CN103305629B - 一种环境水体中cva16病毒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环境水体中CVA16病毒的检测方法。方法中以根据肠道病毒属VP1血清分型区的基因保守片段设计的针对CVA16病毒的引物和探针，制备重组质粒作为标准品，建立了半巢式RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR反应体系，对环境水体中的CVA16病毒进行检测。该方法具有良好的特异性，灵敏度和精密度高，可对环境水体中的CVA16病毒进行准确的定性和定量检测。

Description

一种环境水体中CVA16病毒的检测方法

技术领域

本发明属于环境水体质量的检测技术领域，具体涉及一种环境水体中CVA16病毒的检测方法。

技术背景

柯萨奇病毒A16型(CVA16)是引起手足口疾病的主要病原体之一，隶属于肠道病毒属。CVA16是一种水媒传播病毒，它可从受CVA16感染的病人分泌物泄入环境水体中，且可在环境水体中生存较长时间。受其污染的水体成为CVA16的一个重要污染源，可引发手足口疾病的爆发。

现有检测CVA16的方法主要有细胞培养法和聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)。环境水体中存在多种病原微生物，尤其是其他肠道病毒，这些微生物对细胞培养检测CVA16有干扰作用的，细胞培养法很难对其区分鉴定。PCR方法广泛应用于CVA16的检测。但，现有的PCR检测技术主要应用于医学领域，检测样本基本来自人体分泌物，而环境水体中CVA16浓度低，检测影响因素复杂，现有的PCR检测方法不能对环境水体中CVA16进行准确定性或定量检测。目前还没有适合用于对环境水体中CVA16的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环境水体中CVA16病毒的检测方法。

为实现上述技术任务，本发明采取的技术解决方案如下：

步骤一，样品处理：

(1)病毒浓缩：首先在4℃条件下于V mL的待检测水样中加入质量百分比为8％的聚乙二醇和质量百分比为2.3％的氯化钠并混匀，接着将待检测水样在4℃条件下进行离心处理，弃上清液，用1mL超纯水重悬沉淀得到病毒浓缩液，其中50≤V≤250；

(2)RNA提取：使用RNA提取试剂盒从病毒浓缩液中提取RNA；

(3)逆转录：将5μL的RNA、2μL的5×gDNA Eraser Buffer、1μL的5×gDNAEraser Buffer和2μL的RNase Free dH₂O在42℃条件下反应2min得到反应液，将该反应液与4μL的5×Buffer、1μL的RT EnzymeMix、1μL的RT Primer Mix和4μL的RNase Free dH₂O混合进行反应：先在37℃条件下反应15min；接着在85℃条件下反应5s，得到cDNA；

步骤二，定性检测

(1)将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的ExTaq、400nM的上游引物CVA16-F1、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；PCR反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次，每轮循环的反应条件依次为：95℃，30s、56℃，30s、72℃，60s；

③在72℃延伸5min，反应产物为PCR产物一；

其中：

上游引物CVA16-F1的核苷酸序列为：

5’-TGGGAYATTGAYTTGATGGG-3’；

下游引物CVA16-R的核苷酸序列为：

5’-GACATGAAGGGKACTGACACTTG-3’；

(2)将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的ExTaq、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和0.2μL PCR产物一混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次，每轮循环的反应条件依次为：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s；

③在72℃延伸5min，扩增产物为PCR产物二；

其中：上游引物CVA16-F2的核苷酸序列为：

5’-CAAACCRAAYGGTGAGYTAGT-3’；

(3)将所得的PCR产物二用含体积浓度2％Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照，并将电泳条带切割胶纯化回收，得胶纯化回收产物；

(4)采用双脱氧终止法对所得胶纯化回收产物进行核苷酸序列测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度大于70％时，待检测水样中存在CVA16，继续依次进行后续步骤三和步骤四，否则，待检测水样中不存在CVA16；

步骤三，标准品制备：

(1)第一轮PCR扩增：以步骤一获得的cDNA为模板，利用上游引物CVA16-F1和下游引物CVA16-R为引物进行PCR扩增，得到第一轮扩增后的PCR产物；

(2)第二轮PCR扩增：以第一轮扩增后的PCR产物为模板，利用上游引物CVA16-F2和下游引物CVA16-R为引物进行PCR扩增，得到第二轮扩增后的PCR产物；

