在生物传染隐患，或达不到监测核酸提取及反转录过程的目的等)。装甲RNA技术的原理是将包含有大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白基因的序列及外源基因克隆到表达载体中，这一载体能够将外源基因转录成RNA，并利用载体上MS2的外壳蛋白编码基因组装的外壳蛋白将其装配成球状RNA病毒结构的RNA-蛋白质复合体，我们称之为装甲RNA假病毒颗粒。
目前构建假病毒颗粒的常用假病毒载体主要由可以编码MS2噬菌体外壳蛋白的基因序列和具有高效表达的表达载体组成。MS2噬菌体是单链正性RNA病毒，为26nm长的20面体，包含有3个基因，编码成熟酶蛋白、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白4种蛋白质分子。噬菌体由180个外壳蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成。每个MS2噬菌体是含有180个拷贝的外壳蛋白，一拷贝的成熟酶蛋白，包裹一分子RNA的正二十面体(贾盘兴.噬菌体分子生物学-基木知识和技能[M].北京：科学出版社，2001，2-5)。在早期噬菌体的研究中发现，噬菌体复制酶基因的5’端有一个约21个核苷酸组成的茎-环区域(操纵子或pac位点)，噬菌体外壳蛋白的二聚体与这个茎环结构的结合不但引发了外壳蛋白本身的组装，而且还引发了外壳蛋白包裹整个噬菌体基因组RNA的过程(Peabody DS.The RNAbinding site of bacteriophage MS2 coat protein.EMBO J，1993，12(2)：595-600；Peabody DS.Role of the coat protein-RNA interaction in thelife cycle of bacteriophage MS2.Mol Gen Genet，1997，254(4)：358-364)。MS2噬菌体成熟酶蛋白可与噬菌体RNA的两个位点发生作用。这种相互作用不是噬菌体包装过程所必须的，但是在噬菌体颗粒中这种相互作用可以用来保护基因组RNA不被广泛存在的核糖核酸酶消化(Shiba T，Suzuki Y.Localization of A protein in the RNA-Aprotein complex of RNA phage MS2.Biochim Biophys Acta.1981，654(2)：249-255.)研究表明MS2噬菌体成熟酶蛋白对噬菌体外壳的包装起重要作用(Kuzmanovic DA，Elashvili l，Wick C，et al.The MS2Coat Protein Shell is Likely assembled Under Tension：a novel role forthe MS2 Bacteriophage A Protein as revealed by small-angle neutronscattering[J].J Mol Biol，2006，355(5)：1095-1111)。裂解蛋白和复制酶蛋白不是噬菌体颗粒的组成部分。裂解蛋白的作用是裂解大肠杆菌细胞从而释放出病毒颗粒。复制酶蛋白的作用是与其它3个大肠杆菌宿主蛋白组成一个蛋白复合体，这个蛋白复合体负责基因组RNA的复制和合成。在MS2噬菌体外壳蛋白的研究中发现外壳蛋白与噬菌体复制酶5′端由19个碱基(19mer)组成的茎环结构RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时又将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。研究人员发现在包装位点后引入非噬菌体基因序列也可以引发包装。因此，如果将外源基因克隆于MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达过程中噬菌体外壳蛋白得以表达并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。由于单独表达的外壳蛋白组装过程不成熟，不能得到耐RNase的病毒包膜，研究者将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5′非编码序列相应的cDNA序列都连接到表达载体启动子下游，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和外壳蛋白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA的协同作用下，外壳蛋白可组装为成熟的假病毒颗粒外壳，并具有耐RNase作用的特性。
在假病毒颗粒制备技术中，目前存在的最大问题是纯化问题以及含有假病毒颗粒溶液的纯度问题。传统方法一般如下操作：含有外源基因的重组体成功构建后进行诱导表达，然后破碎细胞，双酶(DNaseI和RNase A)消化，再按照噬菌体纯化方法进行纯化：盐沉淀，梯度离心回收假病毒颗粒。这种方法操作繁琐，对设备要求高(需要高速低温离心机)，更关键的是：梯度离心回收的含有假病毒颗粒的溶液中仍然存在一定量的核酸，并且残余核酸在PCR鉴定含有假病毒颗粒溶液的纯度过程中很容易使PCR产生假阳性，更进一步影响到假病毒颗粒定量的研究。虽然有些研究人员在纯化的含有假病毒颗粒溶液提取RNA后，再进行DNase I酶消化，以去除残存核酸干扰，但这样会造成制备的RNA损失很大，同样造成下一步定量不精确。
发明内容
本发明的目的是提供一种假病毒载体pTrcMS。
本发明的另一目的是提供制备假病毒载体pTrcMS的方法和应用。
所述的假病毒载体包括出发载体的启动子序列和终止子序列，MS2噬菌体(NC_001417)成熟酶蛋白基因编码序列、突变的外壳蛋白基因编码序列、部分裂解蛋白和复制酶基因编码序列，出发载体一个末端的多克隆位点序列。
其中，突变的外壳蛋白基因编码序列是在位于MS2噬菌体的外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间，插入6His标签(CATCACCATCACCATCAC)得到的。
所述的出发载体为pTrcHis2A载体。
本发明提供的假病毒载体为pTrcMS，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。假病毒载体pTrcMS结构图见图1。
本发明提供了一种假病毒载体pTrcMS的构建方法，包括以下步骤：
1)在pTrcHis 2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体MS2的成熟酶蛋白、外壳蛋白、部分裂解蛋白和复制酶的基因编码序列，得到前假病毒载体pTrcHis-MS2；
