CN104711372A - 一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法及其引物 - Google Patents

一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法及其引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法及其引物，属植物病毒分子生物学检测和鉴定技术领域。该方法提供3对引物及其碱基序列。用其中任一对引物进行RT-PCR扩增，将获得的目标产物的序列通过NCBI BLAST比对分析，与Genbank报道的番茄斑萎病毒一致性超过90％时，该样品为番茄斑萎病毒所感染。如果用上述3对引物进行RT-PCR扩增，当分别扩增出605bp、794bp和1277bp左右的片段时，即可确认样品为TSWV，不需再进行克隆、测序和序列比对，简化了检测过程，可以避免该检测中假阳性结果。

Description

一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法及其引物
技术领域
本发明涉及到植物病毒的分子生物学检测和鉴定技术领域，具体涉及番茄斑萎病毒的分子生物学检测和鉴定的方法及其专用引物。
背景技术
番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是一种危害农业生产的重要病毒，属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。该病毒粒子为球形病毒，直径为80-120nm。其基因组有3个单链RNA分子构成：S RNA编码核壳体蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)；M RNA编码了糖蛋白前体(G1G2)和非结构蛋白(NSm)；L RNA编码了依赖RNA的RNA多聚酶(RdRp)。
TSWV最早发现于澳大利亚，目前在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋洲等多个国家和地区广泛分布，热带、亚热带、温带地区均有发生。TSWV寄主范围十分广泛，可侵染100科1090种植物，重要的寄主植物有花生、辣椒、烟草等，能引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害，甚至绝产，造成严重的经济损失，是世界十大农业病害之一。1989年TSWV病毒被欧洲及地中海植物保护组织(European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO)列入A2类检疫性有害生物。2006年中国将TSWV列入新公布的全国农业植物检疫性有害生物名单中。
目前，血清学技术、电镜技术、生物学测定和分子生物学技术被广泛应用于番茄斑萎病毒属病毒检测和鉴定中。
血清学检测技术是一种快速、灵敏度高，广泛应用于病毒检测和病害诊断的现代技术。也是目前用于检测Tospovirus属病毒常用的方法。1986年，Gonsalves和Trujillo开发的酶联免疫反应(ELISA)是Tospovirus属病毒检测和诊断的重要转折点。随着酶联免疫反应技术的发展高质量的多抗血清----双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)和三抗夹心ELISA陆续用来对Tospovirus属病毒检测。1990年Wang等利用DAS-ELISA成功检测到了TSWV病毒；1996年Roggero等应用TAS-ELISA在媒介昆虫西花蓟马上，检测到Tospovirus属病毒。酶联免疫反应检测快速、灵敏度高，但是受到了病毒种类、检测病毒是否单一、抗病毒血清、酶标血清和酶底物等的种类、来源、和组合等因素的影响。而且，同属病毒出现交叉反应，限制了该技术对确定种鉴定的应用。
电镜技术的优点是快速、简单和直接。通过电镜观察可以确定病毒形态、大小、结构、内含体组成和亚结构，判断病毒是否存在。Tospovirus属病毒粒子为具有包膜的球状病毒，病毒粒子的直径为80-120nm，通过电镜观察，依据病毒粒子的形状和大小可以判断到科或属，但不能确定种，不能准确鉴定TSWV病毒。
传统生物学测定，一方面可以通过摩擦接种等方法获得病毒寄主范围特征，也可以通过其他传统方法确定病毒传播途径、介体的种类、病毒寄主范围、体外保毒期、稀释限点以及与已知病毒的交叉保护作用和细胞质内含体形态等其他生物学指标。但是传统生物学测定不能准确检测和鉴定TSWV病毒，且耗时较长，不能满足生产及检疫部门快速检测的需要。另外，不同病毒在同种植物上产生的症状有相似性；同种病毒的不同株系可产生不同症状、复合侵染及病毒卫星RNA会影响症状表现、病毒常会产生潜隐侵染、不同土壤和气候条件可改变症状表现等，使传统生物学测定不能准确检测和鉴定TSWV病毒。
目前，分子生物学检测技术中利用PCR(聚合酶链反应，Polymerase ChainRe-action简称PCR)和RT-PCR(反转录聚合酶链反应，reversetranscription-PCR,简称RT-PCR)方法检测植物病毒应用非常广泛。1996年，Weekes等成功地用RT-PCR检测到Tospovirus属病毒，以后对该方法又作了一些修改。2001年Cortez等又对该技术作了修改，使检测更加灵敏、可靠。2003年Giovanna等成功地用RT-PCR检测到单头蓟马体内的TSWV。但是，现在所用的特异性引物主要是依据N基因序列或其他单基因，或其他单条RNA序列所设计的，应用该类引物的RT-PCR检测技术，会出现假阳性的结果，因此不能通过扩增产物的片段大小来判断结果，还需要进行克隆和测序，以及序列的比对，才能取得准确结果。
