CN105907727A - 内含三种食源性病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种内含三种食源性病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法。所述假病毒颗粒含有甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺如病毒三种病毒的核酸片段。所述假病毒颗粒的制备方法包括步骤：(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；(3)将质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；(4)诱导DNA片段在大肠杆菌细胞中转录和/或翻译表达；(5)收集步骤(4)的大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到假病毒颗粒。

Description

内含三种食源性病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时含有三种食源性病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法。
背景技术
据世界卫生组织统计，发达国家每年约有30％的人口患食源性疾病，而在发展中国家每年约有2.7亿人口患食源性疾病，导致200余万低龄儿童死亡。食源性病毒是引起食源性疾病的主要原因之一。甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)、轮状病毒(rotavirus，RV)、诺如病毒(norovirus，NV)是三种重要的食源性病毒，主要通过粪-口途径传播，受污染的食品和水是其最主要的传播方式。
以RT-PCR与Real Time RT-PCR为代表的分子检测方法由于具有灵敏度高、重复性好、检测过程快捷等优点，在食源性病毒的检测方面得到广泛应用，并且成为受污染的食品、水等病毒含量较低样本的“金标准”检测方法。
国内外研究学者基于不同的引物和探针，建立了数十种检测方法，国际标准化组织和我国也相继发布了多项国际标准、国家标准及行业标准，为食源性病毒的检测提供了重要的技术支撑与判定依据。由于多数食源性病毒不能进行常规细胞培养，因此这些检测方法多使用临床腹泻样本、灭活疫苗、质粒DNA或体外转录RNA作为阳性对照，以便对检测结果开展质量控制。
但是，上述阳性对照样品均存在一定的缺陷，如临床腹泻样本的病毒粒子含量不均一且存在严重的生物安全隐患，质粒DNA不能用来评价病毒富集、RNA提取及转录效率等关键环节，灭活疫苗存在灭活不彻底的生物安全隐患，体外转录RNA有稳定性差等问题，并且上述阳性对照均只能针对某一种病毒，无法同时作为多种食源性病毒检测 的标准样品。
因此，急需研发一种稳定性好、无生物安全隐患、具有与病毒类似的“内含RNA外有衣壳蛋白保护”结构、能同时适用于多种食源性病毒检测标准的阳性标准样品。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供一种假病毒颗粒，该假病毒颗粒基于Qbeta噬菌体构建，同时包含甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒三种重要食源性病毒的核酸片段，用于作为检测该三种病毒的靶标，使得所述假病毒颗粒能同时作为三种食源性病毒核酸检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。
所述假病毒颗粒内同时含有甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺如病毒三种病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺如病毒三种病毒的靶标。
所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列。所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列。所述诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列。
优选地，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.5所示的序列。
优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。所述大肠杆菌优选是大肠杆菌BL21。
本发明还提供一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，所述核酸片段能用作检测甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的靶标，所述DNA片段优选含有序列表中SEQ ID No.5所示的序列。
优选地，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、SphI和Not I。
本发明还提供一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译表达；(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。所述DNA片段优选含有序列表中SEQID No.5所示的序列。
优选地，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。
优选地，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，来获得所述质粒载体。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。
优选地，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达。