2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白的第15-16个氨基酸之间插入6His序列，构建得到假病毒载体；
3)假病毒载体pTrcMS用His柱进行纯化。
具体地，上述步骤2)是以步骤1)获得的前假病毒载体pTrcHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，分别进行PCR扩增反应，50ul PCR扩增的反应体系为：5×
STAR Buffer(Mg2+ plus)10ul，
STAR HS DNAPolymerase 1.3U，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，primer1(10pmol/ul)1ul，primer2(10pmol/ul)1ul，pTrcHis-MS2 DNA 10ng，补ddH2O至50ul。PCR扩增的循环程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，回收纯化扩增产物；
用XhoI和Hind III双酶切前假病毒载体pTrcHis-MS2；采用In-
HD Cloning Kit将两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrcHis-MS2连接，转化受体菌，摇菌、PCR鉴定(Primer-U1：5’-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3’，Primer-L1：5’-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3’)，获得阳性质粒pTrcMS；pTrcMS重组菌采用IPTG诱导表达，离心收集菌体。沉淀中加入细胞裂解液Fast BreakTM CellLysis Reagent(10×)破碎细胞，离心收集上清，采用MagneHisTMProtein Purification System纯化蛋白方式回收产物，得到假病毒载体pTrcMS。
本发明提供了含有突变基因的PCR引物对，其核苷酸序列为：
Primer1-F：5’-AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3’，
Primer1-R：5’-GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’；
Primer2-F：5’-GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，
Primer2-R：5’-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3’。
本发明提供了一种假病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
1)在pTrcHis 2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体MS2的成熟酶蛋白、外壳蛋白、部分裂解蛋白和复制酶的基因片段，得到前假病毒载体pTrcHis-MS2；
2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白的第15-16个氨基酸之间插入6His序列，具体是以步骤1)获得的前假病毒载体pTrcHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，其核苷酸序列为：
Primer1-F：5’-AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3’，
Primer1-R：5’-GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’；
Primer2-F：5’-GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，
Primer2-R：5’-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3’；
分别进行PCR扩增反应，50ul PCR扩增的反应体系为：5×STAR Buffer(Mg2+plus)10ul，
STAR HS DNA Polymerase1.3U，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，primer1(10pmol/ul)1ul，primer2(10pmol/ul)1ul，pTrcHis-MS2DNA 10ng，补ddH2O至50ul。PCR扩增的循环程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，回收纯化扩增产物；
用XhoI和Hind III双酶切前假病毒载体pTrcHis-MS2；采用In-
HD Cloning Kit将两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrcHis-MS2连接，转化受体菌，摇菌、PCR鉴定，鉴定用引物为(Primer-U1：5’-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3’，Primer-L1：5’-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3’)，获得阳性质粒pTrcMS；pTrcMS重组菌采用IPTG诱导表达，离心收集菌体。沉淀中加入细胞裂解液Fast BreakTM Cell Lysis Reagent(10×)破碎细胞，离心收集上清，采用MagneHisTM Protein Purification System纯化蛋白方式回收产物，得到假病毒载体pTrcMS。
本发明提供的假病毒载体的构建方法，还包括将步骤2)获得的假病毒载体pTrcMS用His柱进行纯化。
本发明提供了一种假病毒颗粒，含有假病毒载体pTrcMS及其携带有外源基因的噬菌体基因组。
本发明提供了一种假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，将外源基因克隆于假病毒载体pTrcMS中的MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达噬菌体外壳蛋白并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，得到假病毒颗粒。