此外，为了精确地定量检测基因数量，1993年，Higuchi首次报道了实时PCR(Real time–PCR)方法。1996年由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术，2000年，Cassie等报道了应用实时荧光定量PCR技术定量检测TSWV病毒。但该方法成本较高，不适合一般定性检测鉴定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有RT-PCR检测技术依据基因、列序列设计引物，可能出现的假阳性的缺陷，以及克隆、测序和序列比对的耗时、耗力，实时荧光定量PCR技术昂贵的缺陷，其目的是提供一种具有快速、准确，可靠和特异性强的特点的检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法及其专用引物。
为解决上述技术问题和实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：
1、一种快速检测和鉴定番茄斑萎斑病毒的专用引物L3，该专用引物L3是由前引物和后引物组成，所述专用引物L3的前引物碱基序列如序列表中SEQ IDNO：1所示，所述专用引物L3的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为605bp。
2、一种快速检测和鉴定番茄斑萎斑病毒的专用引物M3，该专用引物M3是由前引物和后引物组成，所述专用引物M3的前引物的碱基序列如序列表中SEQID NO：3所示，所述专用引物M3的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为794bp。
3、一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的专用引物S4，所述的专用引物S4是由前引物和后引物组成，所述专用引物S4的前引物的碱基序列如序列表中SEQID NO：5所示，所述专用引物S4的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为1277bp。
4、一种快速检测和鉴定番茄斑萎斑病毒的分子生物学方法，包括提取感病植物样品的总RNA，RT-PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆，测序和序列比对；在进行RT-PCR扩增中所用的引物是技术方案1所述的专用引物L3。
5、一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法，包括提取感病植物样品的总RNA，RT-PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆，测序和序列比对；在RT-PCR扩增中所用的引物是技术方案2所述的专用引物M3。
6、一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法，包括提取感病植物样品的总RNA，RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆，测序和序列比对；：在进行RT-PCR扩增中所用的引物是技术方案3所述的专用引物S4。
7、一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法，由提取感病植物样品的总RNA，RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳3部分构成组成，将提取的感病植物样品的总RNA，分别用技术方案1所述的专用引物L3、技术方案2所述的专用引物M3和技术方案3所述的专用引物S4进行RT-PCR扩增，在RT-PCR反应终止后，分别取3μl PCR产物，分别用琼脂糖电泳检测扩增，分别得到L3的扩增片段为605bp、M3的扩增片段为794bp和S4的扩增片段为1277bp，则该植物样品为番茄斑萎病毒所侵染，不需要再进行克隆、测序和序列比对。
8.快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的一组专用引物，所述的一组专用引物由专用引物L3、专用引物M3和专用引物S4组成，所述专用引物L3由前引物和后引物组成，专用引物L3的前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，专用引物L3的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目标产物长度为605bp；所述专用引物M3由前引物和后引物组成，专用引物M3的前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，专用引物M3的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，目标产物长度为794bp；所述专用引物S4由前引物和后引物组成，专用引物S4的前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，专用引物S4的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，目标产物长度为1277bp。
本发明具有以下技术优势：
