CN112553220A - 一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法。本发明所涉及的病毒核酸标准物质由如下步骤制得：选择基因保守区为扩增靶标区；设计引物并合成；序列扩增；构建表达载体；体外转录；浓度测定并稀释；分装；检测定量。利用本发明制备的标准物质具有稳定性，无生物传染性，适应范围广等特性，可利用反转录PCR以及荧光定量PCR在番茄斑萎属病毒的检测标准物质。
Description
技术领域
本申请涉及核酸标准物质领域，具体而言，涉及本发明涉及一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法。
背景技术
分子生物学检测是病毒检测中必不可少的组成部分，然而检测的阳性质控却是难以获得，对方法的验证和检测的开展都极为不利。目前植物病毒的标准样品主要通过从国际权威或著名生物标准品中心进行购买；与在研究刊物上发表研究文献的实验室联系索取而获得；购买商业试剂盒所配备的阳性对照。这些标准品都是血清学方法的对照，本地扩繁和保存难度大，存在运输周期长，费用高、保存难等问题，加上检疫性植物病毒进口手续繁琐，因此获得和收集病毒的阳性质控极为困难。
番茄斑萎病毒属是一类值得关注的植物病毒。病毒种类或分离物不断增加，寄主范围也在不断扩大，仅TSWV就能侵染1090种植物，涉及到番茄、辣椒、莴苣等蔬菜作物，花生、豌豆、烟草等重要经济作物及菊花、马蹄莲等许多花卉作物。该属病毒分布于亚洲和美洲大部分地区。造成的危害轻者减产，重者绝收，引起的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。番茄斑萎病毒属是近年来对我国蔬菜水果等生产危害上升的一类病毒，这类病毒也是国际上植物检疫比较重视的病毒。这类病毒种类繁多，基因组数据缺乏，亲缘关系复杂，对检测方法的准确性提出了极高的要求，这就需要检测实验室储备有检测用的阳性质控。
本项目将通过体外转录的方式获得可用作分子生物学检测阳性质控RNA，旨在研究确定这类阳性质控的保存方式、保存条件和运输要求等，为今后病毒分子检测阳性质控的制备进行基础数据的储备，也为促进这一类病毒的检测提供有效准确的阳性质控。同时由于这类阳性质控丧失侵染活性，也降低了有害生物引进带来的风险。
发明内容
为了填补目前产品的空白和满足植物检验检疫的需要，本发明旨在开发能够适用于番茄斑萎属病毒主要病毒分子生物学检测的阳性质控。该物质具有稳定性，无生物传染性。
一种番茄斑萎属病毒的核酸标准物质的制备方法，其特征在于包括以下技术步骤:
步骤1.选择番茄斑萎属病毒的基因保守区域序列为扩增靶区。如序列表中SEQ IDN0.1所示，所述基因为TSWV复制酶基因中的一段序列；
步骤2.设计合成对该基因选定区域的上下游引物；
步骤3.获取复制酶基因DNA片段，具体过程如下:
提取病毒粒子的RNA序列或者病毒侵染的植物样本组织，用随机引物做反转录，获得cDNA序列，再用设计的复制酶基因特异性引物扩增目标片段，所述一对特异性引物RdRp-F:5’-GCAACTAACGCCACACCTGAC-3’和RdRp-R:5’-GGTCTCGTAACAAGTGAATCAATTATTCTTTC-3’；预期扩增产物为TSWV的复制酶基因的566bp，并用SacII/SpeI双酶切后回收纯化。
SacII/SpeI双酶切pGEM-T载体，并将复制酶基因融合后连接到载体上，经转化大肠杆菌，最终得到pGEM-R载体；所述基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。
步骤4.经鉴定后获得的重组菌株进行大量培养，提取pGEM-R质粒DNA。
步骤5.将获得的质粒DNA进行BsaI酶切线性化，用Promega反转录试剂盒进行反转录获得RNA序列。序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。
步骤6.纯化获得的RNA分子，并加入DNase消化模板DNA，最后用无RNA酶的灭菌水稀释定量RNA。
步骤7.定量RNA浓度及拷贝数，取纯化后的体外转录物RNA分子，用不含RNase的灭菌水进行梯度稀释，10、20、30、40、50和100倍，测定不同浓度样品的OD260和OD280，根据目标序列的核苷酸长度，经过计算，最终获得RNA分子在单位体积内的数量，用pmol表示。
步骤8.将最终纯化产物进行稀释定量后，分装于EP管中，-80度保存。
本发明具有如下优点:
(1)目前，实验室和研究机构想要获得斑萎病毒属病毒的标准样品主要有三个途径：通过从国际权威或著名生物标准品中心进行购买，与在研究刊物上发表研究文献的实验室联系索取而获得；购买商业试剂盒所配备的阳性对照。由于获得植物病毒分离物的来源信息少，本地扩繁和保存难度大，且毒株多为活体或是冷冻保存，都存在运输周期长，费用高、保存难等问题，加上检疫性植物病毒进口手续繁琐，因此想要收集病毒的阳性质控极为困难。本发明提供一种番茄斑萎属病毒的核酸标准物质及其应用，可以解决上述难题。
(2)采用复制酶基因区域作为检测阳性核酸分子标准的策略，可以最大程度检测到病毒复制酶基因，具有精确性和广谱性。
(3)采用大肠杆菌表达体外转录的载体DNA，扩繁以及纯化过程无病毒泄露危害。
(4)本发明利用RNA体外转录以及纯化的方法，首先用限制性内切酶线性化质粒DNA，可以使转录出的病毒复制酶靶序列不含载体碱基，并用DNase消化载体DNA模板，这些步骤最终使获的RNA分子具有特异性，降低假阳性率，进一步去除制备过程中的DNA核酸干扰。
(5)本发明的标准物质只含有病毒复制酶基因的部分序列，不含有完整的病毒核酸和其他组分，因此该标准物质无传染性，无病毒特性，易于存储与运输。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1.用于体外转录的载体图。
图2.选定靶区域的PCR电泳图。
图3.体外转录电泳图。
图4.荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一、TSWV病毒外壳蛋白与复制酶基因的融合
选取的复制酶基因特定区域，用特异引物扩增，
RdRp-F:5’-GCAACTAACGCCACACCTGAC-3’和
RdRp-R:5’-GGTCTCGTAACAAGTGAATCAATTATTCTTTC-3’；获得复制酶基因片段，按图1所示载体结构,通过SacII和SpeI，将PCR产物克隆至载体，通过转入大肠杆菌，获得用于体外转录的表达载体。
实施例二、融合蛋白的制备
将获得的质粒DNA进行BsaI酶切线性化，用Promega反转录试剂盒进行反转录获得RNA序列。序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。
实施例三、标准物质的检测
将实施例2获取的标准物质经紫外分光光度计测定，依据OD值换算出标准物质病毒数值，测定出初始浓度病毒80次方，
证明利用该标准物质可用于TSWV的定量分析。