本发明提供了假病毒载体pTrcMS或假病毒颗粒在制备检测动物病原微生物质控品中的应用。假病毒颗粒主要作为参比物质，应用于各类动物病原微生物核酸和血清学检测技术。因此本发明还提供了假病毒载体pTrcMS或假病毒颗粒在制备动物病原微生物检测试剂中的应用。
本发明提供的假病毒载体pTrcMS用于制备假病毒颗粒可以大大减少假病毒颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的质量。本发明制备的假病毒颗粒，具有以下特点：
(1)易纯化。由于假病毒颗粒表达后为RNA-蛋白质复合体，利用His纯化蛋白方法捕获假病毒颗粒，可以大大减少假病毒颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的质量。
(2)耐核酸酶，稳定性好，易保存和运输。由于基因组RNA包裹在假病毒载体的外壳蛋白内，所以可以抵抗外界核酸酶的作用，不易被降解。因此，假病毒稳定性良好，在室温条件下可以保存至少30d，4℃可以保存更长时间，从而解决了RNA质控品在使用、保存和运输中的稳定性问题。
(3)无生物传染性，安全。与自然源性病毒相比，假病毒颗粒整合了其他病毒的外壳蛋白，而且核酸分子上编码外壳蛋白的基因被修饰掉，所以这种病毒丧失了病毒的自我复制能力，只能进行“一个细胞周期”的侵染，从而得到的假病毒颗粒无传染性，不会对实验人员造成伤害，也不会对环境造成污染。
(4)全程监控核酸制备及鉴定过程。假病毒颗粒的RNA-蛋白复合体的结构与天然病毒相似，即都是外壳蛋白包裹核酸，因此可以把假病毒颗粒视为病毒材料对待，必须经过RNA提取、反转录后才可用于PCR扩增，从而对RNA病毒的检测进行全程监控，保证试验数据的可靠性。
附图说明
图1显示的是假病毒载体pTrcMS结构图谱；
图2显示的是假病毒载体pTrcMS纯化效果，图中1为RT-PCR鉴定结果，2为PCR鉴定结果，3为阴性对照，M为Marker2000；
图3显示的是假病毒颗粒pTrcMS-NP对温度的敏感性试验结果。其中1为空白对照，2-6分别为56℃/1d、37℃/20d、室温/30d、4℃/30d、-20℃/60d保存条件下，样本RT-PCR鉴定结果，M为Marker2000；
图4显示的是假病毒颗粒pTrcMS-NP对RNase A的稳定性试验结果。图中1为阴性对照，2-6分别为RNase A 1μg、2μg、3μg、4μg、0μg样本处理后RT-PCR鉴定结果，M为Marker2000；
图5显示的是假病毒颗粒pTrcMS-NP的电镜观察图。(80000×JEM1400)。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的生化试剂均为市售购买得到。
实施例1前假病毒载体pTrcHis-MS2构建
1)提取MS2噬菌体(ATCC 15597-B1，购买自美国ATCC)RNA，参考一步法one step RT-PCR kit进行RT-PCR扩增，PCR产物回收纯化连入pGEM-T Easy Vector，构建MS2-T质粒。MS2-T质粒(本实验室保存)和表达载体pTrcHis2A(购自Invitrogen公司)分别进行NcoI和BglII双酶切，酶切体系如下：NcoI/BglII 10U，10×K buffer 2ul，0.1％BSA 2ul，模板1μg，补水至20ul。37℃2h。分别将酶切产物进行胶回收纯化，产物分别命名为MS2-T(N/B)、pTrcHis2A(N/B)。
2)将酶切产物用T4 DNA连接酶连接，连接体系如下：10×buffer 1ul，T4DNA酶0.5ul，pTrcHis2A(N/B)50ng，MS2-T(N/B)120ng，25℃，10min，然后立即放冰上。
3)将连接产物进行转化，挑取单克隆摇菌、测序。测序正确的菌株命名为pTrcHis-MS2。
实施例2假病毒载体pTrcMS构建
利用基因插入的方法，在pTrcHis-MS2载体上MS2中外壳蛋白基因编码序列的15-16个氨基酸之间插入6His序列，得到假病毒载体pTrcMS，其具体构建方法如下：
①在PCR引物中引入突变的碱基，以前假病毒载体pTrcHis-MS2为模板，分别以Primer1和Primer2为引物对，用STAR HS DNAPolymerase分别进行PCR扩增，扩增产物命名为PCR产物I、II。其中，PCR扩增引物为：
Primer1-F：5’-AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3’，
Primer1-R：5’-GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’；
Primer2-F：5’-GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，
Primer2-R：5’-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3’。
50ul PCR扩增的反应体系为：STAR Buffer(Mg2+ plus)10ul，
STAR HS DNA Polymerase 1.3U，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，primer1(10pmol/ul)1ul，primer2(10pmol/ul)1ul，pTrcHis-MS2 DNA 10ng，补ddH2O至50ul。PCR扩增的循环程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。扩增产物纯化回收，保存备用。
②pTrcHis-MS2质粒采用XhoI和HindIII双酶切，体系如下：XhoI/HindIII 10U，10×M buffer 5ul，模板1μg，补水至50ul。37℃2h。分别将酶切产物进行胶回收纯化，命名为Vector DNA。
③使用In-
HD Cloning Kit(Clontech Code No.639648)，将PCR产物I、PCR产物II和Vector DNA连接，反应体系及条件如下：PCR产物I 50ng，PCR产物II 50ng，Vector DNA 300ng，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2ul，补水至10ul。50℃15min。
④取上述In-Fusion产物2.5ul热转化至E.coli Competent CellJM109(Code No.D9052)，37℃过夜培养，挑取阳性菌落进行测序鉴定，鉴定用引物为(Primer-U1：5’-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3’，Primer-L1：5’-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3’)，将测序正确的质粒命名为pTrcMS。
