CN105907726A - 内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 - Google Patents

内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105907726A
CN105907726A CN201610286386.6A CN201610286386A CN105907726A CN 105907726 A CN105907726 A CN 105907726A CN 201610286386 A CN201610286386 A CN 201610286386A CN 105907726 A CN105907726 A CN 105907726A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
pseudovirion
nucleic acid
plasmid vector
acid fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610286386.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105907726A9 (zh
Inventor
姚琳
江艳华
李风铃
朱文嘉
郭莹莹
庞倩倩
王联珠
翟毓秀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Original Assignee
Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences filed Critical Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority to CN201610286386.6A priority Critical patent/CN105907726A/zh
Publication of CN105907726A publication Critical patent/CN105907726A/zh
Publication of CN105907726A9 publication Critical patent/CN105907726A9/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
    • C12N2770/32431—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法。所述假病毒颗粒内含甲型肝炎病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测甲型肝炎病毒的靶标。所述方法包括构建含有编码Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒核酸片段对应的cDNA的质粒载体，然后将所述质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达，接着分离纯化得到所述假病毒颗粒。所述假病毒颗粒能作为甲型肝炎病毒检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。通过本发明的方法可以制备具有无传染性、浓度高、稳定性好的假病毒颗粒。

Description

内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法。
背景技术
甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)是一种无包膜单股正链RNA病毒，为小核糖核酸病毒科嗜肝病毒属，是导致人类急性传染病-甲型肝炎的病原体。HAV主要通过粪-口途径传播，食用污染的食物或水可以引起感染甚至疫情暴发。
受污染的毛蚶等双壳贝类是甲型肝炎传播的重要载体，研究表明贝类富集HAV的能力相当强，可将水中的HAV浓缩10～1000倍。食用加热不彻底的污染贝类将导致严重的公共卫生问题。
我国是贝类养殖大国与出口大国，产量与进出口量连年位居世界第一，贝类在我国海洋经济中占有重要地位。加强检测与监控是确保贝类质量安全与公共卫生安全的关键途径，也是保障海洋经济可持续发展的必要手段。但与临床样本不同的是，贝类中HAV的含量低，抑制物多，因此以RT-PCR及实时荧光RT-PC等分子生物学技术成为贝类等食品中HAV检测的“金标准”。
但作为分子检测技术重要组成部分的阳性标准样品却成为制约检测技术发展和应用的瓶颈。综合国内外的参考文献，有报道使用灭活病毒做阳性标准样品，但存在残留的灭活试剂(如甲醛等)影响核酸提取的弊端；有的使用含检测片段的质粒DNA做阳性标准样品，但不能评价病毒粒子提取与RNA反转录等重要检测步骤；有的使用体外转录RNA做阳性标准样品，也存在极易降解并不能评价病毒粒子提取等步骤的问题。