本发明提供的假病毒颗粒，由于其中同时包含了甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的核酸片段，这些核酸片段能作为检测靶标，使得所述假病毒颗粒能同时作为三种食源性病毒核酸检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构，从而大大减少 了购置、运输、储存的成本与空间。其中，甲型肝炎病毒的核酸片段可以是例如国家标准GB/T 22287-2008中规定的甲型肝炎病毒检测靶标，轮状病毒的核酸片段可以是例如出入境检验检疫行业标准SN/T2520-2010规定的轮状病毒检测靶标，诺如病毒的核酸片段可以是例如国际标准ISO/T15216-2 2012中规定的诺如病毒检测靶标序列对应的RNA片段。
本发明所提供的质粒载体包括从5'端到3'端依次为Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点，这些酶切位点均在Qbeta噬菌体的克隆片段中缺失，从而可以依据需要十分方便地在该质粒载体的aMCS中插入其他RNA对应的cDNA，用于制备检测其它RNA病毒核酸时的标准样品。而且，与这些酶切位点对应的限制性内切酶价格十分便宜，可极大地降低生产成本。
利用本发明所提供的制备假病毒颗粒的方法，能够方便可靠地获得拷贝数高、稳定性好的假病毒颗粒，仅需少量制备，通过稀释即可制备大量的标准样品，完全可以满足医院、食品卫生、质检、科研等检测机构的需要。
附图说明
图1是具体实施方式中QGHSRIN片段组成的示意图。
图2是具体实施方式中质粒载体pET-QGHSRIN图谱示意图。
图3是PCR扩增的QGHSRIN片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是质粒载体pET-QGHSRIN的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5是假病毒颗粒中残留质粒DNA检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M是DNA分子量标准，泳道1是以质粒载体pET-QGHSRIN为模板的阳性对照的扩增结果，泳道2是以ddH2O为模板的阴性对照的扩增结果，泳道3和4是以待检测的假病毒颗粒为模板的扩增结果。
图6是质粒载体pET-QGHSRIN在大肠杆菌BL21中表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白质分子量标准，泳道1是大肠杆菌 BL21对照，泳道2是转化有质粒载体pET-QGHSRIN、但未进行诱导表达的重组大肠杆菌BL21对照，泳道3和4是转化有质粒载体pET-QGHSRIN并进行了诱导表达的重组大肠杆菌BL21实验组。
图7是示出在15000倍电镜下观察到的假病毒颗粒的图。
图8是示出对假病毒颗粒中的甲型肝炎病毒RNA片段进行实时荧光RT-PCR检测的扩增曲线图。
图9是示出对假病毒颗粒中的轮状病毒RNA片段进行实时荧光RT-PCR检测的扩增曲线图。
图10是示出对假病毒颗粒中的GI型诺如病毒RNA片段进行实时荧光RT-PCR检测的扩增曲线图。
图11是示出对假病毒颗粒中的GII型诺如病毒RNA片段进行实时荧光RT-PCR检测的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例以及附图对本发明的一个具体实施方式进行详细的说明。
实施例1：构建质粒载体pET-QGHSRIN
首先，参考Genbank数据库中的Qbeta噬菌体基因组序列(登录号为AB971354)，以及《GBT 22287-2008贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》中确定的甲型肝炎病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列、《SNT 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》中确定的轮状病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列、《ISO/T15216-2 2012Microbiology of food and animal feed-Horizentalmethod for determination of hepatitis A virus and norovirus in food usingreal-time RT-PCR》中确定的诺如病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列，通过例如人工合成的方式制备包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列、甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒三种病毒检测靶标的cDNA序列及辅助性多克隆位点在内的DNA片段(下文称为QGHSRIN片段)(见图1)，如序列表中SEQ ID No.5所示。
辅助多克隆位点从5'端到3'端包括例如ApaI、KpnI、PstI、SpeI、SphI和NotI等。将上述核酸片段亚克隆到pUC-18载体中，得到中间质粒载体，命名为pUC-QGHSRIN。
接下来，以中间质粒载体pUC-QGHSRIN为模板通过PCR扩增获取QGHSRIN片段。根据QGHSRIN片段5'端的成熟酶编码基因上游的非编码序列及3'端的多克隆位点序列设计引物对P1与P2(见表1)，为了便于与原核表达载体pET-28a(+)进行同源克隆，在引物P1的5'端添加了pET-28a(+)载体上BamHI上游25bp的同源序列，在引物P2的5'端添加了pET-28a(+)载体上XhoI下游的25bp同源序列。
表1
引物 序列
P1 5’-gactggtggacagcaaatgggtcgcGGATCCGGGGACCCCCTTTAG-3’