⑤假病毒载体菌体采用IPTG(终浓度为1mol/L)诱导表达16h，5000rpm，离心10min，收集菌体。
⑥产物沉淀加入细胞裂解液Fast BreakTM Cell Lysis Reagent(10×)10ul/ml菌体沉淀，涡旋混匀，室温消化30min。4℃，13000rpm，离心15min。上清加入MagneHisTMNi-Particles 10ul/ml菌体，室温结合30min。溶液放置磁力架上，吸附2min，除去上清，加入200ulMagneHisTM Bingding/Wash Buffer，颠倒混匀，放置磁力架上吸附，除去上清。将上述MagneHisTMNi-Particles重复洗涤。洗涤的MagneHisTMNi-Particles加入Elution Buffer 10ul/ml菌体，颠倒混匀，室温作用30min，放置磁力架上吸附，回收上清，即为纯化后的假病毒载体pTrcMS。
假病毒载体核苷酸序列见SEQ ID No.1所示。其中1bp-410bp为pTrcHis2A载体前半部分基因序列，190bp-382bp为启动子区域，411bp-416bp为NcoI酶切位点，1713bp-1730bp为突变序列(插入的6His标签)，2141bp-2146bp为BglII，2172bp-2177bp为HindIII，2178bp-6119bp区域为pTrcHis2A载体后半部分基因序列，2352bp-2508bp区域为pTrcHis2A载体终止子区域，2473bp-2516bp区域为pTrcHis2A载体终止子rrnB_T1，2648bp-2676bp区域为pTrcHis2A载体终止子rrnB_T2。
⑦回收的假病毒载体分别进行PCR和RT-PCR鉴定，以判定假病毒载体的纯度，即是否溶液中存在残余的基因组DNA。纯化产物作为RT-PCR反应模板，其中一组不经过反转录直接进行PCR鉴定，检测结果为阴性，表明制备的假病毒颗粒溶液中，无基因组DNA污染。另一组样本提取RNA后进行RT-PCR鉴定，检测结果呈阳性，表明溶液中含有假病毒颗粒(见图2)。
实施例3尼帕(NP)假病毒颗粒的研制
1.构建pTrcMS-NP质粒
pGEM-T-NP质粒与实施例2制备的pTrcMS质粒分别进行pstI和HindIII双酶切，胶回收纯化，连接，测序，构建pTrcMS-NP。具体方法参照实施例1前假病毒载体pTrcHis-MS2的构建方法。
2.pTrcMS-NP假病毒颗粒的纯化制备
将pTrcMS-NP重组菌进行诱导表达，表达产物处理同实施例2，回收的假病毒颗粒分别进行PCR和RT-PCR鉴定。PCR鉴定产物电泳显示无目的条带，RT-PCR鉴定产物电泳显示存在明显目的条带，表明该溶液中含有尼帕假病毒颗粒，并且无DNA污染。
实施例4pTrcMS-NP假病毒假病毒颗粒特性鉴定
将实施例3获得的纯化的假病毒颗粒进行特性鉴定。主要从温度敏感性、RNaseA攻击和形态观察三方面进行鉴定。PCR鉴定引物分别为Primer-NPF：5’-AACTGCAGACAAGCAATGGAGCCGGAC-3’；Primer-NPR：5’CCCAAGCTTCTCCCTGTATTGTCAATGAAG-3。PCR产物目的片段大小为450bp。
1)纯化后的假病毒颗粒温度敏感性试验
将50ul/管纯化的假病毒载体溶液分别放置于56℃/1d、37℃/20d、常温/30d、4℃/30d、-20℃/60d，进行样品处理后RT-PCR鉴定。
2)稳定性试验(RNase A攻击试验)
将50ul/管的假病毒颗粒溶液中分别加入RNase A(1mg/mL)1μl/2μl/3μl/4μl后，放入37℃，30min，对照组不加RNaseA。所有样品均进行RNA抽提，进行RT-PCR鉴定。
3)形态观察
纯化后的假病毒颗粒溶液先进行1％醋酸双氧铀染色，然后自然干燥，最后透射电子显微镜进行形态观察。
经实验结果表明，含假病毒颗粒的溶液在37℃情况下至少可以保存20天，随着保存温度降低，保存时间越长。由此可以看出，该假病毒颗粒具有良好的稳定性，结果见图3。
用RNaseA处理的假病毒颗粒溶液与对照组样品分别RT-PCR鉴定，检测结果一致，表明制备的假病毒颗粒能够抵抗RNaseA的降解见图4。
经电镜观察，看到直径大约为26nm的多边形颗粒，如图5，即诱导表达的假病毒颗粒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种假病毒载体，其特征在于，包括出发载体的启动子序列和终止子序列，MS2噬菌体成熟酶蛋白基因编码序列、突变的外壳蛋白基因编码序列、部分裂解蛋白和复制酶基因编码序列，出发载体一个末端的多克隆位点序列。
2.如权利要求1所述的假病毒载体，其特征在于，所述的突变的外壳蛋白基因编码序列是在位于MS2噬菌体的外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间，插入6His标签，核苷酸序列为CATCACCATCACCATCAC。
3.如权利要求1或2所述的假病毒载体，所述的出发载体为pTrcHis2A。
4.如权利要求3所述的假病毒载体，其为pTrcMS，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.一种权利要求4所述假病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在pTrcHis 2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体MS2的基因片段，得到前假病毒载体pTrcHis-MS2；
2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间插入6His序列，构建得到假病毒载体；
3)假病毒载体pTrcMS用His柱进行纯化。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)是以前假病毒载体pTrcHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，分别进行PCR扩增反应，回收纯化扩增产物；用XhoI和Hind III双酶切前假病毒载体pTrcHis-MS2；两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrcHis-MS2连接，转化受体菌，经筛选，诱导表达，鉴定得到假病毒载体pTrcMS。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的含有突变基因的PCR引物对，其核苷酸序列为：
Primer1-F：5’-AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3’，
