CN1286988C - 一种定量pcr检测试剂盒及用于检测副溶血性弧菌的方法 - Google Patents

Abstract

涉及一种荧光定量PCR试剂盒以及用于检测副溶血性弧菌的方法，该试剂盒由PCR反应液管、样本处理液管、阳性对照管、阴性对照管、标准品管、Taq DNA聚合酶管和去离子水管组成，该试剂盒用于副溶血性弧菌的适时、定量检测的步骤是，先采集和处理待测标本再进行加样、分子信标实时定量PCR检测，根据阴性对照和阳性对照的CT值以及检测样本CT值来判断检测样本为阳性还是阴性，然后记录各样本的荧光值和CT值，并从计算机上获取标准曲线，计算各样本中的副溶血性弧菌拷贝数。本发明具有闭管操作，避免假阳性，反应与杂交同步进行，检测时间短的显著效果。

Description

一种定量PCR检测试剂盒及用于检测副溶血性弧菌的方法

所属技术领域

本发明涉及微生物的测量的组合物，具体地说是涉及一种荧光定量PCR试剂盒以及用于检测副溶血性弧菌的方法。

技术背景

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种嗜盐性细菌，属弧菌科(Vibrio)弧菌属，易引起食物中毒。副溶血弧菌产生的耐热直接溶血毒素(TDH)是重要致病因子，特异基因tdh是副溶血弧菌引起食物中毒的主要因子。

目前，我国副溶血性弧菌常规检测方法有神奈川现象(Kanagawa phenomenon，KP)试验、生化鉴定、血清学反应、核酸杂交等技术，但这些试验或方法需经过增菌培养，存在操作繁琐、所需时间长(约4天)等不足。

随着微生物基因组学的发展，近年来又出现了一种定量PCR技术，该技术是一种体外基因扩增技术。本领域内普通技术人员都知道，根据副溶血弧菌的特异基因tdh序列，设计引物，是可进行副溶血弧菌的PCR检测的。但是直接使用常规的PCR检测试剂盒来检测副溶血性弧菌，尚存在下列难以解决的技术问题：1、常规的PCR检测试剂盒的反应管内不含有分子信标探针，必须“开盖操作”将PCR产物转移，进行琼脂糖电泳或Southern转移杂交等实验对PCR产物进行鉴定，容易污染，造成假阳性，而且耗费时间(4～5小时)，国家卫生部已限制其在临床上使用；2、常规的PCR检测试剂盒不含有标准品，不能对副溶血性弧菌进行定量捡测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是改良PCR检测试剂盒，以便用于检测副溶血性弧菌。

本发明解决上述问题的技术解决方案是：

一种定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下试管组成：

(1)PCR反应管：管内反应液由以下体积份组分制成：10×Buffer缓冲液4～6份、25mM MgCl₂溶液2～4份、1.25mMdNTP溶液4～8份、序列为5’-TGGCTGACATCCTACATGAC-3’的50μM上游引物0.2～1.0份、序列为5’-TCTTCACCAACAAAGTTAGC-3’的50μM下游引物0.2～1.0份、序列为5’-FAM-CGAGCGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGGCTCG-DABCYL-3’的50μM环形分子信标探针0.2～1.0份、去离子水25～30份；

(2)样本处理液管：管内处理液由以下体积份组分制成：0.5mol/LEDTA(PH8.0)8～12份、1％SDS200～300份、20mg/ml蛋白酶K5～8份和蒸馏水200～250份；

