CN102477463A - 一种检测活的非可培养状态副溶血性弧菌的方法 - Google Patents

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郝小斌
鲁艳莉
赵德畅
张晓艳
季爱加
陈婵娟
张祈
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Abstract

本发明涉及一种检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌的方法，包括步骤：以抽提自所述样品的总RNA为模板，用rpoS基因的特异性引物对进行逆转录聚合酶链反应，从而扩增出对应于rpoS基因的扩增产物；检测所述的对应于rpoS基因的扩增产物的存在与否，如存在所述扩增产物则表示样品中存在VBNC状态的副溶血性弧菌；如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在VBNC状态的副溶血性弧菌。该方法可以检测普通方法检测不到的VBNC状态细菌；相对于传统检测VBNC状态细菌的方法该方法速度快，其准确性和可信度高，具有很高的特异性和敏感性。

Description

一种检测活的非可培养状态副溶血性弧菌的方法
技术领域
本发明涉及致病性微生物副溶血性弧菌检测领域，特别是涉及一种检测活的非可培养状态副溶血性弧菌的方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称V.p)是广泛分布于近海区域、盐湖及海产品中的革兰氏阴性短杆嗜盐菌，能感染海水鱼类、对虾、蟹、甲壳类等多种水产动物，人食用了受该菌污染的海产品后，会出现食物中毒及腹泻等症状，是一种引起食源性疾病的重要病原菌。20世纪80年代初期，研究人员发现并提出了细菌“活的非可培养状态”(Viable butNon-Culturablestate，VBNC)，即细菌处于不良环境条件时，其细胞缩小成球形，用常规方法不能培养，但具有一定的代谢活性，用特殊方法可以证明其依然存在。当细菌处于VBNC状态时，经过一定的条件恢复后即可以复苏，经研究部分复苏菌株的毒力基因并未遭到破坏，故VBNC状态细菌对人类公共健康、食品的微生物检验、遗传工程细菌向环境释放等安全性问题仍然有潜在致病性，研究该状态及其检测方法有着重要的意义。
随着周围环境的改变副溶血性弧菌会转化为VBNC状态，由于在VBNC状态下这些细菌用常规方法(如传统的微生物培养基培养、普通PCR验证等)不可检出但仍保持活力，故经典活菌直接计数法(Direct viable count，DVC)、检测细胞内CTC水解情况判断代谢活性、检测细胞中INT的减少判断代谢活性、ELISA等方法已广泛应用于细菌VBNC的研究，但是其准确性、精密性以及时效性还有待提升。在确定微生物检测标准时，之前大多数研究为通过普通PCR验证可培养状态(Viable Culturable，VC)致病基因的活性，然而这对于VBNC状态显然是不合适的。
近些年逆转录聚合酶链反应技术(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)检测mRNA是一项很有前途的技术被应用于细菌的VBNC状态，用于评估VBNC状态细菌产生的影响。细菌mRNA的半衰期很短，这是由于核酸酶的存在会使其降解，所以mRNA的存在可以作为细胞存活最有力的也是最令人信服的判断标准。但是该方法却并未在副溶血性弧菌中应用，究其原因，及其可能是由于细菌处于VBNC状态其特异性管家基因不好确认引起。
由于RT-PCR法具有很高的特异性和敏感性，而且这项技术能够使我们确定细胞是否存活。虽然说其它方法的检测参数像蛋白质的合成能力，不可分裂细胞的延长指数等似乎同样有效，但比起RT-PCR法，这些方法不如其可靠且不能够很标准化的实际应用。因此RT-PCR技术作为一种分析基因表达的快速灵敏的方法在检测细菌VBNC状态已经显示出其重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、准确检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌以及一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
主要运用RT-PCR对副溶血性弧菌VBNC状态的rpoS基因进行检测。其中，特异性管家基因rpoS主要编码一种转录因子，该转录因子命名为sigmaS(σS)，主要调控细菌中的应激反应机制，被用来检测VBNC状态的副溶血性弧菌的活性，而副溶血性弧菌tl特异性基因则在VBNC状态则运用PCR/RT-PCR无法检出。
本发明第一方面，一种检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌的方法，包括步骤：
以抽提自所述样品的总RNA为模板，用rpoS基因的特异性引物对进行逆转录聚合酶链反应，从而扩增出对应于rpoS基因的扩增产物；
检测所述的对应于rpoS基因的扩增产物的存在与否，如存在所述扩增产物则表示样品中存在VBNC状态的副溶血性弧菌(副溶血性弧菌VBNC状态中该特异性管家基因rpoS运用PCR法检测无活性)；如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在VBNC状态的副溶血性弧菌。
其中所述的样品是经tl基因检测呈阴性的样品。
所述的样品可以是水产品。所述的水产品包括：海水鱼类、对虾、蟹、甲壳类等多种水产动物。
所述的特异性管家基因引物rpoS对选自下组：
上游5’-gac aat gcg tca gag acg-3’SEQ ID NO：1；
下游5’-tca cca cgc aat gct ctg-3’SEQ ID NO：2。
本发明另一方面，一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法，包括步骤：
(a)检测所述样品中是否存在tl异性基因；如若有tl特异性基因存在则说明副溶血性弧菌存在，如若无tl特异性基因存在则需继续检测VBNC的副溶血性弧菌活性；
(b)对于经tl基因检测呈阴性的样品，进一步检测是否存在rpoS基因：以抽提自所述样品的总RNA为模板，用rpoS基因的特异性引物对进行逆转录聚合酶链反应，从而扩增出对应于rpoS基因的扩增产物；
检测所述的对应于rpoS基因的扩增产物的存在与否，如存在所述扩增产物则表示样品中存在VBNC状态的副溶血性弧菌；如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在VBNC状态的副溶血性弧菌。