Primer1-R：5’-GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’；
Primer2-F：5’-GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，
Primer2-R：5’-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3’。
8.一种假病毒颗粒，其特征在于，含有权利要求4所述假病毒载体pTrcMS及其携带有外源基因的噬菌体基因组。
9.一种假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，将外源基因克隆于权利要求4所述假病毒载体pTrcMS中的MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达噬菌体外壳蛋白并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，得到假病毒颗粒。
10.权利要求4所述的假病毒载体或权利要求8所述的假病毒颗粒在制备检测动物病原微生物质控品的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110445022 CN102559731B (zh) | 2011-12-27 | 2011-12-27 | 一种假病毒载体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110445022 CN102559731B (zh) | 2011-12-27 | 2011-12-27 | 一种假病毒载体及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102559731A true CN102559731A (zh) | 2012-07-11 |
| CN102559731B CN102559731B (zh) | 2013-05-15 |
Family
ID=46406337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110445022 Expired - Fee Related CN102559731B (zh) | 2011-12-27 | 2011-12-27 | 一种假病毒载体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102559731B (zh) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104711373A (zh) * | 2015-04-03 | 2015-06-17 | 张瑾 | 耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法 |
| CN105734046A (zh) * | 2014-12-12 | 2016-07-06 | 中国检验检疫科学研究院 | 无细胞表达系统制备Armored RNA的方法 |
| CN105907727A (zh) * | 2016-05-03 | 2016-08-31 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 内含三种食源性病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
| CN105907726A (zh) * | 2016-05-03 | 2016-08-31 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
| CN105950565A (zh) * | 2016-05-03 | 2016-09-21 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 高稳定性假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法 |
| CN105969786A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-09-28 | 博奥生物集团有限公司 | 一种表达ms2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶的质粒 |
| CN106011078A (zh) * | 2016-05-03 | 2016-10-12 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 内含轮状病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
| CN106085974A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-11-09 | 博奥生物集团有限公司 | 一种寨卡病毒假病毒颗粒及其制备方法 |
| WO2017107060A1 (zh) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种新型病毒样颗粒表达载体、其构建方法及应用 |
| CN110964849A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-04-07 | 华南农业大学 | 一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法及检测非洲猪瘟病毒的试剂盒 |
| CN112877366A (zh) * | 2020-03-10 | 2021-06-01 | 广州复能基因有限公司 | 用于检测来自dna或rna生物体的样品靶标的可掺入参照标准品 |
-
2011
- 2011-12-27 CN CN 201110445022 patent/CN102559731B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 吴敏: "MS2噬菌体壳蛋白载动的HIV反链基因阻断病毒蛋白质合成", 《中华徽生物学和免疫学杂志》 * |
| 李斌等: "H5N1 型禽流感病毒核蛋白C 端缺失削弱核蛋白间的相互作用", 《生物技术通讯》 * |
| 陆学东，等: "HIV-1 gag基因p17+24重组抗原表达、纯化及抗原性分析", 《中华微生物学和免疫学杂志》 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105734046A (zh) * | 2014-12-12 | 2016-07-06 | 中国检验检疫科学研究院 | 无细胞表达系统制备Armored RNA的方法 |
