CN106755043B - 含人类免疫缺陷病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含人类免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其制备步骤是：1）制备含MS2基因序列的克隆质粒；2）筛选HIV基因保守序列，制备HIV克隆质粒；3）双质粒共转染，诱导表达假病毒颗粒。该制备方法制备的假病毒包装效率得到显著提高，稳定性好，可以长时间保存，纯度高，含有高纯度的RNA而不含有DNA，适合大规模的生产和应用。

Description

含人类免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及人类免疫缺陷病毒，具体说是一种含人类免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。
背景技术
艾滋病(AIDS)是全球面临的重大公共卫生问题，由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起。2015年底，全世界估计有3700万艾滋病患者，超过1800万(约1820万)艾滋病毒感染者目前在接受抗逆转录病毒药物治疗，较2000年翻一番。另有类似数量的人仍然无法获得治疗，其中大多数人并不知晓自己的艾滋病毒阳性状况。有40％的艾滋病毒感染者(超过1400万)仍然对其状况一无所知。
目前HIV病毒载量的定量较多采用荧光定量RT-PCR法来检测，此方法灵敏度高，特异性强，线性范围广，但此方法需要一套稳定的，具有代表性的定量标准品。采用MS2原核系统构建假病毒是目前主流方法，不同企业或研究机构已通过MS2噬菌体构建了各类假病毒颗粒，用于商业试剂盒的定量标准品及质控品。已报道的HIV商品化产品有用pol、gap、env等不同基因片段构建假病毒，所选择的长度普遍在300bp-500bp，因此构建的假病毒颗粒其应用范围严重受到限制，只与相对应的试剂盒相匹配，这也是目前各类定量试剂盒不能共用质控品和定量存在差异性的主要原因。采用常规的假病毒构建手段，限制了插入的外源片段的大小。有研究证实，超过500bp其包装效率快速降低，使得假病毒产率大大的下降，将HIV各基因片段序列串联连接到质粒上，其包装片段的大小超过500bp，影响包装效率，即假病毒颗粒的得率下降。
发明内容
本发明的目的在于公开一种含人类免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种含人类免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其制备步骤是：
1)制备含MS2基因序列的克隆质粒；
2)筛选HIV基因保守序列，制备HIV克隆质粒；
3)双质粒共转染，诱导表达假病毒颗粒。
优选的，MS2基因序列为MS2基因22-1786bp之间序列。
优选的，HIV基因保守序列为env、gap、pol基因中保守序列。
优选的，HIV克隆质粒中，HIV基因保守序列与MS2基因的识别位点链接在一起。
优选的，MS2基因的识别位点由MS2噬菌体RNA茎环结构组成。
进一步优选的，MS2噬菌体RNA茎环结构的序列是：5’-ACAUGAGGAUCACCCAUGU-3’(SEQ ID NO:1)。
优选的，HIV克隆质粒中含有6个以下的MS2噬菌体RNA茎环结构。
优选的，HIV克隆质粒中每个识别位点处含有4个以下的MS2噬菌体RNA茎环结构。
本发明的有益效果是：该制备方法制备的假病毒包装效率得到显著提高，生产量显著上升，稳定性好，可以长时间保存，纯度高，因而适合大规模的生产和应用。
附图说明
图1野生型MS2噬菌体RNA茎环结构。
图2改造后MS2噬菌体RNA茎环结构。
图3识别位点与HIV不同基因片段插入模式图。
图4假病毒及纯度鉴定扩增曲线图。
具体实施方式
实验方法
一、MS2克隆质粒获得
参考Genbank数据库中MS2噬菌体基因组序列(登录号为：NC_001417)，设计引物扩增MS2基因22-1786bp之间序列，引物两端分别携带NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点。采用NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶分别酶切MS2PCR产物与pET28(a)，酶切体系。
将酶切产物通过琼脂糖凝胶进行分离，然后将纯化的酶切产物用T4连接酶连接。将连接产物转化进DH5α感受态细胞中，筛选鉴定阳性克隆子，命名为pET-MS2。
二、HIV片段克隆质粒构建。
1)参考Genbank数据库中HIV基因序列，筛选出env、gag、pol基因中保守序列。
2)野生型MS2识别位点序列为：5’-ACAUGAGGAUUACCCAUGU-3’(SEQ ID NO:2)，结构如图1。改造后茎环结构如图2，修改后的识别位点序列为：
5’-ACAUGAGGAUCACCCAUGU-3’(SEQ ID NO:1)。
3)识别位点与插入HIV保守基因的位置及关系如图3，其中：
①识别位点由改造后MS2噬菌体RNA茎环结构组成；