因此急需研发一种稳定性好、与病毒高度相似、无生物安全隐患、适用于检测标准的标准品。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒基于Qbeta噬菌体构建而得，内含有甲型肝炎病毒的核酸片段，能作为甲型肝炎病毒检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。
所述假病毒颗粒内含有甲型肝炎病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测所述甲型肝炎病毒的靶标。所述核酸片段优选是与序列表中SEQ ID No.1的DNA序列相对应的RNA。
优选地，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，其中，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表SEQ ID No.2所示的序列。
优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。所述大肠杆菌优选是大肠杆菌BL21。
本发明还提供一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。优选地，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表SEQ ID No.2所示的序列。
优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。
优选地，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段的表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I。
本发明还提供一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列和甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译；(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。
优选地，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表SEQ ID No.2所示的序列。
优选地，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。
优选地，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，获得所述质粒载体。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。
优选地，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译。
本发明提供的假病毒颗粒，由于内含有甲型肝炎病毒的核酸片段，该核酸片段能作为检测靶标，使得所述假病毒颗粒能作为甲型肝炎病毒检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构，从而大大减少了购置、运输、储存的成本与空间。甲型肝炎病毒的核酸片段可以是例如国家标准GB/T 22287-2008中规定的甲型肝炎病毒检测靶标序列对应的RNA。
本发明所提供的质粒载体包括从5'端到3'端依次为Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点，这些酶切位点均在Qbeta噬菌体的克隆片段中缺失，从而可以依据需要十分方便地在该质粒载体的aMCS中插入其他RNA病毒核酸片段对应的cDNA，用于制备检测其它RNA病毒核酸时的标准样品。而且，与这些酶切位点对应的限制性内切酶价格十分便宜，可极大地降低生产成本。
利用本发明所提供的制备假病毒颗粒的方法，能够方便可靠地获得无传染性、拷贝数高、稳定性好的假病毒颗粒，仅需少量制备，通过稀释即可制备大量的标准样品，能够很好地满足医院、食品卫生、质检、科研等检测机构的需要。
附图说明
图1是具体实施方式中QGBHAV片段组成的示意图。
图2是具体实施方式中质粒载体pET-QGBHAV的图谱示意图。
图3是PCR扩增的QGBHAV片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是质粒载体pET-QGBHAV的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5是假病毒颗粒中残留质粒DNA检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M是DNA分子量标准，泳道1是以质粒载体pET-QGBHAV为模板的阳性对照的扩增结果，泳道2是以ddH2O为模板的阴性对照的扩增结果，泳道3和4是以待检测的假病毒颗粒为模板的扩增结果。