| CN105734046B (zh) * | 2014-12-12 | 2019-04-26 | 中国检验检疫科学研究院 | 无细胞表达系统制备Armored RNA的方法 |
| CN104711373A (zh) * | 2015-04-03 | 2015-06-17 | 张瑾 | 耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法 |
| WO2017107060A1 (zh) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种新型病毒样颗粒表达载体、其构建方法及应用 |
| CN105907726A (zh) * | 2016-05-03 | 2016-08-31 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
| CN106011078A (zh) * | 2016-05-03 | 2016-10-12 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 内含轮状病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
| CN105950565A (zh) * | 2016-05-03 | 2016-09-21 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 高稳定性假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法 |
| CN105907727A (zh) * | 2016-05-03 | 2016-08-31 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 内含三种食源性病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 |
| CN105969786A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-09-28 | 博奥生物集团有限公司 | 一种表达ms2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶的质粒 |
| CN106085974A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-11-09 | 博奥生物集团有限公司 | 一种寨卡病毒假病毒颗粒及其制备方法 |
| CN105969786B (zh) * | 2016-06-07 | 2019-08-02 | 博奥生物集团有限公司 | 一种表达ms2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶的质粒 |
| CN106085974B (zh) * | 2016-06-07 | 2019-08-09 | 博奥生物集团有限公司 | 一种寨卡病毒假病毒颗粒及其制备方法 |
| CN110964849A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-04-07 | 华南农业大学 | 一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法及检测非洲猪瘟病毒的试剂盒 |
| CN112877366A (zh) * | 2020-03-10 | 2021-06-01 | 广州复能基因有限公司 | 用于检测来自dna或rna生物体的样品靶标的可掺入参照标准品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102559731B (zh) | 2013-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102559731B (zh) | 一种假病毒载体及其制备方法和应用 | |
| AU2016270649B2 (en) | Methods for screening bacteria, archaea, algae, and yeast using crispr nucleic acids | |
| Hynes et al. | DNA packaging bias and differential expression of gene transfer agent genes within a population during production and release of the Rhodobacter capsulatus gene transfer agent, RcGTA | |
| Scholl et al. | Bacteriophage K1-5 encodes two different tail fiber proteins, allowing it to infect and replicate on both K1 and K5 strains of Escherichia coli | |
| Wang et al. | A single ssRNA segment encoding RdRp is sufficient for replication, infection, and transmission of ourmia-like virus in fungi | |
| Hooton et al. | Salmonella Typhimurium-specific bacteriophage ΦSH19 and the origins of species specificity in the Vi01-like phage family | |
| Desplats et al. | Snapshot of the genome of the pseudo-T-even bacteriophage RB49 | |
| Choi et al. | Extracellular vesicles of the hyperthermophilic archaeon “Thermococcus onnurineus” NA1T | |
| Morimoto et al. | Transcriptome analysis of a bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa during Ma-LMM01 phage infection | |