1、本发明根据病毒基因组中L、M、S RNA的保守序列分别设计3对特异性引物，用其中任何一对引物进行RT-PCR扩增，得到目标产物片段长度为预期值时，测序后加上序列比对，就能够准确检测和鉴定番茄斑萎病毒；本发明此方法具有准确，可靠，特异性强的特点，而且不受寄主植物的影响，能有效地排除假阳性，适用的植物寄主检测范围广。
2、与前人RT-PCR检测技术比较，所设计的三对引物分别取自病毒基因组中L、M、S RNA的保守序列，如果通过这3对引物分别进行RT-PCR扩增分别可以得到L RNA(片段长度：605bp)、M RNA(片段长度：794bp)、S RNA(片段长度：1277bp)，与预测片段一致的PCR产物，不需要再进行测序，就可以确定该样品为番茄斑萎病毒所侵染，本发明此方法不仅具有准确，可靠，特异性强的特点，不受寄主植物的影响，能有效地排除假阳性，适用的植物寄主检测范围广，而且，可以大大缩短检测耗时，省时、省力。整个检测过程5.5h(RNA提取2.5h+RT40min+PCR 1h 50min+电泳0.5h)，而前人的RT-PCR技术进行测序和序列比对，还需要至少1天以上的时间。
3、与前人RT-PCR检测技术比较，本发明所设计的三对引物分别取自病毒基因组中L、M、S RNA的保守序列，可以避免对基因再分配(Gene Reassortment)变异分离物的误检，因为TSWV病毒是三分基因组病毒，基因再分配现象在多基因组病毒变异中较为普遍。两个不同亲本的病毒混合侵染后，双亲各自分段基因组同时复制，再经过彼此对分段基因组的选择交换后，如果其子代病毒粒体中包含着两个亲本的分段基因组，那么这种基因交换现象称做基因再分配；通过分别来源L RNA、M RNA、S RNA的3对引物的PCR扩增，可以避免对基因再分配变异分离物的误检。
本发明所涉及的碱基序列的说明：
序列表中SEQ ID NO：1所示的是本发明的专用引物L3的前引物的碱基序列；
序列表中SEQ ID NO：2所示的是本发明的专用引物L3的后引物的碱基序列；
序列表中SEQ ID NO：3所示的是本发明的专用引物M3的前引物的碱基序列；
序列表中SEQ ID NO：4所示的是本发明的专用引物M3的后引物的碱基序列；
序列表中SEQ ID NO：5所示的是本发明的专用引物S4的前引物的碱基序列；
序列表中SEQ ID NO：6所示的是本发明的专用引物S4的后引物的碱基序列。
附图说明
图1是用S4、M3、L3引物样品进行RT-PCR扩增，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果。M为Marker，S4泳道为专用引物S4经PCR扩增后的电泳检测条带。M3泳道为专用引物M3经PCR扩增后的电泳检测条带。L3泳道为专用引物L3经PCR扩增后的电泳检测条带。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明作进一步阐述，以便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。
下列实施例中实验方法，均为常规方法，所用试剂、材料，均能从生化试剂商店购买到。
实施例1本发明快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的专用引物L3及其设计和用该专用引物L3检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法
(1)专用引物L3及其设计与合成
专用引物L3是以在NCBI(美国国家生物信息中心)上报道的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)(登录号：NC-002052)基因组中的RNA L片段为模板，使用Primer 3设计的，将其编号为专用引物L3，它是由前引物和后引物组成，所述专用引物L3的前引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述专用引物L3的后引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，该专用引物L3的目标产物片段长度为605bp。
上述专用引物L3由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
(2)用专用引物L3检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法，按以下步骤进行
①合成上述步骤(1)所述的专用引物L3。该专用引物L3由北京三博远志生物技术有限公司合成。
②样品的采集
本发明所用带毒植物样品取自云南省昆明市具有坏死、褪绿、叶片畸形、茎坏死等TSWV病毒典型症状的莴苣(Lactuca sativa)植株。
③RNA的提取
应用通用植物总RNA提取试剂盒(购置于BioTeke公司)从上述步骤(2)中②取得的新鲜植株组织中提取RNA，操作步骤根据BioTeke公司提供的使用说明操作。
④RT-PCR反应
选用全氏金Easy Script Two-Step RT-PCR supermix试剂盒(TransGenBiotech,Beijing,code#AE401-01)获得cDNA。参照其说明书。
所述RT-PCR扩增由RT反应和PCR扩增两步法进行，其中第一步RT反应的反应体系为：2×ES Reaction Mix，每反应体积是10μl；EasyScriptTM RT/RIEnzyme Mix，每反应体积是1μl；0.1μg/1μl Random Primer，每反应体积是1μl；总RNA，每个反应体系50ng-5μg，每反应体积是1μl；最后加入RNase FreedH2O使每个反应总体积为20μl；轻轻混合各个试剂后，25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min失活，获得cDNA。