P2 5’-gtggtggtggtggtggtgctcgagtGCGGCCGCTCTAGAGCATGC-3’
PCR反应体系如表2所示。扩增条件如下：95℃预变性5min；循环反应30次，循环条件为94℃1min，55℃50sec，72℃3min；72℃延伸5min。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，结果显示扩增产物大小约为2777bp，与目标产物QGHSRIN片段的预期大小一致(见图3)。回收纯化扩增所获取的QGHSRIN片段，用于后续的质粒载体构建。
表2
反应体系的组成 用量
模板 0.2μL
引物P1(10μm/L) 1.0μL
引物P2(10μm/L) 1.0μL
dNTP mixture(各2.0mM) 1.0μL
PCR buffer(10×) 5.0μL
MgCl2(25mM) 4.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.4μL
ddH2O 37.4μL
线性化处理原核表达载体，本实施例以pET-28a(+)载体为例，用限制性内切酶BamH I与Xho I双酶切pET-28a(+)载体，回收并纯化酶切处理后得到的线性化pET-28a(+)载体，然后通过重组酶(例如南京诺唯赞生物科技有限公司生产的IIOne Step Cloning Kit)将上述获得的QGHSRIN片段同源克隆至线性化的pET-28a(+)载体，反应体系如表3所示，在37℃下反应30min后，将产物放置于冰水浴5min，随后用于转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。经过挑菌、质粒提取、酶切与测序鉴定证实重组质粒构建正确，从而获得用于制备假病毒颗粒的质粒载体，命名为pET-QGHSRIN。质粒载体pET-QGHSRIN的图谱示意图如图2所示，酶切鉴定结果如图4所示。
表3
由于pET-28a(+)载体中原有的多克隆位点(MCS)中含有Qbeta噬菌体克隆片段中的固有的多个酶切位点，不利于后期的基因操作。上述构建的质粒载体pET-QGHSRIN，切除了pET-28a(+)载体中原有的MCS，而替换成了从5'端到3'端依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点(aMCS)，从而可以十分方便地在aMCS中插入其他的核酸片段对应的cDNA，用于制备检测其它RNA病毒核酸时的标准样品。而且，该aMCS对应的限制性内切酶市场价格十分便宜，可极大地降低质粒载体的构建成本。
实施例2：假病毒颗粒的制备
将实施例1制备得到的质粒载体pET-QGHSRIN转化入例如大肠杆菌BL21感受态细胞中，然后涂布于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的营养琼脂平板上，37℃培养18h。营养琼脂平板的具体制备方法如下：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，琼脂粉1.5g，溶于90mL ddH2O中，调pH值至7.0～7.2，补加ddH2O定容至100mL，高压灭菌后备用。
然后，从上述培养后的平板上挑取单克隆菌落，接种于3mL含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的液体LB培养基，37℃培养18h。液体LB培养基的具体制备方法为：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，溶于90mL ddH2O中，调节pH值至7.0～7.2，补加ddH2O并定容至100mL，高压灭菌后备用。
按1:100的比例将上述培养的菌液接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)液体LB培养基中，在37℃培养至培养物的OD600达到0.6时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至其终浓度达0.2mmol/L～1.0mmol/L进行诱导表达，37℃振荡培养4h～16h，5000rpm离心10min，收集菌体。设置大肠杆菌BL21以及转化有pET-28a(+)载体的大肠杆菌BL21作为对照，在同样的条件下进行培养和诱导表达。
在上述收集到的菌体中加入适量无菌ddH2O，涡旋混匀，按4：1 比例加入上样缓冲液(配制方法如下：SDS 0.5g，溴酚兰25mg，甘油2.5mL，用pH 6.8的1.0mol/L Tris-HCl定容至5mL，分装成10管，每管500μL，室温放置，使用前每管加25μLβ-巯基乙醇)并混匀，沸水浴10min，然后在5％SDS-PAGE浓缩胶、12％SDS-PAGE分离胶中进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明，重组菌试验孔在14.4kD附近出现明显的条带，与目的产物的预期大小14.6kD一致，对照孔相应位置未见该大小的条带，表明目的基因在大肠杆菌中成功表达，如图6所示。
按照前述培养和诱导表达的方法，用例如200mL液体LB培养基扩大培养转化有pET-QGHSRIN的重组菌，然后收集菌体并用PBS溶液洗涤菌体三次，反复冻融8次之后，加入10mL超声处理缓冲液，涡旋混匀。菌体经超声波破碎后，12000rpm离心10min，取上清，分别加入10U/μL的DNase I 5.0μL和10mg/mL的RNase 10μL，在37℃下消化12h。超声处理缓冲液的制备方法如下：8.02g NaCl，0.201g KCl，3.87g Na2HPO4·12H2O，0.163g KH2PO4，用ddH2O950mL溶解，加10mL Triton-X-100，调整pH至7.4后用ddH2O定容至1000mL。