(3)将所得的第二轮扩增后的PCR产物用含体积浓度为2％的Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照确认目的条带，之后切割目的条带并纯化回收，得到目的片段回收产物，该目的片段回收产物的长度为m(bp)；

(4)将目的片段回收产物与pMD19-T载体连接转化至大肠杆菌DH5α中，采用蓝白斑筛选法筛选出转化进插入目的片段的载体的菌落，将阳性菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37℃条件下培养12～16小时得到菌液，接着用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒；其中LB液体培养基中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL；

(5)采用双脱氧终止法对得到的质粒的核苷酸序列进行测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，

当所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度大于等于90％时，提取的质粒为标准品，

当所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度小于90％时，重复步骤(4)和步骤(5)，直至提取的质粒为标准品；

(6)检测标准品的OD₂₆₀值n；

(7)利用(式1)计算标准品浓度C(copies/μL)：

$C=\frac{n\×50\×{10}^{-9}}{(2962+m)\×2\×330}\×6.02\×{10}^{23}$     (式1)

式1中：

2962为pMD19-T载体的长度，bp；

1OD₂₆₀＝50μg/mL的双链DNA；

330为1碱基的分子量，g/mol；

6.02×10²³为阿伏伽德罗常数，NA；

步骤四，定量检测

(1)将步骤三得到的标准品依次稀释至多个浓度梯度；利用实时荧光定量PCR分别检测各浓度梯度样品的Ct值和初始模版量x(copies)，接着利用测得的七组Ct-x进行线性回归分析，得到标准曲线方程：

Ct＝alogx+b    (式2)

(式2)中：a和b为标准曲线方程的系数；

(2)采用实时荧光定量PCR检测步骤一所获得的cDNA的Ct值：Ct₀；

(3)将Ct₀代入(式2)计算待检测水样中CVA16病毒的初始模板量x₀；待检测水样中CVA16病毒的含量C₁(copies/mL)为：

$C_1=\frac{x_0(20/2)(60/5)(1000/140)}{V}$   (式3)。

上述步骤三的(6)步骤中采用微量紫外分光光度计法检测标准品的OD₂₆₀值。

上述步骤四的(1)步骤中将步骤三得到的标准品依次稀释至c×10^-4copies/μL、c×10^-5copies/μL、c×10^-6copies/μL、c×10^-7copies/μL、c×10^-8copies/μL、c×10^-9copies/μL和c×10^-10copies/μL七个浓度梯度。

上述步骤四的(2)步骤中采用实时荧光定量PCR检测cDNA的Ct值，具体过程如下：将12.5μL的2×SYBR Mix、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在实时定量PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：

①95℃预变性1min；

②扩增循环40次，每次循环的反应条件依次为：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s、80.5℃，15s；其中80.5℃为读板温度；

③从65℃以0.5℃/s的速率升温至95℃，在此期间每上升0.5℃读板一次，进行熔解曲线测定。

该方法采用半巢式RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法对环境水体中的CVA16病毒含量进行检测，与现有技术相比，本发明的方法具有如下的技术有点：

(1)方法中所设计的引物特异性高，与环境中常见的其他病原微生物没有交叉反应；

(2)灵敏度高，在环境样品中，常规PCR的电泳结果呈现阴性结果，在半巢式第二轮PCR中，某些样品成阳性结果。半巢式PCR大幅度提高了常规PCR检测的灵敏度；

(3)定性结果准确，并可获得阳性样品中CVA16核酸序列，有助于更深一步基因层面的分析和鉴定；

(4)精确定量，本发明采用由一系列梯度稀释的重组质粒作为模板进行实时荧光定量PCR制得CVA16的标准曲线，根据式2和式3可以对水样中CVA16的含量检测；

(5)检测范围宽广，本方法当CVA16模板量在1.190×10⁰copies/μL～1.190×10⁹copies/μL范围内，模板量对数值与C_T之间具有良好的线性关系；