第二步PCR扩增的反应体系为：cDNA 1μl，10μM专用引物L3的前引物0.2μM，10μM专用引物L3的后引物0.2μM，2×TransTaqTM HiFi PCR SuperMixII 25μL，最后加ddH2O至50μL；PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30S，60℃复性30S，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。
⑤电泳检测
取3μl PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶进行检测，与6*loading buffer混匀，通过移液器加入胶孔，将琼脂糖凝胶放入1倍的TAE缓冲液中，在90V电压下进行电泳，能够扩增出605bp左右的片段，如图1。
⑥测序
为了进一步验证最终结果的可靠性，我们将扩增的目标产物由北京百泰克生物有限公司用AB13370DNA自动测序仪进行测序。
⑦序列比对
将获得的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析。与NCBI报道的序列号为NC_002052、D10066、AY070218的TSWV一致性分别为93.8％、93.8％和94.8％。证明该样品为TSWV病毒感染。
实施例2本发明快速准确检测和鉴定番茄斑萎斑病毒的专用引物M3及其设计和用该专用引物M3检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法
(1)专用引物M3及其设计与合成
专用引物M3是以NCBI上报道的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV，登录号为NC_002050)的基因组中RNA M片段为模板，使用Primer 5设计的引物，将其编号为专用引物M3，它是由前引物和后引物组成，所述专用引物M3的前引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述专用引物M3的后引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，所述的专用引物M3的目标产物片段长度为794bp。
上述专用引物M3由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
(2)用该专用引物M3检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法，按以下步骤进行:
①合成本实施例上述步骤(1)所述的专用引物M3。该专用引物M3由北京三博远志生物技术有限公司合成。
②样品的采集
所用带毒植物样品取自云南省昆明市具有坏死、褪绿、叶片畸形、茎坏死等TSWV病毒典型症状的莴苣(Lactuca sativa)植株。
③RNA的提取
应用通用植物总RNA提取试剂盒(购置于BioTeke公司)从上述步骤(2)中②取得的新鲜植株组织中提取RNA，操作步骤根据BioTeke公司提供的使用说明操作。
④RT-PCR反应
选用全氏金Easy Script Two-Step RT-PCR supermix试剂盒(TransGenBiotech,Beijing,code#AE401-01)获得cDNA。参照其说明书。
所述RT-PCR扩增由RT反应和PCR扩增两步法进行，其中：
第一步RT反应的反应体系为：2×ES Reaction Mix，每反应体积是10μl；EasyScriptTM RT/RI Enzyme Mix，每反应体积是1μl；0.1μg/1μl RandomPrimer，每反应体积是1μl；总RNA，每个反应体系50ng-5μg，每反应体积是1μl；最后加入RNase Free dH2O使每个反应总体积为20μl；轻轻混合各个试剂后，25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min。
第二步PCR扩增的反应体系为：cDNA 1μl，10μM专用引物M3的前引物0.2μM，10μM专用引物M3的后引物0.2μM，2×TransTaqTM HiFi PCR SuperMixII 25μL，最后加ddH2O至50μL；PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30S，56℃复性30S，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。
⑤电泳检测
取3μl PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶进行检测，与6*loading buffer混匀，通过移液器加入胶孔，将琼脂糖凝胶放入1倍的TAE缓冲液中，在90V电压下进行电泳，能够扩增出794bp左右的片段。
⑥测序
为了进一步验证最终结果的可靠性，我们将扩增的目标产物由北京百泰克生物有限公司用AB13370DNA自动测序仪进行测序。
⑦序列比对
将获得的目标产物的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析通过序列比对，与Genbank报道的序列号为NC_002050、AY744490、AY744488的TSWV一致性分别为93.5％、95.3％和95.5％。证明该样品为TSWV病毒感染。