| Tang et al. | Haloviruses HF1 and HF2: evidence for a recent and large recombination event | |
| Alimolaei et al. | An efficient DNA extraction method for Lactobacillus casei, a difficult-to-lyse bacterium | |
| Zhang et al. | Biological characteristics and genomic analysis of a Stenotrophomonas maltophilia phage vB_SmaS_BUCT548 | |
| Hardies et al. | Morphology, physiological characteristics, and complete sequence of marine bacteriophage ϕRIO-1 infecting Pseudoalteromonas marina | |
| Morimoto et al. | Cooccurrence of broad-and narrow-host-range viruses infecting the bloom-forming toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa | |
| Kharina et al. | Temperate bacteriophages collected by outer membrane vesicles in Komagataeibacter intermedius | |
| Martin et al. | Cylindrospermopsis raciborskii virus and host: genomic characterization and ecological relevance | |
| Kenzaka et al. | High-frequency phage-mediated gene transfer among Escherichia coli cells, determined at the single-cell level | |
| Summer et al. | Genomic and biological analysis of phage Xfas53 and related prophages of Xylella fastidiosa | |
| Peng | Evidence for the horizontal transfer of an integrase gene from a fusellovirus to a pRN-like plasmid within a single strain of Sulfolobus and the implications for plasmid survival | |
| Yoshida-Takashima et al. | Genome sequence of a novel deep-sea vent epsilonproteobacterial phage provides new insight into the co-evolution of Epsilonproteobacteria and their phages | |
| Hjorleifsdottir et al. | Isolation, growth and genome of the Rhodothermus RM378 thermophilic bacteriophage | |
| Morozova et al. | A novel thermophilic Aeribacillus bacteriophage AP45 isolated from the Valley of Geysers, Kamchatka: Genome analysis suggests the existence of a new genus within the Siphoviridae family | |
| Zhang et al. | Roseophage RDJLΦ1, infecting the aerobic anoxygenic phototrophic bacterium Roseobacter denitrificans OCh114 | |
| CN113136372A (zh) | 一种重组噬菌体的构建方法 | |
| CN112094792A (zh) | 一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wu Shaoqiang Inventor after: Deng Junhua Inventor after: Lin Xiangmei Inventor after: Zhang Yongning Inventor after: Wang Caixia Inventor before: Wu Shaoqiang Inventor before: Deng Junhua Inventor before: Lin Xiangmei Inventor before: Wang Caixia |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WU SHAOQIANG DENG JUNHUA LIN XIANGMEI WANG CAIXIA TO: WU SHAOQIANG DENG JUNHUA LIN XIANGMEI ZHANG YONGNING WANG CAIXIA |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wu Shaoqiang Inventor after: Chen Hongjun Inventor after: Deng Junhua Inventor after: Lin Xiangmei Inventor after: Zhang Yongning Inventor after: Wang Caixia Inventor before: Wu Shaoqiang Inventor before: Deng Junhua Inventor before: Lin Xiangmei Inventor before: Zhang Yongning Inventor before: Wang Caixia |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130515 |