(6)精密度高，样品CT值的组内变异系数均低于1.5％，组间变异系数均低于3％，故本方法具有较高的精密度。

附图说明

图1为实施例中PCR产物二的电泳图；

图2为实施例中实时定量PCR标准曲线图；

图3为实施例中实时定量PCR扩增曲线图。

具体实施方式

发明人根据肠道病毒VP1血清分型区序列的保守片段，设计可以特异地扩增CVA16的半巢式PCR引物，引物序列如表1所示，经BLAST在NCBI基因库比对分析，与各引物具有高度相似性的序列都来源于其对应的CVA16的核酸。

表1 引物序列表

^a兼并引物碱基:Y＝C/T,R＝A/G,K＝G/T.

^b基因库序列号JQ316639.

以下是发明人给出的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。

实施例：

该实施例中所用设备和试剂如下：

(1)高速冷冻离心机，最大转速14000r/min；

(2)4℃、-80℃冰箱

(3)离心管，50mL，1.5mL，0.5mL，0.2mL；

(4)微量紫外分光光度计；

(5)恒温金属加热器

(6)细菌摇床、细菌培养箱

(7)实时荧光定量PCR仪；

(8)梯度定性PCR仪；

(9)电泳仪；

(10)凝胶成像仪

(11)pMD19-T载体；

(12)感受态大肠杆菌DH5α：

(13)盐酸，NaCl溶液，MgCl₂溶液等；

(14)分子量6000的聚乙二醇(PEG-6000)，葡萄糖等；

(15)5mol/L NaCl溶液；

(16)IPTG/X-gal/Amp平板；

(17)LB液体培养基；

(20)总RNA提取试剂盒；

(18)逆转录试剂盒；

(19)dNTP mixture；

(20)10×Ex Taq buffer；

(21)SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒；

(22)质粒提取试剂盒；

(22)所用特异性引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

具体检测方法如下：

步骤一，样品处理：

(1)病毒浓缩：于50mL的待检测水样(采自西安某污水厂原污水，并于4℃条件下保存)中加入质量百分比为8％的聚乙二醇和质量百分比为2.3％的氯化钠，接着将待检测水样在100rpm、4℃条件下搅拌12小时，然后将待检测水样在9000g、4℃条件下离心30分钟，弃上清液，用1mL超纯水重悬沉淀得到病毒浓缩液；

(2)RNA提取：使用RNA提取试剂盒从病毒浓缩液中提取RNA；

(3)逆转录：将5μL的RNA、2μL的5×gDNA Eraser Buffer、1μL的5×gDNAEraser Buffer和2μL的RNase Free dH₂O在42℃条件下反应2min得到反应液，将该反应液与4μL的5×Buffer、1μL的RT EnzymeMix、1μL的RT Primer Mix和4μL的RNase Free dH₂O混合进行如下反应：先在37℃条件下反应15min；接着在85℃条件下反应5s，得到cDNA，并将所得cDNA在-80℃条件下保存；

步骤二，定性检测

(1)将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的ExTaq、400nM的上游引物CVA16-F1、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：①95℃预变性5min；②扩增循环35次，每轮循环的反应条件为：95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；③在72℃延伸5min，反应产物为PCR产物一；

(2)将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的ExTaq、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和0.2μL PCR产物一混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照，其中的PCR反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次，每次循环的反应条件为：95℃，30s；58℃，30s；72℃，60s；

③在72℃延伸5min，扩增产物为PCR产物二；

(3)将所得的PCR产物二用含体积浓度2％Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照，如图1所示，PCR产物二有一个样品出现目的条带，将电泳条带切割胶纯化回收，得到胶纯化回收产物；

(4)采用双脱氧终止法所得胶纯化回收产物进行核苷酸序列的测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度为96％，故确定待检测水样中存在CVA16；继续依次进行步骤三和步骤四；

步骤三：标准品制备：

(1)第一轮PCR扩增：以步骤一获得的cDNA为模板，以CVA16-F1和CVA16-R为引物进行PCR扩增，得到第一轮扩增后的PCR产物；

(2)第二轮PCR扩增：以第一轮扩增后的PCR产物为模板，以CVA16-F2和CVA16-R为引物进行PCR扩增，得到第二轮扩增后的PCR产物；

(3)将所得的第二轮扩增后的PCR产物用含体积浓度为2％的Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照确认目的条带，；之后切割目的条带并纯化回收，得到目的片段回收产物，目的片段回收产物长度为m＝170bp；

