CN101906487A - 一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法 - Google Patents

一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101906487A
CN101906487A CN 201010245134 CN201010245134A CN101906487A CN 101906487 A CN101906487 A CN 101906487A CN 201010245134 CN201010245134 CN 201010245134 CN 201010245134 A CN201010245134 A CN 201010245134A CN 101906487 A CN101906487 A CN 101906487A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
copy number
sample
nucleic acid
standard substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 201010245134
Other languages
English (en)
Inventor
戴志红
关孚时
王在时
蒋卉
李翠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Institute of Veterinary Drug Control
Original Assignee
China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Institute of Veterinary Drug Control filed Critical China Institute of Veterinary Drug Control
Priority to CN 201010245134 priority Critical patent/CN101906487A/zh
Publication of CN101906487A publication Critical patent/CN101906487A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

本发明涉及一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法。本发明所涉及的猪瘟病毒核酸标准物质是通过以下技术步骤制备的：(1)选择基因保守区为扩增靶区；(2)引物设计、合成；(3)序列扩增；(4)克隆、鉴定；(5)体外转录；(6)分装；(7)RNA拷贝数测定；(8)检验；(9)协作标定；(10)定值。利用本发明制备的猪瘟病毒核酸标准物质无感染性、适用范围广、均匀性好、稳定性高、拷贝数定值准确，可用于RT-PCR或荧光定量PCR诊断试剂的质量控制、科学研究与实验室诊断的对照以及实验室之间的能力比对。