图6是质粒载体pET-QGBHAV在大肠杆菌BL21中表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白质分子量标准，泳道1是大肠杆菌BL21对照，泳道2是转化有质粒载体pET-QGBHAV、但未进行诱导表达的重组大肠杆菌BL21对照，泳道3和4是转化有质粒载体pET-QGBHAV并进行了诱导表达的重组大肠杆菌BL21实验组。
图7是示出在15000倍电镜下观察到的假病毒颗粒的图。
图8是示出对实施例2的假病毒颗粒中的甲型肝炎病毒RNA片段进行实时荧光RT-PCR检测的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例以及附图对本发明的一个具体实施方式进行详细的说明。
实施例1：构建质粒载体pET-QGBHAV
首先，参考Genbank数据库中的Qbeta噬菌体基因组序列(登录号为AB 971354)以及国家标准GB/T 22287-2008所规定的HAV检测靶标序列，通过例如人工合成的方式制备包括Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列、HAV核酸片段对应的cDNA序列及辅助多克隆位点在内的DNA片段(下文称为QGBHAV片段)(见图1)，该DNA片段具有序列表中SEQ ID No.1所示的序列。辅助多克隆位点从5'端到3'端包括例如Apa I、KpnI、Pst I、Spe I、Sph I和Not I等。将上述DNA片段亚克隆到pUC-18载体中，得到中间质粒载体，命名为pUC-QGBHAV。
接下来，以中间质粒载体pUC-QGBHAV为模板进行PCR扩增以获取QGBHAV片段。根据QGBHAV片段5'端的成熟酶编码基因上游的非编码序列及3'端的多克隆位点序列设计引物对PHAVPF与PHAVPR(见表1)，为了便于与原核表达载体pET-28a(+)进行同源克隆，在引物PHAVPF 5'端添加了pET-28a(+)载体上BamH I上游的同源序列，在引物PHAVPR 5'端添加了pET-28a(+)载体上Xho I下游的同源序列。
表1
引物 序列
PHAVPF 5’-gactggtggacagcaaatgggtcgcGGATCCGGGGACCCCCT-3’
PHAVPR 5’-gtggtggtggtggtgctcgagtGCGGCCGCTCTAGAGC-3’
PCR反应体系如表2所示。扩增条件如下：95℃预变性5min；循环反应30次，循环条件为94℃1min，52℃1min，72℃2.5min；72℃延伸5min。
通过0.8％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，结果显示扩增产物条带出现在2500bp附近，与目标产物QGBHAV片段的预期大小2501bp一致(见图3)。回收并纯化扩增所获取的QGBHAV片段，用于后续的载体构建。
表2
反应体系的组成 用量
模板pUC-QGBHAV 0.5μL
PHAVPF(10μM) 1.0μL
PHAVPR(10μM) 1.0μL
dNTP mixture(各2.0mM) 2.0μL
PCR buffer(10×) 5.0μL
MgCl2(25mM) 4.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.4μL
ddH2O 36.1μL
线性化处理原核表达载体，本实施例以pET-28a(+)载体为例，用限制性内切酶BamH I与Xho I双酶切pET-28a(+)载体，回收并纯化酶切处理后得到的线性化pET-28a(+)载体，然后通过重组酶(例如南京诺唯赞生物科技有限公司生产的IIOne Step Cloning Kit)将上述获得的QGBHAV片段同源克隆至线性化的pET-28a(+)载体，反应体系如表3所示。在37℃下反应30min后，将产物放置于冰水浴5min，随后用于转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。经过挑菌、质粒提取、酶切与测序鉴定证实重组质粒构建正确，从而得到用于制备假病毒颗粒的质粒载体，命名为pET-QGBHAV。
pET-QGBHAV的图谱示意图见图2，酶切鉴定结果如图4所示。
表3
由于pET-28a(+)载体中原有的多克隆位点(MCS)中含有Qbeta噬菌体克隆片段中固有的多个酶切位点，不利于后期基因操作。上述构建的质粒载体pET-QGBHAV，切除了pET-28a(+)载体中原有的MCS，而替换成了从5'端到3'端依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点(aMCS)，从而可以十分方便地在aMCS中插入其他RNA对应的cDNA，用于制备检测其它RNA病毒核酸时的标准样品。
实施例2：假病毒颗粒的制备
将实施例1制备得到的质粒载体pET-QGBHAV转化入例如大肠杆菌BL21感受态细胞中，然后涂布于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的营养琼脂平板上，37℃培养18h。营养琼脂平板的具体制备方法如下：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，琼脂粉1.5g，溶于90mL ddH2O中，调pH值至7.0～7.2，补加ddH2O定容至100mL，高压灭菌后备用。