接下来，先后用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤上述消化后的液体。然后按1g滤液加0.6g CsCl的比例，将CsCl加入到滤液中，充分涡旋混匀；用超高速冷冻离心机，4℃，85000rpm离心4h。通过例如注射器吸取出含有目的条带的那部分液体，可以从中取少量用于进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳分析以快速确定假病毒颗粒核酸的存在。
将含有上述目的条带的液体置于透析袋中，然后将透析袋浸没于PBS溶液中透析12h左右。将透析之后透析袋内的液体作为假病毒颗粒原液，分装到无RNase和DNase的EP管中，放置于-80℃保存备用。PBS溶液的配制方法为:8.02g NaCl，0.201g KCl，3.87gNa2HPO4·12H2O，0.163g KH2PO4，加ddH2O 950mL，调整pH至 7.4后用ddH2O定容至1000mL。
将上述假病毒颗粒原液用2％磷钨酸进行负染，然后在透射电镜下观察假病毒颗粒。可以观察到大量排列紧密、大小形态一致的病毒样颗粒，如图7所示。
由于上述假病毒颗粒内含有的三种重要食源性病毒的RNA片段分别是《GBT22287-2008贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》中确定的甲型肝炎病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列对应的RNA片段，《SNT 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》中确定的轮状病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列对应的RNA片段，《ISO/T15216-2 2012Microbiology of food and animalfeed-Horizental method for determination of hepatitis A virus and norovirusin food using real-time RT-PCR》中确定的诺如病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列对应的RNA片段，从而能够直接作为相应标准检测方法的标准阳性样品，与相应的标准配套使用。改变了“有检测方法没有标准阳性样品”、“研发标准阳性样品未对应标准方法导致适用范围狭窄”、“标准阳性样品与检测方法配套性差”等严重制约食源性病毒检测发展的瓶颈。
实施例3：假病毒颗粒中残留质粒DNA的检测
用PCR扩增法检测实施例2制备的假病毒颗粒是否含有残留的质粒载体pET-QGHSRIN的核酸，设计上游引物PpqHRNF和下游引物PpqinvR，序列如表4所示，该对引物可扩增质粒pET-QGHSRIN含有的甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA片段上下游共410bp的目标区域。以质粒载体pET-QINVGII为模板设置阳性对照，以ddH2O为模板设置阴性对照。反应体系如表5所示。
表4
引物 序列
PpqHRNF 5’-ATGCATGTCTAAGACAGCATAAGC-3’
PpqinvR 5’-GCGGCCGCTCTAGAGCAC-3’
表5
反应体系的组成 用量
模板(假病毒颗粒原液) 4.0μL
引物PpqHRNF(10μm/L) 1.0μL
引物PpqinvR(10μm/L) 1.0μL
dNTP mixture(各2.0mM) 2.0μL
PCR buffer(10×) 5.0μL
MgCl2(25mM) 4.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.4μL
ddH2O 33.1μL
扩增条件如下：95℃预变性5min；循环反应35次，反应条件为95℃1min，52℃45sec，72℃50sec；72℃延伸5min。
通过0.8％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。结果如图5所示，以质粒pET-QGHSRIN为模板的阳性对照孔出现大小为410bp的目的条带，以纯化的假病毒颗粒为模板的实验孔未见目的条带，说明制备的假病毒颗粒原液中无质粒DNA残留，可用于进行实时荧光RT-PCR分析。
实施例4：假病毒颗粒中甲型肝炎病毒核酸片段的鉴定
首先，提取假病毒颗粒中的RNA。可以利用例如Invitrogen公司生产的TRIzolReagent来提取，方法如下：取100μL用实施例2的方法制备的假病毒颗粒原液及其10倍梯度稀释液，分别置于无RNase的EP管中，加1mL TRIzol，剧烈振荡，室温放置5min；然后加入0.2mL氯仿，用力震荡15sec，在室温下放置2min～3min后，12000×g，4℃离心15min；取离心后的上层水相并置于新的无 RNaseEP管中，加0.5mL异丙醇，4℃静置10min，12000×g，4℃离心10min；弃上清，加1mL75％乙醇洗涤，涡旋混合，7500×g，4℃离心5min，弃上清；12000×g，4℃离心1min，吸除EP管中残留的液体；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；加20μLRNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，立即使用或置于-80℃备用。
参照《GBT 22287-2008贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》中的实时荧光RT-PCR方法及其反应体系与条件并做适当优化，利用其提供的引物与探针(见表6)，来确认实施例2制备的假病毒颗粒中含有甲型肝炎病毒的RNA片段。
表6
引物/探针 序列
HAV1 5’-TTTCCGGAGCCCCTCTTG-3’
HAV2 5’-AAAGGGAAATTTAGCCTATAGCC-3’
HAV-pro FAM-ACTTGATACCTCACCGCCGTTTGCCT-TAMRA