(4)将目的片段回收产物与pMD19-T载体连接转化至大肠杆菌中，采用蓝白斑筛选法筛选出连接转化的菌落，将该菌在含有抗生素卡那霉素(Amp)的LB液体培养基中于37℃条件下培养12～16小时得到菌液，接着用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒；

(5)采用双脱氧终止法对得到的质粒的核苷酸序列进行测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，所测得的核苷酸序列与CVA16病毒基因相似度大于90％，提取的质粒为标准品；

(6)采用微量紫外分光光度计测得标准品的OD₂₆₀值为n＝1.312；

(7)利用(式1)计算标准品浓度C＝1.910×10¹⁰copies/μL；

步骤四，定量检测

(1)将标准品依次稀释至1.910×10⁶copies/μL、1.910×10⁵copies/μL、1.910×10⁴copies/μL、1.910×10³copies/μL、1.910×10²copies/μL、1.910×10¹copies/μL和1.910×10⁰copies/μL七个浓度梯度，利用实时荧光定量PCR分别检测各浓度梯度样品的Ct值和初始模版量x(copies)，即不同初始模板量x(copies)的Ct值，接着利用测得的七组Ct-x{(3.820×10⁶，17.221)、(3.820×10⁵，20.882)、(3.820×10⁴，24.363)、(3.820×10³，27.536)、(3.820×10²，31.238)、(3.820×10¹，33.841)、(3.820×10⁰，37.679)}，进行线性回归分析，得到图2所示的标准曲线和图3的扩增曲线，且扩增效率为98.3％，线性回归系数为0.997，该标准曲线方程为：

Ct＝-3.363logx+39.584  (式4)

(2)检测步骤一所得的cDNA的Ct值：将12.5μL的2×SYBR Mix、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在实时定量PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：

①95℃预变性1min；

②扩增循环40次：每次循环的反应条件为：95℃，30s；58℃，30s；72℃，60s；80.5℃，15s；其中80.5℃为读板温度；

③从65℃以0.5℃/s的速率升温至95℃，在此期间每上升0.5℃读板一次，进行熔解曲线测定；

测得Ct值Ct₀：为36.241；

(3)将Ct₀代入(式4)计算待检测水样中CVA16的初始模板量x₀为9.863×10⁰copies，利用(式3)求得待检测水样中CVA16病毒的含量C₁(copies/mL)为1.691×10²copies/mL。

发明人对本申请中的定量PCR检测方法的精密度进行了验证，选取已知浓度样品的cDNA(标准品)，在同一批次内进行6次实时荧光定量PCR检测，计算Ct值的组内变异系数；然后分6批对所选样品进行6次检测，计算Ct的组间变异系数。表2为检测的组内变异系数和组间变异系数，样品Ct值的组内变异系数均低于1.5％，组间变异系数均低于3％，表明本方法具有较高的精密度。

表2 定量PCR检测方法的组内和组间变异系数

Claims (1)

1.一种环境水体中CVA16病毒的检测方法，其特征在于，方法按下述步骤进行：

步骤一，样品处理：

(1)病毒浓缩：首先在4℃条件下于V mL的待检测水样中加入质量百分比为8％的聚乙二醇和质量百分比为2.3％的氯化钠并混匀，接着将待检测水样在4℃条件下进行离心处理，弃上清液，用1mL超纯水重悬沉淀得到病毒浓缩液，其中50≤V≤250；

(2)RNA提取：使用RNA提取试剂盒从病毒浓缩液中提取RNA；

(3)逆转录：将5μL的RNA、2μL的5×gDNA Eraser Buffer、1μL的5×gDNA Eraser Buffer和2μL的RNase Free dH₂O在42℃条件下反应2min得到反应液，将该反应液与4μL的Buffer、1μL的RT Enzyme Mix、1μL的RT Primer Mix和4μL的RNase Free dH₂O混合进行反应：先在37℃条件下反应15min；接着在85℃条件下反应5s，得到cDNA；