然后，从上述培养后的平板上挑取菌落单斑，并接种于3mL含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的液体LB培养基中，37℃培养18h。液体LB培养基的具体制备方法为：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，溶于90mL ddH2O中，调pH值至7.0～7.2，补加ddH2O定容至100mL，高压灭菌后备用。
按1:100的比例将上述培养的菌液接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的液体LB培养基中，在37℃培养至培养物的OD600达到0.6时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至其终浓度达0.2mmol/L～1.0mmol/L进行诱导表达，37℃振荡培养4h～16h之后，5000rpm离心10min，收集菌体。设置大肠杆菌BL21以及转化有pET-28a(+)载体的大肠杆菌BL21作为对照，同样的条件下进行培养和诱导表达。
在上述收集到的菌体中加入适量无菌ddH2O，涡旋混匀，按4：1的比例加入上样缓冲液(制备方法如下：SDS 0.5g，溴酚兰25mg，甘油2.5mL，用pH 6.8的1.0mol/L Tris-HCl定容至5mL，分装成10管，每管500μL，室温保存，使用前每管加25μLβ-巯基乙醇)并混匀，沸水浴10min，在5％SDS-PAGE浓缩胶、12％SDS-PAGE分离胶中进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明，重组菌试验孔在14.4kD附近出现明显的条带，与目的产物的预期大小14.6kD一致，对照孔相应位置未见该大小的条带，表明目的基因在大肠杆菌中成功表达，如图6所示。
按照前述培养和诱导表达的方法，用例如200mL液体LB培养基扩大培养转化有pET-QGBHAV的重组菌，然后收集菌体并用PBS溶液洗涤菌体三次，反复冻融8次之后，加入10mL超声处理缓冲液，涡旋混匀。菌体经超声波破碎后，12000rpm离心10min，取上清，分别加入10U/μL的DNase I 5.0μL和10mg/mL的RNase 10μL在37℃下消化12h。超声处理缓冲液的具体制备方法如下：8.02g NaCl，0.201g KCl，3.87g Na2HPO4·12H2O，0.163g KH2PO4，用ddH2O 950mL溶解，加10mL Triton X-100，调整pH至7.4后用ddH2O定容至1000mL。
接下来，先后用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤上述消化后的液体。然后按1g滤液加0.6g CsCl的比例，将CsCl加入到滤液中，充分涡旋混匀，再用超高速冷冻离心机，4℃、85000rpm离心4h。通过例如注射器从离心后的液体中吸取出含有目的条带的那部分液体。
将含有上述目的条带的液体置于透析袋中，然后将透析袋浸没于PBS溶液中透析12h左右。将透析之后的透析袋内的液体作为假病毒颗粒原液，分装到无RNase和DNase的EP管中，放置于-80℃保存备用。PBS溶液的配制方法为:8.02g NaCl，0.201g KCl，3.87gNa2HPO4·12H2O，0.163gKH2PO4，加ddH2O 950mL，调整pH至7.4后用ddH2O定容至1000mL。
将上述假病毒颗粒原液用2％磷钨酸进行负染，然后在透射电镜下观察假病毒颗粒，可以观察到大量排列紧密、大小形态一致的病毒样颗粒，如图7所示。
由于上述假病毒颗粒内含有的核酸片段是国家标准GB/T22287-2008中实时荧光RT-PCR方法所涉及到的HAV检测靶标序列对应的RNA片段，从而能够作为GB/T 22287-2008中实时荧光RT-PCR方法的标准阳性样品，与之配套使用。改变了“有检测方法没有标准样品”、“研发标准样品未对应标准方法导致适用范围狭窄”、“标准样品与检测方法配套性差”等严重制约HAV检测发展的瓶颈。
实施例3：假病毒颗粒中残留质粒DNA的检测
用PCR扩增法检测实施例2制备的假病毒颗粒是否含有残留的质粒pET-QGBHAV的核酸片段，设计上游引物PpqGHAVF和下游引物PpqGHAVR，序列如表4所示，该对引物可扩增质粒pET-QGBHAV含有的甲型肝炎病毒靶标cDNA片段上下游约134bp的目标区域。以质粒载体pET-QGBHAV为模板设置阳性对照，以ddH2O为模板设置阴性对照。反应体系如表5所示。
表4
引物 序列
PpqGHAVF 5’-CAGCATAAGCTTTTTCCGGAG-3’
PpqGHAVR 5’-GCGGCCGCTCTAGAGCAC-3’
表5
反应体系的组成 用量
模板(假病毒颗粒原液) 1.0μL
引物PpqGHAVF(10μM) 1.0μL
引物PpqGHAVR(10μM) 1.0μL
dNTP mixture(各2.0mM) 2.0μL
PCR buffer(10×) 5.0μL