以上述提取的RNA为模板，反转录为cDNA(如利用Takara公司生产的PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒，RR036A)，反应体系见表7。
表7
反应体系的组成 用量
5×PrimeScript RTMaster Mix 2.0μL
HAV2(10μm/L) 1.0μL
RNA 2.0μL
RNase Free ddH2O 5.0μL
反转录条件：37℃保温20min，85℃保温20sec后冰浴。
然后以上述cDNA为模板，利用引物对HAV1/HAV2以及Taqman探针HAV-pro(具体序列见表6)进行实时荧光检测。利用实时荧光检测试剂盒(如Takara公司PremixEx TaqTM试剂盒，RR0390A)， 在无RNase/DNase PCR管中配制反应体系，见表8。同时以RNase Free ddH2O为模板设置阴性对照。
表8
反应体系的组成 用量
2×Premix Ex Taq 10.0μL
HAV1(10μm/L) 0.40μL
HAV2(10μm/L) 0.40μL
HAV-pro(10μm/L) 0.80μL
cDNA 5.0μL
RNase Free ddH2O 3.40μL
反应条件：95℃5min；95℃15sec，60℃40sec，循环反应50次；在60℃40sec后收集荧光信号。检测结果如图8所示。
图8的结果显示，所制备的假病毒颗粒原液及其梯度稀释液(10-1～10-7)的实时扩增曲线均呈典型的“S”形，具有良好的平台扩增期，以RNase Free ddH2O为模板的阴性对照无平台扩增期，表明本实施例的实时荧光RT-PCR反应是特异性的，假病毒颗粒中包含有甲型肝炎病毒的RNA片段。所制备的假病毒颗粒原液稀释106倍后依然可作为阳性样品，这也说明假病毒颗粒原液的浓度非常高。因此，仅需少量制备，通过稀释即可获得大量的标准样品，使得能够满足医院、食品卫生、质检、科研等机构的需要。
实施例5：假病毒颗粒中轮状病毒核酸片段的鉴定
首先，提取假病毒颗粒中的RNA。可以利用例如Invitrogen公司生产的TRIzolReagent来提取，方法如下：取100μL用实施例2的方法制备的假病毒颗粒原液及其10倍梯度稀释液，分别置于无RNase的EP管中，加1mL TRIzol，剧烈振荡，室温放置5min；然后加入0.2mL氯仿，用力震荡15sec，在室温下放置2min～3min后，12000×g，4℃离心15min；取离心后的上层水相并置于新的无RNase EP管中，加0.5mL异丙醇，4℃静置10min，12000×g， 4℃离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇洗涤，涡旋混合，7500×g，4℃离心5min，弃上清；12000×g，4℃离心1min，用枪头小心吸除EP管中残留液体；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；加20μL RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，立即使用或置于-80℃备用。
参照《SN/T 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》中的实时荧光RT-PCR方法及其反应体系与条件并做适当优化，利用其提供的引物与探针(见表9)，鉴定假病毒颗粒中的轮状病毒RNA片段。
表9
引物/探针 序列
NVP3-F 5’-ACCATCTACACATGACCCTC-3’
NVP3-R 5’-GGTCACATAACGCCCC-3’
NVP3-P 5’-FAM-ATGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA-TAMRA-3’
以上述提取的RNA为模板，利用引物对NVP3-F/NVP3-R以及Taqman探针NVP3-P(具体序列见表9)进行实时荧光RT-PCR检测。利用实时荧光RT-PCR试剂盒(如Takara公司生产的One step PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒，RR064A)在无RNase/DNase PCR管中配制反应体系，见表10。
表10
反应体系的组成 用量
2×One Step RT-PCR Buffer III 10.0μL
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL) 0.40μL
PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.40μL
NVP3-F(10μm/L) 0.40μL
NVP3-R(10μm/L) 0.40μL
NVP3-P(10μm/L) 0.80μL
RNA 2.0μL
RNase Free ddH2O 5.60μL
反应条件为：反转录反应42℃5min，95℃10sec；PCR反应：95℃5sec，60℃20sec，循环反应40次，在60℃20sec后收集荧光信号，检测结果如图9所示。
图9的结果显示，所制备的假病毒颗粒原液及其梯度稀释液(10-1～10-6)的实时扩增曲线均呈典型的“S”形，具有良好的平台扩增期，以RNase Free ddH2O为模板的阴性对照无平台扩增期，表明本实施例的实时荧光RT-PCR反应是特异性的，假病毒颗粒中包含有A群轮状病毒的RNA片段。此外，该结果还表明所制备的假病毒颗粒原液稀释106倍后依然可作为阳性样品，这也说明假病毒颗粒原液的浓度非常高。因此仅需少量制备，通过稀释即可制备大量的标准样品，使得能够满足医院、食品卫生、质检、科研等机构的需要。
实施例6：假病毒颗粒中GI型诺如病毒核酸片段的鉴定