pmol＝(ng/1000)/330*106/560以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 昆明海关技术中心
<120> 一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法
<141> 2020-12-23
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 566
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcaactaacg ccacacctga caactatgtg atatataaag aatcaaaaaa cagtgagctt 60
tgtttaatca tttatgattg gaaaatatct gtcgatgcca ggacagaaac taaacaatgg 120
agaaatacct acaaaaatat ctggaaatct ttcaaagata taaaagtgaa tggaaagcca 180
ttcctggaag atcaccctgt tttcgtttct atagttatat tgaaacctat tgctgggatg 240
ccaatcactg ttactagcag cagggttttg gagaaatttg aagattctcc atcagcattg 300
catggagaaa gaataaagca tgctagaaat gccaaattgc taaatatttc tcatgttggg 360
caaatagttg gaaccacacc cacagtggtg agaaactatt atgcaaacac tcaaaagatc 420
aaatctgaag tcagaggaat actaggtgat gattttggat ctaaagatgt gttttttagt 480
cactggacca gcaaatacaa agaaagaaat cctactgaaa tagcctattc tgaagatatt 540
gaaagaataa ttgattcact tgttac 566
<210> 2
<211> 566
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcaacuaacg ccacaccuga caacuaugug auauauaaag aaucaaaaaa cagugagcuu 60
uguuuaauca uuuaugauug gaaaauaucu gucgaugcca ggacagaaac uaaacaaugg 120
agaaauaccu acaaaaauau cuggaaaucu uucaaagaua uaaaagugaa uggaaagcca 180
uuccuggaag aucacccugu uuucguuucu auaguuauau ugaaaccuau ugcugggaug 240
ccaaucacug uuacuagcag caggguuuug gagaaauuug aagauucucc aucagcauug 300
cauggagaaa gaauaaagca ugcuagaaau gccaaauugc uaaauauuuc ucauguuggg 360
caaauaguug gaaccacacc cacaguggug agaaacuauu augcaaacac ucaaaagauc 420
aaaucugaag ucagaggaau acuaggugau gauuuuggau cuaaagaugu guuuuuuagu 480
cacuggacca gcaaauacaa agaaagaaau ccuacugaaa uagccuauuc ugaagauauu 540
gaaagaauaa uugauucacu uguuac 566
Claims (3)
1.一种番茄斑萎属病毒的核酸标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选择番茄斑萎属病毒的基因保守区域序列为扩增靶区，如序列表中SEQ ID N0.1所示，所述基因为TSWV复制酶基因中的一段序列；
2)设计合成对该基因选定区域的上下游引物；
3)获取复制酶基因DNA片段，所述基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所示；
4)经鉴定后获得的重组菌株进行大量培养，提取pGEM-R质粒DNA；
5)将获得的质粒DNA进行BsaI酶切线性化，用Promega反转录试剂盒进行反转录获得RNA序列，序列如序列表中SEQ ID N0.2所示；
6)纯化获得的RNA分子，并加入DNase消化模板DNA，最后用无RNA酶的灭菌水稀释定量RNA；
7)定量RNA浓度及拷贝数，将最终纯化产物进行稀释定量后，分装于EP管中，-80℃保存。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，复制酶基因DNA片段，具体过程如下：
提取病毒粒子的RNA序列或者病毒侵染的植物样本组织，用随机引物做反转录，获得cDNA序列，再用设计的复制酶基因特异性引物扩增目标片段，所述一对特异性引物为：
RdRp-F:5’-GCAACTAACGCCACACCTGAC-3’
RdRp-R:5’-GGTCTCGTAACAAGTGAATCAATTATTCTTTC-3’；
预期扩增产物为TSWV的复制酶基因的566bp，并用SacII/SpeI双酶切后回收纯化。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，定量RNA浓度及拷贝数具体步骤为，取纯化后的体外转录物RNA分子，用不含RNase的灭菌水进行梯度稀释，10、20、30、40、50和100倍，测定不同浓度样品的OD260和OD280，根据目标序列的核苷酸长度，经过计算，最终获得RNA分子在单位体积内的数量，用pmol表示。
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Cited By (2)
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| CN104120193A (zh) * | 2014-07-01 | 2014-10-29 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 用于对番茄斑萎病毒进行特异性检测及绝对定量的引物和方法 |
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-
2020
- 2020-12-28 CN CN202011579953.XA patent/CN112553220A/zh active Pending
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