实施例3本发明快速准确检测和鉴定番茄斑萎病毒的专用引物S4及其设计和用该专用引物S4检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法
(1)专用引物S4及其设计与合成
专用引物S4是以在NCBI上下载的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wiltvirus,TSWV，登录号为NC_002051)基因组中RNA S片段为模板，，使用Primer5设计的引物，将其编号为专用引物S4，它是由前引物和后引物组成，所述专用引物S4的前引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述专用引物S4的后引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，所述的专用引物S4的目标产物片段长度为1277bp。
上述专用引物S4由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
(2)用专用引物S4检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法，按以下步骤进行：
①合成本实施例上述步骤(1)所述的专用引物S4。该专用引物S4由北京三博远志生物技术有限公司合成。
②样品的采集
本发明所用带毒植物样品取自云南省昆明市具有坏死、褪绿、叶片畸形、茎坏死等TSWV病毒典型症状的莴苣(Lactuca sativa)植株。
③RNA的提取
应用通用植物总RNA提取试剂盒(购置于BioTeke公司)从上述步骤(2)中②取得的新鲜植株组织中提取RNA，操作步骤根据BioTeke公司提供的使用说明操作。
④RT-PCR反应
选用全氏金Easy Script Two-Step RT-PCR supermix试剂盒(TransGenBiotech,Beijing,code#AE401-01)获得cDNA。参照其说明书。
所述RT-PCR扩增由RT反应和PCR扩增两步法进行，其中第一步RT反应的反应体系为：2×ES Reaction Mix，每反应体积是10μl；EasyScriptTM RT/RIEnzyme Mix，每反应体积是1μl；0.1μg/1μl Random Primer，每反应体积是1μl；总RNA，每个反应体系50ng-5μg，每反应体积是1μl；最后加入RNase FreedH2O使每个反应总体积为20μl；轻轻混合各个试剂后，25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min；
第二步PCR扩增的反应体系为：cDNA 1μl，10μM专用引物S4的前引物0.2μM，10μM专用引物S4的后引物0.2μM，2×TransTaqTM HiFi PCR SuperMixII 25μL，最后加ddH2O至50μL；PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30S，52℃复性30S，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。
⑤电泳检测
取3μl PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶进行检测，与6*loading buffer混匀，通过移液器加入胶孔，将琼脂糖凝胶放入1倍的TAE缓冲液中，在90V电压下进行电泳，能够扩增出1277bp左右的片段，如图1。
⑥测序
为了进一步验证最终结果的可靠性，我们将扩增的目标产物由北京百泰克生物有限公司用AB13370DNA自动测序仪进行测序。
⑦序列比对
将获得的目标产物的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析，通过序列比对，与Genbank报道的序列号为NC_002051、AY744479、AY744478的TSWV一致性分别为93％、94.6％和93％。证明该样品为TSWV病毒感染。
实施例4用本发明的3对专用引物L3、M3、S4检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法
此检测和鉴定方法是分别按照实施例1，实施例2和实施例3步骤(1)至步骤(2)⑤的操作步骤及其条件进行专用引物设计与合成，样品的采集，RNA的提取，RT-PCR反应和电泳检测，RT-PCR反应终止后，分别取3μl PCR产物，用1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增出605bp、794bp和1277bp左右的片段即该植物样品为番茄斑萎病毒所侵染，如图1。
实验结果判断：检测和鉴定过程中如果只选择用本发明所述的3对引物中任一对引物，除了RT-PCR扩增片段大小必须和预测片段一致外，应该进行测序，将所获得的片段进行序列比对，当所获得的片段的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析，通过序列比对，才能确定待测样品是否为TSWV，以避免实验结果的假阳性出现。但是如果用实施例4所述的方法进行检测和鉴定，得到的3个扩增片段大小都与目标片段一致，就可以确定该样品是TSWV，而不需要再进行测序和序列比对，简化了检测过程和实验成本，这样可以大大缩短检测耗时，整个检测过程5.5h(RNA提取2.5h+RT40min+PCR 1h 50min+电泳0.5h)，而现有的RT-PCR技术进行测序和序列比对，还需要至少1天以上的时间。
<110>  云南农业大学
 