Description

一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法
技术领域
本发明涉及猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法，属于标准物质技术和兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病，在世界上很多国家和地区均有发生，给畜牧业生产带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为法定通报性疫病，我国将其划为一类动物传染病。
随着分子生物学检测技术发展，RT-PCR、荧光定量PCR等检测技术也逐渐广泛应用于猪瘟病毒检测。这类技术通过检测病毒特异性的核酸片段来检测猪瘟病毒，具有灵敏性高、检测快速等优点；但也易受试剂盒质量、核酸提取、翻转录效率、核酸污染、RNA酶污染等影响，实验结果往往因为试剂质量、人员的经验和能力以及实验设施、环境的影响而存在较大误差，严重制约了检测结果的准确性，因此亟需使用标准物质作为客观、公正的标尺，用于检测试剂盒产品的质量控制、科学研究与实验室诊断的参照以及实验室之间的能力比对。然而，由于猪瘟病毒核酸标准物质的质量要求很高，制备程序和检验、标定方法严格，有关制备程序和标定方法至今未见报道。
发明内容
本发明的目的是建立一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法。
本发明包括以下技术方案：
(1)选择猪瘟病毒基因保守区为扩增靶区，与一般PCR或荧光PCR检测的目标片段相适应；
(2)设计、合成针对该基因保守区的上下游引物；
(3)目标序列扩增：用RNA提取试剂盒提取病毒液(组织)总RNA；用随机引物反转录，获得总cDNA；再用病毒特异的上下游引物扩增目标片段；通过核酸电泳检测扩增产物；
(4)目的基因的克隆：将扩增产物用纯化试剂盒纯化、回收；将目的基因片段克隆至载体；转化感受态大肠杆菌；涂于筛选培养基，37℃培养12-16h；挑取转化成功的菌落，接种于液体培养基，37℃振荡培养12～16h；用质粒提取试剂盒提取重组质粒，双向测序鉴定；
(5)体外转录：对提取的质粒酶切；回收含启动子和目的基因的DNA片段；用转录试剂盒进行体外转录；加入DNase去除转录产物中的DNA；重新提取、纯化RNA；在无RNA酶的水中重溶RNA；
(6)分装：将重溶的RNA分装至无RNA酶的小管中，20μL/管，-80℃冻存；
(7)RNA拷贝数测定：取体外转录的RNA(6)，用无RNA酶灭菌水作10倍和100倍稀释，测定其在260nm和280nm的吸光度值(OD)，根据吸光值及稀释倍数计算体外转录样品浓度，必要时可测定多次统计分析；根据已知RNA核酸序列，推算单个RNA模板的分子量；根据样品浓度和单个RNA分子量计算RNA单位体积内的拷贝数；
(8)检验：
1)均匀性试验：从样品随机选取一定数量的样品(根据统计需要)，检测每个样品单位体积RNA拷贝数，对结果进行统计分析，要求各样品的检测值之间经统计分析无显著差异；
2)稳定性试验：每隔一定时间随机抽取样品进行检测，根据单位体积RNA拷贝数下降情况，计算其保存期；
(9)协作标定：将样品分发国内相关机构，让各单位检测收到的样品单位体积RNA拷贝数；
(10)定值：对所有样品的测定结果进行统计、分析，剔除异常值；确定该标准物质最终的单位体积RNA拷贝数。
本发明的详细描述
1.选择猪瘟病毒基因保守区5’端非编码区(5’UTR)为扩增靶区。
2.设计、合成引物：
A1：5’-AGT ACA GGG TAG TCG TCA GTG GTT CG-3’；
A2：5’-CTG CTG TAC ATG GCA CAT GGA GTT G-3’；
由上海英骏生物技术有限公司合成，用DEPC水配成0.25μM，-20℃保存备用。
3.目标序列扩增：
用TRIzol Reagent试剂盒(购自Invitrogen公司)提取病毒液(组织)总RNA；取10μl RNA，加入2μl Oligo(dT)和8μl反转录液(5×Buffer 4μl，2μl DTT，1μl dNTP，0.5μl反转录酶，0.5μl RNasin)，按42℃60min、70℃/15min反转录，获得总cDNA；
取10μl cDNA，加入29μl H2O，95℃预变性5min，加入11μl PCR液(10×Buffer 5μl，A1 1μl，A2 1μl，dNTP 2μl，Taq酶2μl)，按94℃/1min，57℃/1min，72℃/1min40S进行35个循环；
最后再72℃延伸10min；取5～10μl扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，出现目标条带则表明扩增成功(如图1)。
4.目的基因的克隆：
将扩增产物用纯化试剂盒纯化、回收；将目的基因片段克隆至pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)；
转化感受态大肠杆菌JM109(购自Promega公司)；
涂于含有X-Gal和IPTG的AMP+LB琼脂平板，37℃培养12～16h；随机挑取3～4个白色单菌落，接种于AMP+LB液体培养基，37℃振荡培养12～16h；
用Wizard Plus Minipreps DNA Purification System试剂盒(购自Promega公司)提取重组质粒，送至北京华大中生科技发展有限公司双向测序鉴定，结果与设计的目的基因片段序列一致。
5.体外转录：
对提取的质粒用Pvu II酶切；用DNA片段回收试剂盒回收含T7启动子和目的基因的DNA片段；
用Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒(购自Promega公司)进行体外转录，反应体系如下：T7 Transcription 5×Buffer 20μl，dNTP 30μl，Linear DNA template 5μl，Enzyme Mix(T7)10μl，补充DEPC水至100μl，37℃/5h；
加入DNase 37℃/15min去除转录产物中的DNA；
用TRIzol Reagent试剂盒(购自Invitrogen公司)重新提取、纯化RNA；在DEPC水中重溶RNA。
6.分装：将重溶的RNA分装至DEPC水处理过的小管中，20μL/管，-80℃冻存。
7.RNA拷贝数测定
