CN103789277A

CN103789277A - 一种包含hcv和hiv核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法

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Publication number: CN103789277A
Application number: CN201410019868.6A
Authority: CN
Inventors: 李望丰; 蔡一荣; 关尔鑫; 赵世源; 王丹; 肖樊; 周凯; 任旭
Original assignee: NORTHEAST PHARMACEUTICAL GROUP LIAONING BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: NORTHEAST PHARMACEUTICAL GROUP LIAONING BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2014-05-14

Abstract

一种应用于生物医学临床诊断领域中的包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：设计合成大肠杆菌噬菌体MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的上下游引物，以MS2噬菌体RNA作为模板，用上述引物进行RT-PCR扩增，最后将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，验证克隆的正确性；提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的pMD18-T质粒，使用NcoI和BamHI限制性内切酶将插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac site片段分离下来，与经过NcoI和BamHI双酶切后的pET-28b载体进行连接，得到连接产物。该发明制备的含有HCV和HIV-1RNA片段的假病毒颗粒方法简单、容易操作、获得的假病毒克隆纯度高、是丙型肝炎病毒和艾滋病核酸诊断试剂盒的工作标准品和质控品的理想原料。

Description

一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学临床诊断领域中的一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法。

背景技术

丙型肝炎和艾滋病是我国最为重视的两种重大传染病。其中丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis C，HCV）诱发，艾滋病由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus，HIV）诱发，这两种病毒均为RNA病毒。HCV RNA和HIV RNA载量检测对于病毒感染的早期诊断，以及抗病毒治疗疗效和病人治疗效果评判，是一个非常重要的手段。目前，人们逐渐采用荧光定量RT-PCR法（realtime reaverse transcription PCR，RT-PCR）来检测RNA病毒载量，此类方法灵敏度高，特异性强，动力学线性范围宽，已经成为该类病毒RNA检测的主要方式。由于裸露的RNA分子特别不稳定，因此使用荧光定量RT-PCR法检测RNA病毒载量，必须要有严格的质量控制措施。很关键的一点就是要有高稳定性且无传染性的RNA病毒标准品和质控品。目前，商业化的HCV和HIV荧光定量检测试剂盒的标准品和质控品，主要包括裸露RNA片段，病毒颗粒以及人工假病毒颗粒（armored RNA）。裸露RNA片段容易受到环境中广泛存在的核糖核酸酶（RNase）的降解，而且裸露的RNA标准品和质控品不能参与样本的提取过程，因此导致定量结果偏差过大。用病毒颗粒作为标准品和质控品，其本身也不易降解，可是在试验中应用病毒颗粒无疑增加了生物风险，并且对各种病毒颗粒操作和使用国家有严格的法规要求，这在无形中增加科研和生产的经济成本，提高了分子诊断试剂的准入门槛。因此，研究开发一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法是目前急待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，该发明安全简便，可同时用于实时荧光定量PCR检测，该双元假病毒颗粒具有耐核糖核酸酶、稳定性好，易于保存和运输，对于丙型肝炎病毒和艾滋病核酸诊断试剂盒的开发具有较强的实用价值。

本发明的目的是这样实现的：一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

（一）MS2成熟蛋白基因和包膜蛋白基因的克隆

（1）设计合成大肠杆菌噬菌体MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的上下游引物，上游引物序列为5'-CCATGG TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGC-'3（SEQNo.1）；下游引物序列为5'-GGATCC TGTCTTCGACATGGGTAATCC-'3（SEQ No.2）；

（2）以MS2噬菌体RNA作为模板，用上述引物进行RT-PCR扩增，最后将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，验证克隆的正确性；

（二）假病毒表达载体pET-28b/MS2的构建

（1）提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的pMD18-T质粒，然后使用NcoI和BamHI限制性内切酶将插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac site片段分离下来，将其与经过NcoI和BamHI双酶切后的pET-28b载体进行连接，得到连接产物；

（2）将上述连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用NcoI和BamHI进行双酶切鉴定，酶切结果能够分离出1700bp左右片段的，为正确的阳性克隆；

（三）双元假病毒表达载体pET-28b/MS2/HCV+HIV的构建

（1）以HCV5'UTR和HIV-15'LTR区域序列为制备假病毒的目标序列，其中HCV5'UTR序列长度为230bp，HIV-15'LTR序列长度为250bp；

（2）人工合成含有HCV和HIV-I的基因片段，片段序列为：

5'-ATGGATCCCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCTAGGAAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTTAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGGGATCCAT-'3（SEQ No.3），其中CAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTG为HCV5’UTR序列，其他为HIV-15'LTR序列；

（3）使用BamHI限制性内切酶将上述片段进行酶切，然后将其正向连接进入经过BamHI酶切后的pET-28b/MS2载体中，得到连接产物；

（4）将上述连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用BamHI和SacI进行双酶切鉴定，将正向连接的克隆作为正确的阳性克隆；