首先，提取假病毒颗粒中的RNA。可以利用例如Invitrogen公司生产的TRIzolReagent来提取，方法如下：取100μL用实施例2的方法制备的假病毒颗粒原液及其10倍梯度稀释液，分别置于无RNase的EP管中，加1mL TRIzol，剧烈振荡，室温放置5min；然后加入0.2mL氯仿，用力震荡15sec，在室温下放置2min～3min后，12000×g，4℃离心15min；取离心后的上层水相并置于新的无RNaseEP管中，加0.5mL异丙醇，4℃静置10min，12000×g，4℃离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇洗涤，涡旋混合，7500×g，4℃离心5min，弃上清；12000×g，4℃离心1min，用枪头小心吸除EP管中残留液体；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；加20μLRNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，立即使用或置于-80℃备用。
以上述提取的RNA为模板，利用引物对QNIF4/NV1LCR以及Taqman探针NVGG1p(具体序列见表11)进行实时荧光RT-PCR检测。用例如Takara One Step PrimeScript RT-PCRKit(Takara公司，货号为RR064A)配制实时荧光RT-PCR反应体系，如表12所示。
表11
引物/探针 序列
QNIF4 5’-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3’
NV1LCR 5’-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’
NVGG1p 5’-FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA3’
表12
反应体系的组成 用量
RNA 2.0μL
2×one step RT-PCR BufferⅢ 10.0μL
Takara Ex Taq HS(5U/μL) 0.4μL
QNIF4(10μM) 0.3μL
NV1LCR(10μM) 0.3μL
NVGG1p(10μM) 0.4μL
RNase-Free ddH2O 6.6μL
反应条件为：反转录42℃5min；95℃10sec；PCR反应条件为95℃5sec，60℃20sec，循环反应40次；在60℃20sec后收集荧光信号，检测结果如图10所示。
图10的结果显示，所制备的假病毒颗粒原液及其梯度稀释液(10-1～10-6)的实时扩增曲线均呈典型的“S”形，具有良好的平台扩增期，以RNase Free ddH2O为模板的阴性对照无平台扩增期，表明本实施例的实时荧光RT-PCR反应是特异性的，假病毒颗粒中包含GI型诺如病毒的RNA片段。此外，结果也表明所制备的假病毒颗粒原液稀释106倍后依然可作为阳性样品，这也说明假病毒颗粒原液的浓度非常高。因此仅需少量制备，通过稀释即可制备大量标准样品，使得能够满足医院、食品卫生、质检、科研等机构的需要。
实施例7：假病毒颗粒中GII型诺如病毒核酸片段的鉴定
首先，提取假病毒颗粒中的RNA。可以利用例如Invitrogen公司生产的TRIzolReagent来提取，方法如下：取100μL用实施例 2的方法制备的假病毒颗粒原液及其10倍梯度稀释液，分别置于无RNase的EP管中，加1mL TRIzol，剧烈振荡，室温放置5min；然后加入0.2mL氯仿，用力震荡15sec，在室温下放置2min～3min后，12000×g，4℃离心15min；取离心后的上层水相并置于新的无RNaseEP管中，加0.5mL异丙醇，4℃静置10min，12000×g，4℃离心10min；弃上清，加1mL75％乙醇洗涤，涡旋混合，7500×g，4℃离心5min，弃上清；12000×g，4℃离心1min，用枪头小心吸除EP管中残留液体；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；加20μLRNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，立即使用或置于-80℃备用。
以上述提取的RNA为模板，利用引物对QNIF2/COG2R以及Taqman探针QNIF3(具体序列见表13)进行实时荧光RT-PCR检测。用例如Takara One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Takara公司，货号为RR064A)配制实时荧光RT-PCR反应体系，如表10所示。
表13
引物/探针 序列
QNIF2 5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’
COG2R 5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’
QNIF3 5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA3’
表14
反应体系的组成 用量
RNA 2.0μL
2×onestep RT-PCRBufferⅢ 10.0μL
Takara Ex Taq HS(5U/μL) 0.4μL
QNIF2(10μM) 0.3μL
COG2R(10μM) 0.3μL
QNIF3(10μM) 0.4μL
RNase-Free ddH2O 6.6μL
反应条件为：反转录42℃5min；95℃10sec；PCR反应条件为95℃5sec，60℃20sec，循环反应40次；在60℃20sec后收集荧光信号，检测结果如图11所示。
图11的结果显示，所制备的假病毒颗粒原液及其梯度稀释液(10-1～10-6)的实时扩增曲线均呈典型的“S”形，具有良好的平台扩增期，而以RNase Free ddH2O为模板的阴性对照无平台扩增期，表明本实施例的实时荧光RT-PCR反应是特异性的，假病毒颗粒中包含GII型诺如病毒的RNA片段。此外，结果也表明所制备的假病毒颗粒原液稀释106倍后依然可作为阳性样品，这也说明假病毒颗粒原液的浓度非常高。因此仅需少量制备，通过稀释即可获得大量标准样品，使得能够满足医院、食品卫生、质检、科研等机构的需要。