制备的RNA样品经10倍和100倍稀释，吸光光度值测定结果是：10倍稀释，OD260＝0.44406，浓度为35.5248μg/ml；100倍稀释，OD260＝0.03481，浓度为3.4827μg/ml；根据核酸序列推算出单链模板的分子量MW＝669.40kDa；经计算，得出每管RNA分子的拷贝数为：3.11×1012拷贝/20μl。
8.猪瘟病毒核酸标准物质检验和定值
(1)均匀性试验：从样品随机选取10支样品，检测每个样品单位体积RNA拷贝数，结果见表1。经统计分析，各样品之间无显著差异，表明该批样品均匀性良好。
(2)稳定性试验：每隔1周随机抽取样品进行检测，结果11周后检测结果与第1个月检测结果无显著差异，说明该样品稳定性良好，经推测，其稳定保存期在5年以上。
(3)协作标定：将样品分发国内相关机构，让各单位检测收到的样品单位体积RNA拷贝数；结果见表2。
(4)定值：对所有样品的测定结果进行统计、分析，剔除异常值；确定该标准物质最终单位体积RNA拷贝数为3.11±0.027×1012拷贝/20μl。
本发明的积极意义
本发明涉及一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法。应用本发明制备的猪瘟病毒核酸标准物质具有以下优点和用途：
(1)以猪瘟病毒基因序列的高度保守区为扩增靶区，与一般PCR或荧光PCR检测的目标片段相适应，特异性好，适用范围广，并且不会泄露我国猪瘟病毒特有的基因信息；
(2)利用本发明制备的猪瘟病毒核酸标准物质无感染性，没有生物安全风险，可以广范应用，适用范围广、安全性高；
(3)利用本发明制备的猪瘟病毒核酸标准物质是RNA片段而不是DNA片段或质粒，与猪瘟病毒原有核酸种类保持了一致，可以充分控制受试者的实验条件和实验过程；
(4)利用本发明制备的猪瘟病毒核酸标准物质经测定和计算得出的拷贝数定值准确，而且经过协作标定定值，更增加了其可信度；
(5)利用本发明制备的猪瘟病毒核酸标准物质可以根据已知的拷贝数稀释成单位体积含有不同拷贝数的一系列样品，用于RT-PCR或荧光定量PCR诊断试剂的质量控制、科学研究与实验室诊断的对照以及实验室之间的能力比对。
附图说明
图1CSFV 5’UTR扩增结果    图中所示：M-DL2000marker；1-病毒培养液扩增产物；2-未接种病毒培养液扩增产物
实施例
实施例1
1.选择猪瘟病毒基因保守区5’端非编码区(5’UTR)为扩增靶区。
2.设计、合成引物：A1：5’-AGT ACA GGG TAG TCG TCA GTG GTT CG-3’；A2：5’-CTG CTG TAC ATG GCA CAT GGA GTT G-3’；由上海英骏生物技术有限公司合成，用DEPC水配成0.25μM，-20℃保存备用。
3.目标序列扩增：用TRIzol Reagent试剂盒(购自Invitrogen公司)提取病毒液(组织)总RNA；取10μl RNA，加入2μl Oligo(dT)和8μl反转录液(5×Buffer 4μl，2μl DTT，1μl dNTP，0.5μl反转录酶，0.5μl RNasin)，按42℃60min、70℃/15min反转录，获得总cDNA；取10μlcDNA，加入29μl H2O，95℃预变性5min，加入11μl PCR液(10×Buffer 5μl，A1 1μl，A2 1μl，dNTP 2μl，Taq酶2μl)，按94℃/1min，57℃/1min，72℃/1min40S进行35个循环；最后再72℃延伸10min；取5～10μl扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，出现目标条带则表明扩增成功(如图1)。
4.目的基因的克隆：将扩增产物用纯化试剂盒纯化、回收；将目的基因片段克隆至pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)；转化感受态大肠杆菌JM109(购自Promega公司)；涂于含有X-Gal和IPTG的AMP+LB琼脂平板，37℃培养12～16h；随机挑取3-4个白色单菌落，接种于AMP+LB液体培养基，37℃振荡培养12～16h；用Wizard Plus Minipreps DNAPurification System试剂盒(购自Promega公司)提取重组质粒，送至北京华大中生科技发展有限公司双向测序鉴定，结果与设计的目的基因片段序列一致。
5.体外转录：对提取的质粒用Pvu II酶切；用DNA片段回收试剂盒回收含T7启动子和目的基因的DNA片段；用Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒(购自Promega公司)进行体外转录，反应体系如下：T7 Transcription 5×Buffer 20μl，dNTP 30μl，Linear DNA template 5μl，Enzyme Mix(T7)10μl，补充DEPC水至100μl，37℃/5h；加入DNase37℃/15min去除转录产物中的DNA；用TRIzol Reagent试剂盒(购自Invitrogen公司)重新提取、纯化RNA；在DEPC水中重溶RNA。
6.分装：将重溶的RNA分装至DEPC水处理过的小管中，20μL/管，-80℃冻存。
实施例2
RNA拷贝数测定
制备的RNA样品经10倍和100倍稀释，吸光光度值测定结果是：10倍稀释，OD260＝0.44406，浓度为35.5248μg/ml；100倍稀释，OD260＝0.03481，浓度为3.4827μg/ml；根据核酸序列推算出单链模板的分子量MW＝669.40kDa；经计算，得出每管RNA分子的拷贝数为：3.11×1012拷贝/20μl。
实施例3
猪瘟病毒核酸标准物质检验和定值
1.均匀性试验：从样品随机选取10支样品，检测每个样品单位体积RNA拷贝数，结果见表1。经统计分析，各样品之间无显著差异，表明该批样品均匀性良好。
表1RNA样品拷贝数(×1012拷贝/20μl)
Figure BSA00000216800500061
2.稳定性试验：每隔1周随机抽取样品进行检测，结果11周后检测结果与第1个月检测结果无显著差异，说明该样品稳定性良好，经推测，其稳定保存期在5年以上。
3.协作标定：将样品分发国内相关机构，让各单位检测收到的样品单位体积RNA拷贝数；结果见表2。
表2各协作单位测定的RNA样品拷贝数(×1012拷贝/20μl)
4.定值：对所有样品的测定结果进行统计、分析，剔除异常值；确定该标准物质最终单位体积RNA拷贝数为3.11±0.027×1012拷贝/20μl。
Figure ISA00000216800700011