②改造后的MS2噬菌体RNA茎环结构总数量不超过6个在各识别位点存在的改造后MS2噬菌体RNA茎环结构数量不超过3个。
③识别位点数量4个以下。
4)在上述串联片段两端分别添加NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点，采用常规酶切，连接转化，筛选鉴定手段制备成含HIV片段克隆质粒，采用的质粒是pET11(a)，制备的HIV克隆质粒命名为p-ET-HIV。
双质粒共转染DE3感受态细胞；并诱导假病毒的表达。
实验例
1)表达效率比较
将本发明的技术方案制备的假病毒的表达效率与常规方案进行对比：设置对照组，对照组采用普通假病毒构建方法构建假病毒，具体实施如下：
将MS2噬菌体成熟酶蛋白，外壳蛋白序列连接至pET28多克隆位点上，然后再将HIV串联片段(env-gag-pol)连接至外壳蛋白下游，经转化诱导纯化假病毒颗粒；
实验组为本发明方案构建方法构建的双质粒表达系统表达的假病毒。其中，HIV片段克隆质粒构建分五个实验组进行实验：
实验组1，总共6个经改造后的RNA茎环结构，4个识别位点，排列顺序是识别位点a-env-识别位点b-gag-识别位点c-pol-识别位点d，其中识别位点a含有2个RNA茎环结构；识别位点b含有1个RNA茎环结构：识别位点c含有1个RNA茎环结构；识别位点d含有2个RNA茎环结构；
实验组2为总共经改造后的6个RNA茎环结构，3个识别位点，排列顺序是位点a-env-识别位点b-gag-pol-识别位点c，其中识别位点a含有2个RNA茎环结构；识别位点b含有2个RNA茎环结构：识别位点c含有2个RNA茎环结构；；
实验组3，总共5个经改造后的RNA茎环结构，4个识别位点排列顺序是识别位点a-env-识别位点b-gag-识别位点c-pol-识别位点d，其中识别位点a含有2个RNA茎环结构；识别位点b含有1个RNA茎环结构：识别位点c含有1个RNA茎环结构；识别位点d含有1个RNA茎环结构；；
实验组4，总共5个经改造后的RNA茎环结构，3个识别位点，排列顺序是识别位点a-env-识别位点b-gag-pol-识别位点c，其中识别位点a含有2个RNA茎环结构；识别位点b含有1个RNA茎环结构：识别位点c含有2个RNA茎环结构；；
实验组5，总共4个经改造后的RNA茎环结构，3个识别位点，排列顺序是识别位点a-env-识别位点b-gag-pol-识别位点c，其中识别位点a含有2个RNA茎环结构；识别位点b含有1个RNA茎环结构：识别位点c含有1个RNA茎环结构；。
假病毒含量计算方法如下：将制备的假病毒稀释10倍后，采用分光光度计测定表达产物含量，换算方法A260＝0.125mg/mL。
分组 吸光度 表达效率
对照组 0.26 0.32mg/mL
实验组1 0.76 0.95mg/mL
实验组2 0.696 0.87mg/mL
实验组3 0.592 0.74mg/mL
实验组4 0.656 0.82mg/mL
实验组5 0.72 0.90mg/mL
表数据显示，本发明的方法相比普通对照方法，假病毒表达效率更高，实验组普遍比对照组表达效率高，期实验组1表达效率最高，高出对照组2.96倍。说明此方法更有利于外源长片段RNA的构建。
2)假病毒及纯度鉴定
取上述实验组1制备及纯化的假病毒，梯度稀释1000X和10000X进行核酸提取(采qiaamp viral RNA kit)，得到RNA；以RNA为模板，进行RT-PCR和PCR验证(伯乐FPX-96荧光定量PCR仪)。
荧光定量扩增曲线如图4。假病毒及纯度鉴定扩增曲线图数据显示，RT-PCR体系样本有明显的扩增的曲线，且稀释1000X和稀释10000X呈典型的梯度稀释扩增曲线，PCR体系稀释1000X和10000X都无扩增曲线，说明样本中不含DNA存在。说明提取的假病毒含有高纯度的RNA。
3)假病毒酶攻击实验
取上述实验组1制备及纯化的假病毒，稀释至1000X，按如下酶消化程序进行酶攻击处理实验；
组分 Dnase处理(μL) Rnase处理(μL) Dnase和Rnase处理(μL) 对照
假病毒颗粒(1000X) 10 10 10 10
DNase(5U/ul) 2 － 2 －
Rnase － 2 2 －
10X Buffer 5 5 5 5
无酶水 33 33 31 35
总体积 50 50 50 50
各处理组分别取20ul酶切产物，用生理盐水补充至140ul,采用Qiaamp viral RNAkit提取假病毒中RNA；采用RT-PCR体系进行检测，参考假病毒及纯度鉴定的RT-PCR方法，鉴定结果如下：
Dnase及Rnase攻击处理荧光定量PCR检测对应Ct值
Dnase处理(μL) Rnase处理(μL) Dnase和Rnase处理(μL) 对照
重复1 13.24 13.4 13.33 13.21
重复2 13.53 13.26 13.42 13.25
重复3 13.33 13.5 13.37 13.42
从各处理组Ct值判断，无明显的差异。根据荧光定量PCR检测原理说明Dnase及Rnase攻击假病毒无效果，即说明假病毒具有耐核酸酶攻击。
4)假病毒存储稳定性研究