<120>  一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法及其引物
 
<130>  /
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
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<212>  DNA
<213>  番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)
 
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<213>  番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)
 
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<213>  番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)
 
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<213>  番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)
 
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<213>  番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)
 
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<213>  番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)
 
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Claims (8)

1.一种快速检测和鉴定番茄斑萎斑病毒的专用引物L3，其特征在于：所述专用引物L3是由前引物和后引物组成，所述专用引物L3的前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述专用引物L3的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目标产物长度为605bp。
2.一种快速检测和鉴定番茄斑萎斑病毒的专用引物M3，其特征在于：所述专用引物M3是由前引物和后引物组成，所述专用引物M3的前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述专用引物M3的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，目标产物长度为794bp。
3.一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的专用引物S4，其特征在于：所述专用引物S4是由前引物和后引物组成，所述专用引物S4的前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述专用引物S4的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，目标产物长度为1277bp。
4.一种快速检测和鉴定番茄斑萎斑病毒的分子生物学方法，包括提取感病植物样品的总RNA，用引物进行RT-PCR扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆和测序和序列比对，其特征在于：在所述用引物进行RT-PCR扩增中所用的引物是权利要求1所述的专用引物L3。
5.一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法，包括感病提取植物样品的总RNA，用引物进行RT-PCR扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆和测序和序列比对，其特征在于：在所述用引物进行RT-PCR扩增中所用的引物是权利要求2所述的专用引物M3。
6.一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法，包括提取感病植物样品的总RNA，用引物进行RT-PCR扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆和测序和序列比对，其特征在于：在所述用引物进行RT-PCR扩增中所用的引物是权利要求3所述的专用引物S4。
7.一种快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的分子生物学方法，由提取感病植物样品的总RNA，用引物进行RT-PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测组成，其特征在于：在所述用引物进行RT-PCR扩增中是分别用权利要求1所述的专用引物L3，权利要求2所述的专用引物M3和权利要求3所述的专用引物S4进行扩增，在RT-PCR反应终止后，分别取3μl PCR产物，用琼脂糖电泳检测扩增，如果扩增片段大小分别为605bp、794bp和1277bp，则该植物样品为番茄斑萎病毒所侵染。
8.快速检测和鉴定番茄斑萎病毒的一组专用引物，其特征在于：所述的一组专用引物由专用引物L3、专用引物M3和专用引物S4组成，所述专用引物L3由前引物和后引物组成，专用引物L3的前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，专用引物L3的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目标产物长度为605bp；所述专用引物M3由前引物和后引物组成，专用引物M3的前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，专用引物M3的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，目标产物长度为794bp；所述专用引物S4由前引物和后引物组成，专用引物S4的前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，专用引物S4的后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，目标产物长度为1277bp。
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