MgCl2(25mM) 4.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.4μL
ddH2O 36.1μL
扩增条件如下：95℃预变性5min；循环反应35次，条件为95℃1min，50℃40sec，72℃30sec；72℃延伸5min。
通过1.0％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。结果如图5所示，以pET-QGBHAV为模板的阳性对照孔出现大小约134bp的目的条带，以纯化的假病毒颗粒为模板的实验孔的相应位置未见该大小的条带，说明制备的假病毒颗粒原液中无质粒DNA残留，可用于进行实时荧光RT-PCR分析。
实施例4：假病毒颗粒中甲型肝炎病毒核酸片段的鉴定
提取假病毒颗粒中的RNA。可以利用例如Invitrogen公司生产的TRIzol Reagent来进行RNA提取，方法如下：取100μL用实施例2的方法制备的假病毒颗粒原液及其10倍梯度稀释液，分别置于无RNase的EP管中，加1mLTRIzol，剧烈振荡，室温放置5min；然后加入0.2mL氯仿，用力震荡15sec，在室温下放置2min～3min后，12000×g，4℃离心15min；取离心后的上层水相并置于新的无RNaseEP管中，加0.5mL异丙醇，4℃静置10min，12000×g，4℃离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇洗涤，涡旋混合，7500×g，4℃离心5min，弃上清；12000×g，4℃离心1min，用枪头小心吸除EP管中残留液体；让沉淀的RNA在室温下自然干燥，加20μLRNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，立即使用或置于-80℃备用。
参照《GBT 22287-2008贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》中的实时荧光RT-PCR方法及其反应体系与条件并做适当优化，利用其提供的引物与探针(见表6)，来确认实施例2制备的假病毒颗粒中含有甲型肝炎病毒的RNA片段。
表6
引物/探针 序列
HAV1 5’-TTTCCGGAGCCCCTCTTG-3’
HAV2 5’-AAAGGGAAATTTAGCCTATAGCC-3’
HAV-pro FAM-ACTTGATACCTCACCGCCGTTTGCCT-TAMRA
以上述提取的RNA为模板，反转录成cDNA(如利用Takara公司生产的PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒，货号为RR036A)，反应体系见表7。反转录条件为：37℃保温20min，85℃保温20sec后冰浴。
表7
反应体系的组成 用量
5×PrimeScript RT Master Mix 2.0μL
HAV2(10μM) 1.0μL
RNA 2.0μL
RNase Free ddH2O 5.0μL
然后以上述cDNA为模板，利用引物对HAV1/HAV2以及Taqman探针HAV-pro(具体序列见表6)进行实时荧光RT-PCR检测。利用实时荧光试剂盒(如Takara公司Premix Ex TaqTM试剂盒，货号为RR0390A)，在无RNase/DNase PCR管中配制反应体系，见表8。同时以RNaseFree ddH2O为模板设置阴性对照。
表8
反应体系的组成 用量
2×Premix Ex Taq 10.0μL
PHAV1(10μM) 0.40μL
PHAV2(10μM) 0.40μL
HAV-pro(10μM) 0.80μL
cDNA 5.0μL
RNase Free ddH2O 3.40μL
反应条件为：95℃ 5min；95℃ 15sec，60℃ 40sec，循环反应50次；在60℃ 40sec后收集荧光信号，检测结果如图8所示。
图8的结果显示，所制备的假病毒颗粒原液及其梯度稀释液(10-1～10-7)的实时扩增曲线均呈典型的“S”形，具有良好的平台扩增期，以RNase Free ddH2O为模板的阴性对照无平台扩增期，表明本实施例的实时荧光RT-PCR反应是特异性的，假病毒颗粒中包含甲型肝炎病毒的RNA片段。此外，该结果还表明所制备的假病毒颗粒原液稀释106倍后依然可作为阳性样品，这也说明假病毒颗粒原液的浓度非常高。因此，仅需少量制备，通过稀释即可获得大量的标准样品，使得能够满足医院、食品卫生、质检、科研等机构的需要。
以上通过实施例对本发明一个具体实施方式进行了详细的说明，但本发明的保护范围并不受限于此。在实现本发明目的的前提下，本领域技术人员能对本发明的技术方案做出各种改变和变型。例如，除了上述实施例中提到的国家标准GB/T 22287-2008中规定的甲型肝炎病毒检测靶标，本发明的假病毒颗粒中含有的核酸片段还可以是可用作甲型肝炎病毒检测靶标的其他核酸片段。此外，除了上述提到的人工合成方式，QGBHAV片段还可以通过聚合酶链式扩增反应等方式来获得。另外，除了pET-28a(+)，其他的原核表达载体也可以用来进行本发明所涉及DNA片段的转录和/或翻译表达。