取上述实验组1制备及纯化的假病毒稀释至1000X，按1mL/管分别保存在37℃1d；常温30d；4℃90d；-20℃180d；将处理后的样本，采用Qiaamp viral RNA kit提取假病毒中RNA；采用RT-PCR体系进行检测，参考假病毒及纯度鉴定的RT-PCR方法，鉴定结果如下
37℃1d 常温30d 4℃90d -20℃180d
重复1 9.42 9.23 9.09 9.22
重复2 9.12 9.31 9.25 9.16
重复3 9.1 9.12 9.21 9.23
根据不同温度，保存时间处理后，各处理组之间的Ct值没有明显的差异，且低温条件下，保存时间更长，与其他研究者结果相吻合，说明MS2系统制备的假病毒稳定性强，易于保存。
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<110> 广州海力特生物科技有限公司
<120> 含人类免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaugaggau cacccaugu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
acaugaggau uacccaugu 19

Claims (1)

1.一种含人类免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其制备步骤是：
1)制备含MS2基因序列的克隆质粒；
2)筛选HIV基因保守序列，制备HIV克隆质粒；
3)双质粒共转染，诱导表达假病毒颗粒；
MS2基因序列为MS2基因22-1786bp之间序列；
HIV基因保守序列为env、gap、pol基因中保守序列；
HIV克隆质粒中，HIV基因保守序列与MS2基因的识别位点链接在一起，env、gap、pol基因中保守序列中任一个序列与1个或2个MS2基因的识别位点链接；
MS2基因的识别位点由MS2噬菌体RNA茎环结构组成；
MS2噬菌体RNA茎环结构的序列是：5’-ACAUGAGGAUCACCCAUGU-3’(SEQ ID NO:1)；
HIV克隆质粒中含有3或4个识别位点；
HIV克隆质粒中含有4、5或6个MS2噬菌体RNA茎环结构；
HIV克隆质粒中，HIV基因保守序列与MS2基因的识别位点链接顺序如下列任意一种所示：
1)HIV克隆质粒中含有4个识别位点，6个MS2噬菌体RNA茎环结构，排列顺序是识别位点a-env-识别位点b-gag-识别位点c-pol-识别位点d；其中识别位点a含有2个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点b含有1个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点c含有1个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点d含有2个MS2噬菌体RNA茎环结构；
2)HIV克隆质粒中含有3个识别位点，4个MS2噬菌体RNA茎环结构，排列顺序是识别位点a-env-识别位点b-gag-pol-识别位点c；其中识别位点a含有2个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点b含有1个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点c含有1个MS2噬菌体RNA茎环结构；
3)HIV克隆质粒中含有3个识别位点，6个MS2噬菌体RNA茎环结构，排列顺序是识别位点a-env-识别位点b-gag-pol-识别位点c；其中识别位点a含有2个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点b含有2个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点c含有2个MS2噬菌体RNA茎环结构；
4)HIV克隆质粒中含有3个识别位点，5个MS2噬菌体RNA茎环结构，排列顺序是识别位点a-env-识别位点b-gag-pol-识别位点c；其中识别位点a含有2个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点b含有1个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点c含有2个MS2噬菌体RNA茎环结构；
5)HIV克隆质粒中含有4个识别位点，5个MS2噬菌体RNA茎环结构，排列顺序是识别位点a-env-识别位点b-gag-识别位点c-pol-识别位点d；其中识别位点a含有2个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点b含有1个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点c含有1个MS2噬菌体RNA茎环结构，识别位点d含有1个MS2噬菌体RNA茎环结构。
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