所述的样品可以是水产品。所述的水产品包括：海水鱼类、对虾、蟹、甲壳类等多种水产动物。
所述的特异性管家基因引物rpoS对选自下组：
上游5’-gac aat gcg tca gag acg-3’SEQ ID NO：1；
下游5’-tca cca cgc aat gct ctg-3’SEQ ID NO：2。
该检测方法的建立将为副溶血性弧菌VBNC的研究和食品安全检测与控制提供一定的依据。
相较于其他方法，该方法优点很明显：
首先，可以检测普通方法检测不到的VBNC状态细菌。
其次，相对于传统检测VBNC状态细菌的方法该方法速度快，并且从基因水平进行检测，其准确性和可信度高。
再次，本发明将副溶血性弧菌特异性管家基因rpoS引入检测方法，国内尚未应用，这对于该方法的建立起了决定性作用，使该方法具有很高的特异性和敏感性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
图1为样品(a、b)tl特异性基因检测结果。各泳道分别是M：DNAmarker(从下至上：100，200，300，400，500，600bp)；1：阳性对照V.p1.1616(+)；2：阳性对照V.p1.1997(+)；3：空白对照(-)；4：样品a1；5：样品a2；6：样品a3；7：样品b1；8：样品b2；9：样品b3。
图2为样品b特异性管家基因rpoS检测结果。各泳道分别是M：DNAmarker(从下至上：100，200，300，400，500，600bp)；1：阳性对照V.p1.1616(+)；2：阳性对照V.p1.1997(+)；3：空白对照(-)；4：样品b1；5：样品b2；6：样品b3。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实施例，进一步阐述本发明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
A.将待测水产品a，b分别运用PCR方法检测副溶血性弧菌tl特异性基因，
tl特异性基因：上游引物：5’-aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg-3’SEQ ID NO：3
下游引物：5’-gct act ttc tag cat ttt ctc tgc-3’SEQ ID NO：4
实验结果(如图1)表明a样品中有tl特异性基因存在，说明副溶血性弧菌存在，产品不合格；b样品中无tl特异性基因存在，需继续检测VBNC的副溶血性弧菌活性。
注：1.副溶血性弧菌V.p1.1616、V.p1.1997均为标准菌株，来源于中科学院普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。2.副溶血性弧菌V.p1.1616、V.p1.1997均含有tl特异性基因，其片段为450bp。
B.运用Trizol法提取b样品中副溶血性弧菌的总RNA。用无菌注射器取1mL处理好的待测液，加1mL TRNzol Total RNA Regent，吹吸混匀，室温放置7min。加200μL氯仿异戊醇(24∶1)，盖紧盖子剧烈震荡颠倒混匀片刻。室温下静置5min，4℃10000r/min离心15min。然后转移上层水相(大约0.5mL)于新的1.5mL的离心管中(切记不要吸出中间白色层中的蛋白)。加入等体积的异丙醇(预冷)室温静止沉淀10min，4℃12000r/min离心10min。弃上清，缓慢的沿离心管壁加入1mL75％的乙醇(0.1％DEPC水配制)洗涤RNA沉淀，4℃7500r/min离心5min。弃上清，在生物安全柜中倒置干燥5min～10min(不可以使其完全干燥，预防其溶解性降低)。用20μL0.1％的DEPC水溶解，如果RNA较难溶解则可于55℃～60℃助溶10min，于-80℃冻存备用。
C.运用副溶血性弧菌特异性管家基因rpoS，其基因片段的引物设计为：
上游5’-gac aat gcg tca gag acg-3’SEQ ID NO：1
下游5’-tca cca cgc aat gct ctg-3’SEQ ID NO：2
应用RT-PCR技术检测总RNA中是否有副溶血性弧菌特异性管家基因rpoS存在(两步法)：
(1)反转录合成cDNA第一链：首先在反转录之前70℃温育RNA 10min，然后冰浴5min，以消除RNA的二级结构。在20μl反转录反应体系中按照顺序依次加入1～4步后70℃水浴5min，迅速冰上冷却10min，稍加离心，然后按5～8步加入试剂后42℃水浴60min，-20℃保存备用(如表1所示)。
表1RNA反转录体系
Figure BSA00000363282500061
(2)RT-PCR法扩增：引物设计和PCR扩增条件如表2所示，运用PCR扩增试剂盒将上述反转录产物进行PCR扩增，反应后取4μLPCR产物与6×LoadingBuffer混合于1.7％琼脂糖凝胶上进行电泳，并于EB染色观察结果。
表2RT-PCR引物设定及其条件
Figure BSA00000363282500062
实验结果(如图2)表明b样品中存在所述扩增产物，表示样品中存在VBNC状态的副溶血性弧菌。
注：1.副溶血性弧菌V.p1.1616、V.p1.1997均为标准菌株，来源于国家菌种保藏中心(CGMCC)。2.副溶血性弧菌V.p1.1616、V.p1.1997均含有特异性管家基因rpoS，其片段为203bp。
上述实验中所用的UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒、TAE、焦碳酸二乙酯(DEPC)及所用引物等均购于上海生物工程技术服务有限公司；TRNzol Total RNA Reagent、DNA Maker I、购于天根生化科技(北京)有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、RibonucleaseInhibitor购于TaKaRa公司；琼脂糖购于加拿大Bio Basic INC公司；EB购于上海华舜生物工程有限公司；异丙醇(AR)、无水乙醇(AR)、氯仿(AR)、异戊醇(AR)等购于国药集团化学试剂有限公司。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Figure ISA00000363282700011
Figure ISA00000363282700021