（四）诱导表达和纯化

将上述含有pET-28b/MS2/HCV+HIV的阳性克隆接种在含卡那霉素的SOB液体培养基中振荡培养过夜，在培养基中添加IPTG来进行诱导表达；离心收集菌体，再进行超声碎菌处理，将细菌破碎物在进行14000r/min离心20min，取上清转移到另一干净离心管中；在上清中加入100U RNase A和50U DNaseⅠ酶，37℃消化1h，将消化后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检验，核实上清液中的内源性DNA和RNA的是否消化彻底；将消化彻底的上清液贮存于-20℃条件下，这些上清液就是制备的含有HCV和HIV-1RNA的假病毒溶液；所述MS2噬菌体基因包含MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site位点；所述人工合成含有HCV和HIV-I的基因片段，该串联的核苷酸片段被插入到假病毒表达载体Pac site位点下游；所述人工合成HCV的核苷酸序列为SEQ NO.3；所述人工合成的HIV-1的核苷酸序列为SEQ NO.4；所述表达假病毒颗粒的菌种为大肠杆菌BL21（DE3），使用的表达载体为pET-28b；所述假病毒颗粒是由噬菌体外膜蛋白包裹HCV和HIV-1转录的RNA而成的。

本发明的要点在于一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法。其基本原理是：本发明是关于一种含有丙型肝炎和人免疫缺陷病毒I型的双元假病毒颗粒的制备方法，假病毒颗粒由MS2噬菌体外膜蛋白包裹HCV和HIV-1两段RNA片段而成。HCV和HIV-1两段RNA分别来源于HCV基因组5'UTR区域和HIV-1基因组5'LTR区域，片段长度分别为230bp和250bp。这两个区段的RNA序列在HCV和HIV-1基因组中保守性高，特异性强，非常适合作为丙型肝炎病毒和艾滋病核酸诊断试剂盒的扩增靶序列位点。

一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法与现有技术相比，具有制备的含有HCV和HIV-1RNA片段的假病毒颗粒方法简单、容易操作、获得的假病毒克隆纯度高、不含有内源的质粒、基因组DNA和RNA等污染核酸、同时制备的假病毒稳定性好、均一性好、能够很容易被各种基质所稀释、可以作为丙型肝炎病毒和艾滋病核酸诊断试剂盒的工作标准品和质控品的理想原料等优点，将广泛的应用于生物医学临床诊断领域中。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。

图1是本发明假病毒样本HCV的稳定性测试结果图。

图2是本发明假病毒样本HCV的重复性测试结果图。

图3是本发明假病毒样本HIV的稳定性测试结果图。

图4是本发明假病毒样本HIV的重复性测试结果图。

具体实施方式

以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。

实施例一

HCV荧光定量PCR试剂盒标准品的测试

（1）HCV工作标准品的制备

将上述方法制备的假病毒颗粒首先使用购买的商业HCV荧光定量PCR检测试剂盒进行定值，然后根据定值结果使用阴性血清对假病毒进行倍比梯度稀释，制备成为工作标准品1-4，具体浓度为1x10⁷IU/ml，1x10⁶IU/ml，1x10⁵IU/ml和1x10⁴IU/ml。

（2）HCV工作标准品和样本的提取

使用本公司的纳米磁珠法核酸提取试剂对工作标准品进行提取，提取过程如下：

a.取适量1.5ml离心管，分别标记工作标准品1-4及待测样本，每管中加入400μl裂解液，裂解液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5%，Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2mol/L-6.0mol/L，1-10mM EDTA（PH7.5）；

b.每管加入200μl工作标准品1-4；每管加入10μl磁珠悬液（直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10mg/ml），震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟，瞬时离心；

c.将离心管置于磁力架上吸附约2分钟，弃掉上清液，瞬时离心，吸干残液；

d.加入漂洗液A600μl，所述漂洗液A组成为含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化锂0.5-1mol/L，60-80%乙醇。用移液器反复吸打10次后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液，然后瞬时离心，将离心管再置于磁力架上吸附约2分钟，吸干残液；

e.加入漂洗液B600μl，所述漂洗液B组成为含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钾0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇。用移液器反复吸打10次后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液，然后瞬时离心，将离心管再置于磁力架上吸附约2分钟，吸干残液；

f.加入漂洗液C600μl，所述漂洗液C组成为含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇。用移液器反复吸打10次后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液，然后瞬时离心，将离心管再置于磁力架上吸附约2分钟，吸干残液；

g.加入40μl洗脱液，所述洗脱液为含有10mmol/L Tris.HCl（PH8.3），0.01-0.05%Prolin300。震荡混匀10秒钟，然后65℃温浴2分钟；将离心管放置在磁力架上吸附2分钟，吸出上清液。

（3）HCV RT-PCR反应液的配制

HCV RT-PCR缓冲液组成为50mmol/L Tris-HCl（PH8.3），10mmol/L(NH4)₂SO₄，75mmol/LKCl，2.5mmol/L MgSO₄，0.15mmol/L dNTPs。HCV上游引物以及下游引物，使用浓度为20pmol，HCV探针使用浓度为8pmol，逆转录酶（M-MLV酶）120U、热启动Taq酶3U、尿嘧啶糖基化酶（UNG）0.1U、RNase抑制剂5U、T4噬菌体GP32蛋白1μg。HCV RT-PCR反应液扩增使用体积为30μl/反应。