Claims (15)

1.一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内含有甲型肝炎病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测所述甲型肝炎病毒的靶标。
2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述核酸片段是与序列表中SEQ IDNo.1的DNA序列相对应的RNA。
3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，
其中，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表SEQ ID No.2所示的序列。
4.根据权利要求3所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。
5.根据权利要求4所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
6.一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbet a噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。
7.根据权利要求6所述的质粒载体，其特征在于，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表SEQ ID No.2所示的序列。
8.根据权利要求7所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。
9.根据权利要求6所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段的表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Ps t I、Spe I、Sph I和No t I。
10.一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：
(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列和甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；
(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；
(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；
(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译；
(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。
11.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表SEQ ID No.2所示的序列。
12.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。
13.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，获得所述质粒载体。
14.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
15.根据权利要求10所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译。
CN201610286386.6A 2016-05-03 2016-05-03 内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 Pending CN105907726A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610286386.6A CN105907726A (zh) 2016-05-03 2016-05-03 内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610286386.6A CN105907726A (zh) 2016-05-03 2016-05-03 内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105907726A true CN105907726A (zh) 2016-08-31
CN105907726A9 CN105907726A9 (zh) 2016-11-16

Family

ID=56752484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610286386.6A Pending CN105907726A (zh) 2016-05-03 2016-05-03 内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105907726A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462655A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所苏州研究院 检测新型冠状病毒的试剂和方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921733A (zh) * 2010-01-05 2010-12-22 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的制备方法及其用途
CN102559731A (zh) * 2011-12-27 2012-07-11 中国检验检疫科学研究院 一种假病毒载体及其制备方法和应用
CN103789277A (zh) * 2014-01-16 2014-05-14 东北制药集团辽宁生物医药有限公司 一种包含hcv和hiv核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法
CN103923887A (zh) * 2014-04-16 2014-07-16 辽宁医学院 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN104560896A (zh) * 2013-11-15 2015-04-29 闽南师范大学 一种在大肠杆菌中表达ms2假病毒颗粒的方法
CN104845993A (zh) * 2015-05-13 2015-08-19 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 一种含丙型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN105200018A (zh) * 2015-10-27 2015-12-30 广东和信健康科技有限公司 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921733A (zh) * 2010-01-05 2010-12-22 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的制备方法及其用途
CN102559731A (zh) * 2011-12-27 2012-07-11 中国检验检疫科学研究院 一种假病毒载体及其制备方法和应用
CN104560896A (zh) * 2013-11-15 2015-04-29 闽南师范大学 一种在大肠杆菌中表达ms2假病毒颗粒的方法
CN103789277A (zh) * 2014-01-16 2014-05-14 东北制药集团辽宁生物医药有限公司 一种包含hcv和hiv核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法
CN103923887A (zh) * 2014-04-16 2014-07-16 辽宁医学院 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN104845993A (zh) * 2015-05-13 2015-08-19 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 一种含丙型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN105200018A (zh) * 2015-10-27 2015-12-30 广东和信健康科技有限公司 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INDULIS CIELENS ET AL.,: "Mutilation of RNA phage Qbeta virus-like particles from icosahedrons to rods", 《FEBS LETTERS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462655A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所苏州研究院 检测新型冠状病毒的试剂和方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105907726A9 (zh) 2016-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108148835A (zh) CRISPR-Cas9靶向敲除SLC30A1基因及其特异性的sgRNA
CN106399377A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法
CN103160619A (zh) 一种腺病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法
Pulkkinen et al. Utilizing in vitro DNA assembly to engineer a synthetic T7 Nanoluc reporter phage for Escherichia coli detection
CN109810976B (zh) 猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用
Huang et al. CRISPR/Cas12a technology combined with RPA for rapid and portable SFTSV detection
CN104745551B (zh) 利用talen敲除人乳头瘤病毒e6e7癌基因的方法
CN104911152B (zh) 一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ‑09株及其构建方法和应用
CN113564133B (zh) 柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用
Fan et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)/Cas12a assay for detection of Ralstonia solanacearum in tomato
CN105907726A (zh) 内含甲型肝炎病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN105754958A (zh) 一种可投送自主发光元件的分枝杆菌噬菌体及其应用
CN105255931A (zh) 一种基于细菌表面展示系统的病毒受体捕获体系
CN105713866A (zh) 人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用
CN101314761B (zh) 高拷贝表达重组乙肝表面抗原的毕赤酵母及其制法和应用
CN105950565B (zh) 高稳定性假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法
CN107201371B (zh) 一种携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒
CN106011078A (zh) 内含轮状病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN107502680A (zh) 检测h7n9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光rt‑pcr试剂盒
CN104531753B (zh) 共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法
CN114214338A (zh) 猪源piv5全长感染性克隆及其制备方法和应用
CN105907727A (zh) 内含三种食源性病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN102776155B (zh) 牛肠道病毒中国分离株及其感染性cDNA克隆的构建和应用
CN102888470B (zh) 一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及检测方法
CN104745635B (zh) 一种沉默df-1细胞系中oasl基因的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CI02 Correction of invention patent application

Correction item: Description

Correct: Ordered list

False: Unordered list

Number: 35

Page: full text

Volume: 32

RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160831

RJ01 Rejection of invention patent application after publication