步骤二，定性检测

(1)将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的ExTaq、400nM的上游引物CVA16-F1、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；PCR反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次，每轮循环的反应条件依次为：95℃，30s、56℃，30s、72℃，60s；

③在72℃延伸5min，反应产物为PCR产物一；

其中：

上游引物CVA16-F1的核苷酸序列为：

5’-TGGGAYATTGAYTTGATGGG-3’；

下游引物CVA16-R的核苷酸序列为：

5’-GACATGAAGGGKACTGACACTTG-3’；

(2)将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的Ex Taq、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和0.2μL PCR产物一混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次，每轮循环的反应条件依次为：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s；

③在72℃延伸5min，扩增产物为PCR产物二；

其中：上游引物CVA16-F2的核苷酸序列为：

5’-CAAACCRAAYGGTGAGYTAGT-3’；

(3)将所得的PCR产物二用含体积浓度2％Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照，并将电泳条带切割胶纯化回收，得胶纯化回收产物；

(4)采用双脱氧终止法对所得胶纯化回收产物进行核苷酸序列测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度大于70％时，待检测水样中存在CVA16，继续依次进行后续步骤三和步骤四，否则，待检测水样中不存在CVA16；

步骤三，标准品制备：

(1)第一轮PCR扩增：以步骤一获得的cDNA为模板，利用上游引物 CVA16-F1和下游引物CVA16-R为引物进行PCR扩增，得到第一轮扩增后的PCR产物；

(2)第二轮PCR扩增：以第一轮扩增后的PCR产物为模板，利用上游引物CVA16-F2和下游引物CVA16-R为引物进行PCR扩增，得到第二轮扩增后的PCR产物；

(3)将所得的第二轮扩增后的PCR产物用含体积浓度为2％的Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照确认目的条带，之后切割目的条带并纯化回收，得到目的片段回收产物，该目的片段回收产物的长度为mbp；

(4)将目的片段回收产物与pMD19-T载体连接转化至大肠杆菌DH5α中，采用蓝白斑筛选法筛选出转化进插入目的片段的载体的菌落，将阳性菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37℃条件下培养12～16小时得到菌液，接着用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒；其中LB液体培养基中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL；

(5)采用双脱氧终止法对得到的质粒的核苷酸序列进行测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，

当所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度大于等于90％时，提取的质粒为标准品，

当所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度小于90％时，重复步骤(4)和步骤(5)，直至提取的质粒为标准品；

(6)采用微量紫外分光光度计法检测标准品的OD₂₆₀值n；

(7)利用式1计算标准品浓度C copies/μL：

    式1

式1中：

2962为pMD19-T载体的长度，bp；

1OD₂₆₀＝50μg/mL的双链DNA；

330为1碱基的分子量，g/mol；

6.02×10²³为阿伏伽德罗常数，NA；

步骤四，定量检测

(1)将步骤三得到的标准品依次稀释至c×10^-4copies/μL、c×10^-5copies/μL、c×10^-6copies/μL、c×10^-7copies/μL、c×10^-8copies/μL、c×10^-9copies/μL和c×10^-10copies/μL七个浓度梯度；利用实时荧光定量PCR分别检测各浓度梯度样品的Ct值和初始模版量x copies，接着利用测得的七组Ct-x进行线性回归分析，得到标准曲线方程：

Ct＝a logx+b    式2

式2中：a和b为标准曲线方程的系数；

(2)采用实时荧光定量PCR检测步骤一所获得的cDNA的Ct值：Ct₀；具体过程如下：将12.5μL的2×SYBR Mix、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在实时定量PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：

①95℃预变性1min；

②扩增循环40次，每次循环的反应条件依次为：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s、80.5℃，15s；其中80.5℃为读板温度；

③从65℃以0.5℃/s的速率升温至95℃，在此期间每上升0.5℃读板一次，进行熔解曲线测定；

(3)将Ct₀代入式2计算待检测水样中CVA16病毒的初始模板量x₀；待检测水样中CVA16病毒的含量C₁copies/mL为：

    式3。