Claims (1)

1.一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法，其特征在于包括以下技术步骤：
(1)选择猪瘟病毒基因保守区为扩增靶区；
(2)设计、合成针对该基因保守区的上下游引物；
(3)目标序列扩增：提取病毒液或组织的总RNA；用随机引物反转录，获得cDNA；再用上下游引物扩增目标片段；电泳检测扩增产物；
(4)目的基因的克隆：将扩增产物纯化、回收；将目的基因片段克隆至载体；转化感受态细胞；挑取转化成功的菌落，大量培养；提取重组质粒，双向测序鉴定；
(5)体外转录：对提取的质粒酶切；回收含启动子和目的基因的DNA片段；用转录试剂盒进行体外转录；加入DNase去除转录产物中的DNA；重新提取、纯化RNA；在无RNA酶的水中重溶RNA；
(6)分装：将重溶的RNA分装至无RNA酶的小管中，20μL/管，-80℃冻存；
(7)RNA拷贝数测定：取体外转录的RNA，用无RNA酶灭菌水作10倍和100倍稀释，测定其在260nm和280nm的OD值，计算体外转录样品浓度；根据已知RNA核酸序列，推算单个RNA模板的分子量，计算RNA单位体积内的拷贝数；
(8)检验：
1)均匀性试验：从样品随机选取一定数量的样品，检测每个样品单位体积RNA拷贝数，对结果进行统计分析，要求各检测值之间无显著差异；
2)稳定性试验：每隔一定时间随机抽取样品进行检测，根据单位体积RNA拷贝数下降情况，计算其保存期；
(9)协作标定：将样品分发国内相关机构，检测单位体积RNA拷贝数；
(10)定值：对所有测定结果进行统计、分析，剔除异常值；确定该标准物质最终的单位体积RNA拷贝数。
CN 201010245134 2010-08-05 2010-08-05 一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法 Pending CN101906487A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010245134 CN101906487A (zh) 2010-08-05 2010-08-05 一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010245134 CN101906487A (zh) 2010-08-05 2010-08-05 一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101906487A true CN101906487A (zh) 2010-12-08