Claims (9)

1.一种检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括步骤：
以抽提自所述样品的总RNA为模板，用rpoS基因的特异性引物对进行逆转录聚合酶链反应，从而扩增出对应于rpoS基因的扩增产物；
检测所述的对应于rpoS基因的扩增产物的存在与否，如存在所述扩增产物则表示样品中存在VBNC状态的副溶血性弧菌；如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在VBNC状态的副溶血性弧菌。
2.如权利要求1所述的一种检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的样品是经tl基因检测呈阴性的样品。
3.如权利要求1所述的一种检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的样品是水产品。
4.如权利要求3所述的一种检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的水产品为：海水鱼类、对虾、蟹或甲壳类。
5.如权利要求1所述的一种检测样品中是否存在活的非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的特异性引物对选自下组：
上游5’-gac aat gcg tca gag acg-3’SEQ ID NO：1；
下游5’-tca cca cgc aat gct ctg-3’SEQ ID NO：2。
6.一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)检测所述样品中是否存在tl特异性基因；如若有tl特异性基因存在则说明副溶血性弧菌存在，如若无tl特异性基因存在则需继续检测VBNC的副溶血性弧菌活性；
(b)对于经tl基因检测呈阴性的样品，进一步检测是否存在rpoS基因：以抽提自所述样品的总RNA为模板，用rpoS基因的特异性引物对进行逆转录聚合酶链反应，从而扩增出对应于rpoS基因的扩增产物；
检测所述的对应于rpoS基因的扩增产物的存在与否，如存在所述扩增产物则表示样品中存在VBNC状态的副溶血性弧菌；如不存在所述扩增产物则表示样品中不存在VBNC状态的副溶血性弧菌。
7.如权利要求6所述的一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的样品是水产品。
8.如权利要求7所述的一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的水产品为：海水鱼类、对虾、蟹或甲壳类。
9.如权利要求6所述的一种检测样品中是否存在副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的特异性引物对选自下组：
上游5’-gac aat gcg tca gag acg-3’SEQ ID NO：1；
下游5’-tca cca cgc aat gct ctg-3’SEQ ID NO：2。
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