(3)阳性对照管：管内试剂为以下插入序列的重组阳性质粒DNA：

GGTCAATGTA GAGGTCTCTG ACTTTTGGAC AAACCGTAAT GTAAAAAGAA AACCGTACAA

AGATGTTTAT GGTCAATCAG TATTCACAAC GTCAGGTACT AAATGGCTGA CATCCTACAT

GACTGTGAAC ATTAATGATA AAGACTATAC AATGGCAGCG GTGTCTGGCT ATAAGCACGG

TCATTCTGCT GTGTTCGTAA AATCAGATCA AGTACAGCTT CAACATTCCT ATGATTCTGT

AGCTAACTTT GTTGGTGAAG ATGAAGATTC TATTCCAAGT AAAATGTATT TGGATGAAAC

TCCAGAATAT TTTGTTAATG TAGAAGCATA TGAGAGTGGT AGTGG

(4)阴性对照管：管内试剂为重组阴性质粒DNA；

(5)标准品管：管内试剂分别为10⁷、10⁶、10⁵copy/ml的重组阳性质粒DNA各一支；

(6)聚合酶管：管内试剂为5U/μl Taq DNA聚合酶管；

(7)去离子水管：管内试剂为去离子水；

上述定量PCR检测试剂盒用于检测副溶血性弧菌的方法，依序由以下步骤组成：

(1)待测样本的采集和处理：实验室内取包括副溶血性弧菌、沙门菌、大肠杆菌等15种细菌的肉汤培养物50μl，作为样本。或临床(现场)将相关海产品20克或者加入碱性蛋白胨过夜培养后匀浆，用PBS按1∶1重量比混匀，800rpm，离心1分钟，取上清1200rpm离心5分钟，弃上清，用200μl PBS液悬浮，作为样本。

待处理液完全解冻后，取50μl加入0.5ml离心管内，再加入待测样本50μl，混匀，37℃放置10分钟，然后100℃煮沸10分钟，12000rpm离心10秒，上清液作为扩增模板。此模板2～8℃可保存一周，-18℃可保存一个月。阴性对照和阳性对照无需处理，直接取5μl上机扩增。

(2)加样：先取DNA聚合酶0.5μl加入反应液管内(DNA聚合酶及反应液管用前需10000rpm离心10秒)，然后取处理后的样本上清液、阴性对照、阳性对照和标准品(加前需混匀)各5μl分别加入反应液管内，混匀后10000rpm离心10秒上机扩增。

(3)PCR扩增和实时荧光检测：扩增程序为94℃预变性3分钟，循环条件为94℃30秒、55℃40秒、72℃55秒，共40个循环，最后72℃延伸3分钟(同时设空白对照一管，空白对照只需在反应液管内加去离于水5μl混匀后10000rpm离心10秒上机扩增)。

(4)结果判断：阴性对照的CT值应不出现数值；阳性对照的CT值应≤30；如不能满足上述条件则此实验为无效。检测样本CT值≤33时判断为阳性；检测样本CT值＞33或无数值时判断为阴性。

(5)定量分析：记录各样本的荧光值、CT值，并从计算机上获取标准曲线，计算各样本中的副溶血性弧酶拷贝数。

本发明所述的定量PCR检测试剂盒用于检测副溶血性弧菌的方法是在PCR反应体系中加入标记有报告基团(fluorophore)和淬灭基团(quencher)的茎环型荧光分子信标探针，在基因扩增过程中，PCR产物与探针杂交，根据能量共振转移现象(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，报告基团和猝灭基团分开，报告基团发出荧光而被检测，由于采用分子信标探针对PCR产物同时进行杂交检测，可以闭管检测，克服了常规PCR产物污染和假阳性的技术问题，茎环型荧光分子信标探针的使用使检测的特异性更好；同时还能对副溶血性弧菌进行实时定量捡测，是病原微生物基因检测技术的发展方向。

附图说明

图1为副溶血性弧菌标准品分子信标实时定量PCR检测荧光强度和循环次数的对应关系图

图2为副溶血性弧菌标准品拷贝数对数值和循环次数的标准曲线图

图3为采用本试剂盒对15种细菌进行的分子信标实时定量PCR检测结果图

图1、图2和图3均采用ABI Prism7000荧光定量PCR仪及其配套软件自动获得。从图1和图2所示结果可以看出不同浓度梯度的标准品的CT值理想，线形相关系数r为0.99以上；从图3所示结果可以看出2株副溶血性弧菌和标准品的CT值≤30，判断为阳性，余下细菌和阴性对照CT值＞33或无数值，判断为阴性。

具体实施方式

例1

所述的定量PCR检测试剂盒由以下7管组成：

(1)PCR反应管  管内反应液由下列组分组成：10×Buffer缓冲液5μl、25mM MgCl₂溶液3μl、1.25mMdNTP溶液8μl、50μM上游引物0.5μl、50μM下游引物0.5μl、50μM环形分子信标探针0.5μl和去离子水27μl；

