CN102181572B - 一种利用rna恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，试剂盒包含TB稀释液、TB反应液、TB检测液、SAT酶液、TB阳性对照、TB阴性对照；结核分枝杆菌经液化处理后通过加药培养和不加药培养，利用两种方法培养后的结核分枝杆菌之间存在的差异，利用免疫共沉淀或NaOH再处理两种培养后的结核分枝杆菌菌液，并对处理后的菌液进行SAT检测，根据检测结果来分析结核分枝杆菌的耐药性。本发明能简单有效的对结核分枝杆菌耐药性进行分析，简便，省时。

Description

一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及核分枝杆菌TB体外分子生物法检测领域，特别是涉及一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌(M.Tuberculosis，TB)是人及动物结核病(tuberculosis)的病原菌，属于放射菌目分枝杆菌科分枝杆菌属。可以分为人型、牛型、鸟型、鼠型、冷血动物型和近年来发现的非洲型。对人类致病的主要为人型，牛型杆菌较少见，鸟类杆菌更少见，非典型分枝杆菌也可引起类似结核样病变，但少见。前三型由于发现的较早，已经在1901年伦敦国际结核病会议以后得到完全确认，被称为经典结核杆菌。对人畜威胁最大的正式经典结核杆菌。结核杆菌为细长或微弯曲的杆菌，长1～4μm，宽0.2～0.5μm，呈单个或分枝状排列，无荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状、串球状、短棒状、长丝型。牛型菌比人型菌较短而粗。禽型菌具有多型性，有时呈杆状或链球状等。结核杆菌为专性需氧菌。营养要求高，在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长。生长条件以37～37.5度、pH为6.5～6.8最适合，生长缓慢，在固体培养基上需要2～8周才出现肉眼可以看见的菌落。

目前对结核病诊断主要依靠实验室诊断与临床体症相结合。实验室诊断主要包括涂片检查、培养法、抗原抗体检测、PCR和TMA等。

1.细菌学方法

涂片镜检法：将待检测或者预处理的标本涂于玻片上，固定后进行染色，待干后进行镜检。

抗酸杆菌阴性(-)：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。

抗酸杆菌阳性：

——报告抗酸杆菌菌数：1～8条/300视野

——抗酸杆菌阳性(+)：3～9条/100视野

——抗酸杆菌阳性(++)：1～9条/10视野

——抗酸杆菌阳性(+++)：1～9条/每视野

——抗酸杆菌阳性(++++)：≥10条/每视野

痰涂片直接镜检是检测抗酸杆菌(AFB)最普遍的实验室诊断方法，特异性较高，但灵敏性较低，涂片中分枝杆菌要达到103～104CFU/ml才可检测出阳性结果，且仅能检出1/2-3/4的活动性结核患者，漏检率相当高。

培养法：取消化后的痰液混匀，用无菌吸管接种在培养基斜面，接种后斜面向上于37℃恒温培养箱内，每周观察细菌生长情况，阳性生长者经涂片萋-尼氏染色法验证后随时报告结果，培养至8周仍未见细菌生长者，报告分枝杆菌阴性。

罗氏(Jensen)培养法是目前检测MTB的“金标准”，但其检测周期长(8周)，导致无法及时确诊结核患者，并无法及时治疗。

2.免疫学方法

结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)：结核菌素通常是指旧结核菌素(OT)和结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，常用于结核病流行病学调查、结核菌感染情况监测、卡介苗接种前试验、结核病辅助诊断。MTB在体内感染主要引起细胞介导的免疫反应，一直是筛选结核分枝杆菌潜伏感染的重要方法，已被应用多年，并得到广泛的承认，虽然此方法在世界范围内应用的非常广泛，但是从灵敏度和特异性来说，它不是一个理想的检测方法。为预防结核而接种卡介苗的人群，将会对PPD产生假阳反应。

结核病的免疫学机制主要是机体对结核分枝杆菌所引起的细胞免疫反应。人体初次感染结核分枝杆菌后使T淋巴细胞致敏转化为记忆T淋巴细胞，当人体再次接触结核分枝杆菌后，机体会迅速产生效应T淋巴细胞并产生多种细胞因子发挥免疫效应，其中干扰素(IFN1)是最为关键的细胞因子。因此，检测IFN-y水平或分泌IFN-1的效应T细胞的水平就可以判断是否存在结核感染。