（4）加样和检测

取工作标准品1-4各20μl加入到RT-PCR反应液中，盖紧管盖，置于PCR仪上进行检测。扩增程序如表1：

表1RT-PCR扩增程序

（一）工作标准品稳定性测试

将上述制备的HCV工作标准品进行37℃处理5天，然后将高温处理过的工作标准品与正常温度储存（-20℃）的工作标准品进行平行对比，试验结果如图1。结果表明，上述制备的HCV工作标准品能够耐受37℃处理5天的处理，而没有发生降解现象。

（二）样本的重复性测试

将上述制备的HCV工作标准品作为待测样本。每个样本重复测试四次，结果如图2所示。CT值的变异系数分别为0.17%，0.23%，0.20%，0.33%，变异系数均控制在1%以内，表明运用本发明方法制备的HCV工作标准品的重复性很好。

实施例二

HIV荧光定量PCR试剂盒标准品的测试

（1）HIV工作标准品的制备

将上述方法制备的假病毒颗粒首先使用购买的商业HIV荧光定量PCR检测试剂盒进行定值，然后根据定值结果使用阴性血清对假病毒进行倍比梯度稀释，制备成为工作标准品1-4，具体浓度为1x10⁷IU/ml，1x10⁶IU/ml，1x10⁵IU/ml和1x10⁴IU/ml。

（2）HIV工作标准品和样本的提取

（3）HIV RT-PCR反应液的配制

HIV RT-PCR缓冲液组成为50mmol/L Tris-HCl（PH8.3），10mmol/L(NH4)₂SO₄，75mmol/LKCl，2.5mmol/L MgSO₄，0.15mmol/L dNTPs。HIV上游引物以及下游引物，使用浓度为20pmol，HIV探针使用浓度为8pmol，逆转录酶（M-MLV酶）120U、热启动Taq酶3U、尿嘧啶糖基化酶（UNG）0.1U、RNase抑制剂5U、T4噬菌体GP32蛋白1μg。HIV RT-PCR反应液扩增使用体积为30μl/反应。

（4）加样和检测

取工作标准品1-4各20μl加入到RT-PCR反应液中，盖紧管盖，置于PCR仪上进行检测。扩增程序如表2：

表2RT-PCR扩增程序

（一）工作标准品稳定性测试

将上述制备的HIV工作标准品进行37℃处理5天，然后将高温处理过的工作标准品与正常温度储存（-20℃）的工作标准品进行平行对比，试验结果如图3。结果表明，上述制备的HIV工作标准品能够耐受37℃处理5天的处理，而没有发生降解现象。

（二）样本的重复性测试

将上述制备的HIV工作标准品作为待测样本。每个样本重复测试四次，结果如图4所示。CT值的变异系数分别为0.25%，0.18%，0.27%，0.21%，变异系数均控制在1%以内，表明运用本发明方法制备的HIV工作标准品的重复性很好。

Claims

1.一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：该制备方法包括如下步骤：

（一）MS2成熟蛋白基因和包膜蛋白基因的克隆

（二）假病毒表达载体pET-28b/MS2的构建

（三）双元假病毒表达载体pET-28b/MS2/HCV+HIV的构建

（2）人工合成含有HCV和HIV-I的基因片段，片段序列为：

（四）诱导表达和纯化

将上述含有pET-28b/MS2/HCV+HIV的阳性克隆接种在含卡那霉素的SOB液体培养基中振荡培养过夜，在培养基中添加IPTG来进行诱导表达；离心收集菌体，再进行超声碎菌处理，将细菌破碎物在进行14000r/min离心20min，取上清转移到另一干净离心管中；在上清中加入100U RNase A和50U DNaseⅠ酶，37℃消化1h，将消化后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检验，核实上清液中的内源性DNA和RNA的是否消化彻底；将消化彻底的上清液贮存于-20℃条件下，这些上清液就是制备的含有HCV和HIV-1RNA的假病毒溶液。

2.如权利要求1所述的一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：所述MS2噬菌体基因包含MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site位点。

3.如权利要求1所述的一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：所述人工合成含有HCV和HIV-I的基因片段，该串联的核苷酸片段被插入到假病毒表达载体Pac site位点下游。

4.如权利要求1或3所述的一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：所述人工合成HCV的核苷酸序列为SEQ NO.3；所述人工合成的HIV-1的核苷酸序列为SEQ NO.4。

5.如权利要求1所述的一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：所述表达假病毒颗粒的菌种为大肠杆菌BL21（DE3），使用的表达载体为pET-28b。

6.如权利要求1所述的一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：所述假病毒颗粒是由噬菌体外膜蛋白包裹HCV和HIV-1转录的RNA而成的。