(2)样本处理液管  管内处理液由下列组分组成：0.5mol/LEDTA(PH8.0)0.01ml、1％SDS0.25ml、20mg/ml蛋白酶K5μl和蒸馏水0.235ml；

(3)阳性对照管  内含有如下插入序列的重组阳性质粒DNA100μl；

(4)阴性对照管  内含重组阴性质粒DNA100μl；

(5)标准品管  3支，分别含10⁷、10⁶、10⁵copy/ml的重组阳性质粒DNA100μl；

(6)聚合酶管  5U/μl Taq DNA聚合酶管10μl；

(7)去离子水管  内含去离子水100μl；

上述定量PCR检测试剂盒的生产过程和制备方法如下：

第一步 特异性基因引物和探针的设计和合成

根据GenBank上公布的副溶血性弧菌tdh基因序列，采用Primer软件设计4条PCR引物和1组分子信标探针，并在分子信标探针的5’端标记FAM，3’端标记DABCYL，引物和荧光探针由上海博亚生物技术有限公司合成。

第二步 PCR反应液各组成的配制和分装

将现有的或配制好的10×Buffer缓冲液5μl、25mM MgCl₂溶液3μl、1.25mMdNTP溶液8μl、50μM上游引物0.5μl、50μM下游引物0.5μl、50μM环形分子信标探针0.5μl和去离子水27μl依次加入到0.2ml的PCR反应管内，并做好标记。

第三步 样本处理液的配制和分装

将配制好的0.5mol/L EDTA(PH8.0)0.01ml、1％SDS0.25ml、20mg/ml蛋白酶K5μl和蒸馏水0.235ml加到样本处理液管内。

第四步 标准品、阳性对照和阴性对照的构建、纯化和分装

按常规方法用标准品引物进行副溶血性弧菌的PCR扩增，PCR反应条件为94℃预变性5分钟，每个循环包括：94℃变性30秒、55℃退火45秒、72℃延伸50秒，共40个循环，循环结束后72℃延伸5分钟。PCR产物大小为345bp。

PCR产物经北京赛百盛基因有限公司提供的纯化试剂盒纯化，克隆到pGEM-T载体，转化到Top10感受态细胞，在含Amp+/IPTG/X-gal的平板上涂抹，培养12～16小时，挑白斑，增殖，提质粒，PCR鉴定后制备阳性标准品。

具体步骤如下：

1.根据Promega公司的pGEM-T载体克隆系统试剂盒操作要求，在0.5ml离心管中加入2×Buffer5μl、pGEM-T载体1μl、T4连接酶1μl、PCR纯化产物3μl，用移液枪轻轻吹吸混匀，4℃过夜。

2.取2μl连接产物至1.5ml离心管中，加入50μl刚融化的感受态细胞，轻轻混匀，冰浴20分钟。

3.42℃水浴槽中热休克45～50秒，禁止摇动，然后迅速冰浴2分钟。

4.加入950μl LB肉汤培养基，混匀，37℃150rpm摇床1.5小时。

5.倒含100μg/μl氨苄西林LB培养基平板，待凝固后，每个平板加入20μl X-gal(20μg/μl)、10μl IPTG(200μg/μl)，然后取100μl转化液铺板，用高压过的涂抹棒均匀涂抹，待稍干燥时，倒放37℃恒温孵箱过夜培养，转化成功则出现白斑菌落。

6.从平板中挑取单一白班菌落接种到5ml含有氨苄西林(100μg/μl)的LB肉汤的试管中，37℃150rpm摇床，进行单克隆扩大培养，至出现白色絮状物。

7.重组质粒的提取和纯化按北京鼎国生物技术有限公司提供的质粒快速提取试剂盒的说明书操作。纯化的质粒用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并同时进行PCR鉴定，即可制备重组阳性质粒DNA标准品。