以上通过实施例对本发明一个具体实施方式进行了详细的说明，但本发明的保护范围并不受限于此。在实现本发明目的的前提下，本领域技术人员能对本发明的技术方案做出各种改变和变型。例如，除了上述实施例中提到的国家标准GB/T 22287-2008中规定的甲型肝炎病毒检测靶标、出入境检验检疫行业标准SN/T 2520-2010规定的轮状病毒检测靶标、国际标准ISO/T15216-22012中规定的诺如病毒检测靶标cDNA序列对应的RNA片段，本发明的假病毒颗粒中含有的核酸片段还可以是其他的可用作上述三种病毒检测靶标的核酸片段。此外，除了人工合成方式，QINVGII片段还可以通过聚合酶链式扩增反应等方式来获得。另外，除了pET-28a(+)，其他的原核表达载体也可以用来进行本发明所述QINVGII片段的转录和/或翻译表达。

Claims (23)

1.一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内同时含有甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺如病毒三种病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的靶标。
2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述甲型肝炎病毒的核酸片段是与序列表中SEQ ID No.1的DNA序列相对应的RNA。
3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述轮状病毒的核酸片段是与序列表中SEQ ID No.2的DNA序列相对应的RNA。
4.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述诺如病毒的核酸片段是与序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列相对应的RNA。
5.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，
其中，所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列为序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列，
所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.5所示的序列。
6.根据权利要求5所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。
7.根据权利要求6所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
8.一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。
9.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列。
10.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列为序列表中SEQ ID No.2的DNA序列。
11.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，所述诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列。
12.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列为序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ IDNo.5所示的序列。
13.根据权利要求12所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。
14.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I。
15.一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：
(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；
(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；
(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；
(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译表达；
(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。
16.根据权利要求15所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列。
17.根据权利要求15所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列为序列中SEQ ID No.2的DNA序列。
18.根据权利要求15所述的制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，所述诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列为序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ IDNo.5所示的序列。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，来获得所述质粒载体。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达。
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