ELISA方法：近年来血清学方法检测结核抗体倍受国内外学者关注。结核诊断尤其是菌阴性结核病诊断仍是结核病防治中亟待研究和解决的问题。目前结核抗体仍是活动性结核病，特别是菌阴性结核病和肺外结核病诊断中的重要辅助诊断手段。由于结核患者免疫功能、遗传背景和接受的治疗不同而导致对MTB抗原识别的差异以及结核患者对抗原的识别存在阶段特异性，目前任何一个单一的抗原或商品化的组合抗原检测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的抗结核抗体，筛选MTB特异性抗原，组成联合抗原是目前血清学诊断的研究方向。

目前结核杆菌抗体的检测大部分采用ELISA方法，ELISA方法具有简单、低廉的特点，但目前许多方法还不太成熟，在特异性和灵敏度方面有待提高。随着结核分枝杆菌几种特异性抗原的发现与纯化，实验技术的不断改进，ELISA检测血清结核抗体已在国内临床实验应用，检测结核抗体有助于结核病的诊断和鉴别诊断。用ELISA检测结核分枝杆菌抗体操作简单、经济，是活动性肺结核的有效诊断方法。

3.分子生物学法

在分枝杆菌菌种鉴定、流行病学研究、基因组比较分析、耐药性监测等方面，分子生物学方法对结核病诊断和治疗起重要辅助作用，主要技术包括PCR、测序、指纹图谱、生物芯片、TMA等。

PCR：是一种根据核酸复制原理采用分子技术模拟细胞内核酸复制过程的体外扩增技术，目前已发展出了巢式或套式PCR、多重PCR、逆转录PCR、嵌合荧光PCR等多种PCR技术，PCR技术与其它分子技术相结合产生的新兴技术更是层出不穷。1989年，Hance等最先报道将PCR技术应用于TB的检测，其突出特点是灵敏度高，可以检测出1～100fg纯化的分枝杆菌DNA，相当于1～20个MTB，与传统的痰涂片抗酸染色和培养方法相比，其敏感性得到了大大提高。此外，与传统检测方法相比，PCR检测的报告周期短，1～2天即可发出报告，因此对于TB的早期诊断具有独到的优势，但同时该方法存在的假阳性、标本中PCR抑制物质导致的假阴性等问题还有待进一步改进。

TMA：采用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化学发光物丫啶酯标记的DNA探针与扩增的靶基因进行杂交，探针与扩增产物杂交后利用杂交保护试验去除未杂交的标记探针，最后利用化学发光仪检测化学发光信号。由于采用了转录介导扩增技术、杂交保护检测技术和化学发光等多种敏感的分子技术，具有高度的敏感性和特异性。研究表明TMA对涂阳TB诊断的敏感性达到92～100％，对涂阴TB诊断的敏感性也可达40～93％，对所有临床标本检测的特异性均在95％以上，因此具有极大的应用潜力。Gen-Probe公司的TMA检测试剂盒已获得美国FDA的批准应用于临床TB的诊断，不足之处在于操作较为复杂，技术不易掌握，且需要配套的化学发光检测仪，因而在临床的推广应用较为困难。

本公司已申请了专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification andTestiTB，SAT)(申请号：200810111479.0)；在此项技术的基础上，本发明结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒采用的是SAT技术，核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。该试剂盒能够检测痰液中的TBrRNA，具有特异性高、灵敏度高和污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)的特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术特异性、灵敏性不高，实验污染不易控制的缺点，提供一种超声破碎细菌菌体释放出菌体核酸RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对结核分枝杆菌(TB)进行检测的试剂盒。

本发明的一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，包括：

(1)TB稀释液：含0.1～1％RNAse抑制剂的灭菌DEPC水溶液；

(2)TB反应液：为dNTPs和NTPs扩增所需组份，主要包含Tris 10～50mM，MgCl₂10～40mM，dNTP 0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM；

(3)TB检测液：为恒温扩增时必需的引物和荧光探针溶解在TE溶液中配制而成，其中TB检测液中的引物包含有以下一对或几对序列：TB T7：序列见序列表SEQ.ID.NO 1-5；TB nT7：序列见序列表SEQ.ID.NO6-10；TB检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：TB Probe：序列见SEQ.ID.NO11-13；