8.将该重组质粒稀释10倍，用M75-B型紫外分光光度计测定重组质粒的吸光度，OD₂₆₀＝0.072，OD₂₈₀＝0.039，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.85，根据重组质粒浓度＝OD₂₆₀×稀释倍数×50，可以计算标准品重组质粒浓度为36μg/ml，再根据质粒分子量＝(3000+345)×324.5g/mol＝1085453g/mol和每摩尔样品中含有6.02×10²³个拷贝数，得到每毫升重组质粒的拷贝数等于1.997×10¹³。将阳性质粒按10倍比稀释成3套不同拷贝数的模板，每管分装100μl。

重组阳性质粒DNA作为阳性对照，重组阴性质粒作为阴性对照，每管分装100μl。

第五步 Taq DNA聚合酶和去离子水的分装

将5U/μl Taq DNA聚合酶10μl分装到聚合酶管内；去离子水分装到去离子水管内。

第六步 将上述五步的7组管子连同试剂盒操作使用说明书1份，按要求放入试剂包装盒，置于-20℃保存，加冰块置于泡沫箱内运输。

上述定量PCR检测试剂盒用于检测副溶血性弧菌的方法为：

(1)待测样本的采集和处理：实验室内取包括副溶血性弧菌、沙门菌、大肠杆菌等15种细菌的肉汤培养物50μl，作为样本。或临床(现场)将相关海产品20克或者加入碱性蛋白胨过夜培养后匀浆，用PBS按1∶1重量比混匀，800rpm，离心1分钟，取上清1200rpm离心5分钟，弃上清，用200μl PBS液悬浮，作为样本。

待处理液完全解冻后，取50μl加入0.5ml离心管内，再加入待测样本50μl，混匀，37℃放置10分钟，然后100℃煮沸10分钟，12000rpm离心10秒，上清液作为扩增模板。此模板2～8℃可保存一周，-18℃可保存一个月。阴性对照和阳性对照无需处理，直接取5μl上机扩增。

(2)加样：先取DNA聚合酶0.5μl加入反应液管内(DNA聚合酶及反应液管用前需10000rpm离心10秒)，然后取处理后的样本上清液、阴性对照、阳性对照和标准品(加前需混匀)各5μl分别加入反应液管内，混匀后10000rpm离心10秒上机扩增。

(3)PCR扩增和实时荧光检测：扩增程序为94℃预变性3分钟，循环条件为94℃30秒、55℃40秒、72℃55秒，共40个循环，最后72℃延伸3分钟(同时设空白对照一管：空白对照只需在反应液管内加去离子水3μl混匀后10000rpm离心10秒上机扩增)。

(4)结果判断：阴性对照的CT值应不出现数值，阳性对照的CT值应≤30，如不能满足上述条件则此实验为无效。检测样本CT值≤33时判断为阳性；检测样本CT值＞33或无数值时判断为阴性。

(5)定量分析：记录各样本的荧光值、CT值，并从计算机上获取标准曲线，计算各样本中的副溶血性弧菌拷贝数。

例2：

所述的定量PCR检测试剂盒中阳性对照管、阴性对照管、标准品管、聚合酶管和去离子水管的管内所含组分均与例1相同，每管的含量要视试剂盒的规格而定，即做多少人份而定。例1所述的定量PCR检测试剂盒是按20人份设计的，本实施和下述实施例都可按其类推(本领域普通技术人员应知的常识)。所述的PCR反应管的管内反应液由下列组分组成：10×Buffer缓冲液4μl、25mM MgCl₂溶液2μl、1.25mMdNTP溶液4μl、50μM上游引物0.2μl、50μM下游引物0.2μl、50μM环形分子信标探针0.2μl和去离子水34.4μl；所述的样本处理液管的管内处理液由下列组分组成：0.5mol/LEDTA(PH8.0)0.008ml、1％SDS0.20ml、20mg/ml蛋白酶K5μl和蒸馏水0.200ml。

上述定量PCR检测试剂盒的生产过程和制备方法参照例1实施即可。

由于本发明所述的试剂盒是对常规的定量PCR检测试剂盒的一种改良，因此，该试剂盒用于检测副溶血性弧菌的方法，本领域内普通技术人员受例1的启示完全可独立完成，无需赘述。