Family

ID=43262071

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010245134 Pending CN101906487A (zh) 2010-08-05 2010-08-05 一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101906487A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110616200A (zh) * 2018-06-19 2019-12-27 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质及其制备方法
CN110735004A (zh) * 2019-09-26 2020-01-31 北京市动物疫病预防控制中心 一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法
CN111560477A (zh) * 2020-05-25 2020-08-21 菁良基因科技(深圳)有限公司 一种covid-19质控品及其应用
CN112553220A (zh) * 2020-12-28 2021-03-26 昆明海关技术中心 一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1511190A (zh) * 2001-03-27 2004-07-07 ��̩��˹ҩ��ɷ����޹�˾ 用于hcv感染的组合物和方法
CN1551913A (zh) * 2001-09-06 2004-12-01 ���ָ����Ӣ��ķά��÷�Ͽ����޹� 传染性和减毒的牛病毒性腹泻病毒克隆,其产生方法及用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1511190A (zh) * 2001-03-27 2004-07-07 ��̩��˹ҩ��ɷ����޹�˾ 用于hcv感染的组合物和方法
CN1551913A (zh) * 2001-09-06 2004-12-01 ���ָ����Ӣ��ķά��÷�Ͽ����޹� 传染性和减毒的牛病毒性腹泻病毒克隆,其产生方法及用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）农业科学辑》 20070515 蒋春燕 "猪瘟病毒实时荧光定量PCR快速检测试剂盒的研制与应用" 第14-23页第1.2.1-1.2.12节方法 1 , 第5期 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110616200A (zh) * 2018-06-19 2019-12-27 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质及其制备方法
CN110735004A (zh) * 2019-09-26 2020-01-31 北京市动物疫病预防控制中心 一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法
CN111560477A (zh) * 2020-05-25 2020-08-21 菁良基因科技(深圳)有限公司 一种covid-19质控品及其应用
CN111560477B (zh) * 2020-05-25 2024-04-19 菁良科技(深圳)有限公司 一种covid-19质控品及其应用
CN112553220A (zh) * 2020-12-28 2021-03-26 昆明海关技术中心 一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107916304A (zh) 犬瘟热病毒荧光ema检测引物组、试剂盒和检测方法
CN106350608A (zh) 一种锦鲤疱疹病毒ⅲ型的检测试剂盒及其检测方法
CN103725796A (zh) 一种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光pcr检测试剂盒及其制备
CN110669852A (zh) 用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒
CN101144775B (zh) 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒
CN101906487A (zh) 一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法
CN107164557A (zh) 一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜a型双重实时荧光定量pcr方法的引物及应用
CN102337342B (zh) 用于诊断和鉴别牛巴贝斯虫种类的试剂盒及制备方法
CN102154497A (zh) 霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法
CN108315478A (zh) Raa荧光法检测狂犬病病毒的探针及试剂盒
CN105368985A (zh) 对虾tsv和imnv荧光定量检测引物和探针及试剂盒
CN102676664A (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN112391483A (zh) 用于恒温扩增检测鼠疫杆菌的核酸序列、试剂盒及方法和应用
CN103468806A (zh) 扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法
CN103667531A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒的fq-pcr检测方法及其引物对
CN101333557A (zh) 一种环境水体样品中多种肠道病原菌的同时定量检测方法
CN102286642B (zh) 大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用
CN106435007A (zh) 一种荧光定量pcr检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法
CN104152582A (zh) 牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法
CN101760518A (zh) 一种结核分支杆菌活菌rna提取方法及其检测试剂盒
CN103740822B (zh) 一种spf小鼠病原菌核酸荧光定量pcr联合快速检测试剂盒及检测方法
CN103305629B (zh) 一种环境水体中cva16病毒的检测方法
CN102676678A (zh) 用于区分五种贝类饵料微藻的pcr引物组
CN101805788B (zh) 基于scar分子标记快速检测副溶血弧菌的pcr特异扩增引物及检测试剂盒
CN102676662B (zh) 沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法和试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20101208