(4)SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7 RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mMTris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20％(v/v)Triton X-100、10～40％(v/v)glycerol；

(5)TB阳性对照；为10²～10⁵CFU/ml结核分枝杆菌的菌液；

(6)TB阴性对照：为不含有SEQ.ID.NO14核酸序列或不含有结核分枝杆菌的的溶液。

稀释液主要含RNase抑制剂浓度为0.1～1％，RNase抑制剂能够使RNase迅速失活，有效保存RNA，超声破碎菌体使靶标RNA得到了释放，样本放在该稀释液中，延长了样本的保存时间，稀释液组分为灭菌DEPC水和0.1～1％RNase抑制剂。

TB反应液具体包含Tris 10～50mM，MgCl₂ 10～40mM dNTP 0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM；

SAT酶液中所含的T7 RNA聚合酶、M-MLV反转录酶，其稳定性直接决定了扩增反应的扩增效率和试剂盒的使用有效期。该SAT酶液中加有稳定剂，经长期稳定性试验，稳定性可达10个月，保证了试剂盒有效期达6个月。

TB检测液中TB荧光探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。TB检测液中TB引物，依照SAT扩增的原理设计了5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物，下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物与靶标完全一致，保证了本试剂盒可准确进行TB检测的SAT反应。

所述步骤(3)中的引物探针序列选自长516bp TB 16S rRNA基因，序列见序列表SEQ.ID.NO14。

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中的TB阳性对照和TB阴性对照，均含有本试剂盒已述及TB稀释液，其中TB阳性对照还含有一定浓度的TB菌，浓度约为10²～10⁵CFU/ml。使用本试剂盒时，每次应同时做平行对照的质量控制，且结果应同时满足阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。(dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数，与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

TB阳性对照和TB临界弱阳性对照中的TB菌液，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：

(1)将从中国医学细菌保藏中心购买的H37Ra(ATCC25177)标准菌株扩大培养；

(2)采用细菌计数法对培养的菌液进行计数；

(3)将计数的培养物用TB稀释液稀释成阳性对照，所含菌液浓度为10²～10⁵CFU/ml。

(4)将阳性对照用TB稀释液稀释100倍成临界弱阳性对照，所含菌液浓度为1～10³CFU/ml。

有益效果

本发明的检测试剂盒检测TB菌液的分析灵敏度为10CFU/ml，该灵敏度已完全满足临床检验要求，故本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。本发明试剂盒可用于痰液标本的检测。

附图说明

图1为实施例4本发明试剂盒检测病人痰液标本的扩增图；1，2，3，4，5，6，7，8表示临床样本的编号。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

TB核酸RNA的提取，具体步骤为：

1.取痰液1.5ml，视痰标本性状加入1～2倍体积的4％NaOH于无菌样品管中，涡旋振荡1min，使痰液充分匀化，室温放置15min～20min。

2.样品处理管(1.5ml离心管，数量为：待测样本数+2)，分别标记待处理样品编号及阳性、阴性对照；

3.取液化好的痰液标本1ml于样品处理管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入1ml生理盐水重悬洗涤，13000rpm离心5min，弃上清，加入50μL TB稀释液重悬。

4.将处理好的50μl样本及50μl阳性对照，50μl阴性对照放入超声处理器中进行超声处理15min，超声功率为300W。

5.超声结束后，取2μl处理物加入含30μl扩增检测液的洁净微量反应管中，此扩增检测液包含30μlTB反应液和2μl TB检测液，其中TB反应液具体包含：Tris 10～50mM，MgCl₂ 10～40mM，dNTP 0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM；

TB检测液中包含的引物和探针序列分别为：

TB T7：aatttaatac gactcactat agggagacac caacaagctg ataggccgcg g；

TB nT7：gcaagtcgaa cggaaaggtc tc；

TB Probe：cguccggaua ggaccacggg acg。

实施例2

SAT核酸扩增检测

1.将含有扩增检测液的洁净微量反应管放入恒温预热装置中，60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；同时将SAT酶液也预热到42℃；