例3：

所述的定量PCR检测试剂盒中阳性对照管、阴性对照管、标准品管、聚合酶管和去离子水管的管内所含组分及含量均与例1相同。所述的PCR反应管的管内反应液由下列组分组成：10×Buffer缓冲液6μl、25mM MgCl₂溶液4μl、1.25mMdNTP溶液8μl、50μM上游引物1.0μl、50μM下游引物1.0μl、50μM环形分子信标探针1.0μl和去离子水24μl；所述的样本处理液管的管内处理液由下列组分组成：0.5mol/LEDTA(PH8.0)0.012ml、1％SDS0.30ml、20mg/ml蛋白酶K8μl和蒸馏水0.250ml；

所述的定量PCR检测试剂盒的制备以及用于检测副溶血性弧菌的方法参照例1实施即可。

Claims (2)

1.一种定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下试管组成：

(1)PCR反应管：管内反应液由以下体积份组分制成：10×Buffer缓冲液4～6份、25mM MgCl₂溶液2～4份1.25mMdNTP溶液4～8份、序列为5’-TGGCTGACATCCTACATGAC-3’的50μM上游引物0.2～1.0份、序列为5’-TCTTCACCAACAAAGTTAGC-3’的50μM下游引物0.2～1.0份、序列为5’-FAM-CGAGCGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGGCTCG-DABCYL-3’的50μM环形分子信标探针0.2～1.0份、去离子水25～30份；

(2)样本处理液管：管内处理液由以下体积份组分制成：0.5mol/LEDTA8～12份、1％SDS200～300份、20mg/ml蛋白酶K 5～8份和蒸馏水200～250份；

（3)阳性对照管：管内试剂为以下插入序列的重组阳性质粒DNA：

ggtcaatgta gaggtctctg acttttggac aaaccgtaat gtaaaaagaa aaccgtacaa 60

agatgtttat ggtcaatcag tattcacaac gtcaggtact aaatggctga catcctacat 120

gactgtgaac attaatgata aagactatac aatggcagcg gtgtctggct ataagcacgg 180

tcattctgct gtgttcgtaa aatcagatca agtacagctt caacattcct atgattctgt 240

agctaacttt gttggtgaag atgaagattc tattccaagt aaaatgtatt tggatgaaac 300

tccagaatat tttgttaatg tagaagcata tgagagtggt agtgg 345

(4)阴性对照管：管内试剂为重组阴性质粒DNA；

(5)标准品管：管内试剂分别为10⁷、10⁶、10⁵copy/ml的重组阳性质粒DNA各一支；

(6)聚合酶管：管内试剂为5U/μl Taq DNA聚合酶管；

(7)去离子水管：管内试剂为去离子水。

2.权利要求1所限定的定量PCR检测试剂盒用于检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于该方法依序由以下步骤组成：

(1)待测标本的采集和处理：取标本20克或者加入碱性蛋白胨过夜培养后匀浆，用PBS按1∶1重量比混匀，800rpm，离心1分钟，取上清1200rpm离心5分钟，弃上清，用200μl PBS液悬浮，作为样本；取处理液50μl加入0.5ml离心管内，再加入待测样本50μl，混匀，37℃放置10分钟，然后100℃煮沸10分钟，12 000rpm离心10秒，上清液作为扩增模板；

(2)加样：先取DNA聚合酶0.5μl加入反应液管内，然后取扩增模板、阴性对照、阳性对照和标准品各5μl分别加入反应液管内，混匀后10 000rpm离心10秒上机扩增；

(3)PCR扩增和实时荧光检测：PCR程序为94℃预变性3分钟，循环条件为94℃30秒、55℃40秒、72℃55秒，共40个循环，最后72℃延伸3分钟，扩增和荧光检测同时进行；

(4)结果判断：阴性对照的CT值应不出现数值，阳性对照的CT值应≤30，如不能满足上述条件则此实验为无效；检测样本CT值≤33时判断为阳性，检测样本CT值＞33或无数值时判断为阴性；

(5)定量分析：记录各样本的荧光值和CT值，并从计算机上获取标准曲线，计算各样本中的副溶血性弧菌拷贝数。

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