2.向微量反应管中加入10μl已预热的酶液(加样tip头不要接触微量反应管，如有接触请务必更换tip头)，加酶后盖上管盖1200rpm震荡15秒钟混匀；

3.将微量反应管快速转至合适的恒温荧光检测仪器，42℃ 反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；

4.反应结束后，直接将微量反应管取出浸泡于10％ 84消毒液中，取微量反应管应小心操作，严禁打开反应管(防止污染反应区)！实验结束后用10％ 84消毒液清洁工作区及用具，最后用清水擦拭干净。

5.参考值：

1.阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。

2.dt≤35的样本为阳性；

3.35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性；

4.dt无数值或为40的样本为阴性。

注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

6.质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。

实施例3

TB试剂盒各组份的配制和组装

试剂盒组分：

TB稀释液：含0.1～1％RNAse抑制剂的灭菌DEPC水溶液；

TB反应液：含dNTPs和NTPs，主要包含Tris 10～50mM，MgCl₂ 10～40mM，dNTP0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM；

SAT酶液：含T7 RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20％(v/v)Triton X-100、10～40％(v/v)glycerol；

TB检测液：含TB特异引物、特异荧光探针，引物和探针均溶解于TE溶液；

TB T7：aatttaatac gactcactat agggagacac caacaagctg ataggccgcg g；

TB nT7：gcaagtcgaa cggaaaggtc tc；

TB Probe：cguccggaua ggaccacggg acg。

引物探针序列均选自长516bp 16SrRNA基因保守区，序列见SEQ.ID.NO14。

TB阳性对照：含10²CFU/ml～10⁵CFU/ml TB菌的溶液；

TB阴性对照：为不含有SEQ.ID.NO14核酸序列或不含有结核分枝杆菌的的溶液，用于检验操作过程及试剂的有效性。

实施例4 应用模式之临床样本痰液的检测

本检测模式为本发明的最佳体现：试剂的制备同实施例3，试剂的生产在GMP车间进行，结核分枝杆菌痰液临床样本为常州市第三人民医院提供的临床实验样品，编号为TB痰液标本1～8，另设阴性对照、阳性对照各一个。标本的核酸提取同实施例1，SAT扩增检测及判定同实施例2，所使用的荧光PCR仪为Mx-3005P。结果见附图1，与金标准培养法检测结果完全相同。

Claims (5)

1.一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，包括：

（1）TB稀释液：为含RNase抑制剂的灭菌DEPC水溶液；

（2）TB反应液：具体包含Tris10~50mM，MgCl₂10~40mM，dNTP0.5~5mM，NTP1~10mM，PVP401~10%，KCl5~40mM；

（3）TB检测液：为恒温扩增时必需的TB引物和TB荧光探针溶解在TE溶液中配制而成，其中TB检测液中的TB引物和TB荧光探针的序列为：

TB T7：aatttaatac gactcactat agggagacac caacaagctg ataggccgcg g

TBnT7：gcaagtcgaa cggaaaggtc tc

TB Probe：cguccggaua ggaccacggg acg；所述的TB荧光探针为分子信标；

（4）SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7RNA聚合酶200~2000U/反应、M-MLV反转录酶400~4000U/反应、2~10mM HEPES pH7.5、10~100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04~0.4mM zinc acetate、10~100mM trehalose、40~200mMTris-HCl pH8.0、40~200mM KCl、1~10mM EDTA、2~20%(v/v)Triton X-100、10~40%(v/v)glycerol；

（5）TB阳性对照；为含10²～10⁵CFU/ml结核分枝杆菌的菌液；

（6）TB阴性对照：为含有上述TB稀释液。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述（1）中的稀释液中RNase抑制剂的浓度为0.1~1%，其余成分为灭菌DEPC水。

3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述（3）中的TB检测液中TB荧光探针为分子信标，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型结构，分子信标的环部分和标靶互补，两头由于互补而成为茎。

4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述（3）中的引物探针序列选自长516bp的序列表SEQ.ID.NO14所示TB16S rRNA基因保守区。

5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的TB阳性对照中结核分枝杆菌菌液，制备方法包括下列步骤：

（1）将H37Ra标准菌株扩大培养；

（2）采用细菌计数法对培养的菌液进行计数；

（3）将计数的培养物用TB稀释液稀释成阳性对照，所含菌液浓度为10²～10⁵CFU/ml。

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