CN111778357A - 基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法，所述CRISPR/Cas12a试剂盒包括用于CRISPR/Cas12a检测体系；所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：针对呼吸道合胞病毒的特异性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和单链DNA报告系统；所述特异性crRNA为根据呼吸道合胞病毒核酸设计合成的任意一种或多种；所述单链DNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter。本发明系首次采用CRISPR/Cas12a检测呼吸道合胞病毒核酸序列，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、不依赖大型实验设备等优势。

Description

基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒 及其检测方法
技术领域
本发明涉及呼吸道合胞病毒的基因检测领域，更具体地说，涉及基于CRISPR/Cas12a对呼吸道合胞病毒核酸的快速检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
急性下呼吸道感染是导致全球儿童死亡的主要原因之一，其中，呼吸道合胞病毒(RSV)是每年引起急性下呼吸道感染最常见的病原体，并且还是院内感染的一个重要原因。RSV病毒是一种单链RNA呼吸道病毒，属副粘液病毒科，可经空气飞沫和密切接触传播，传染能力非常强。多见于新生儿和6个月以内的婴儿。RSV感染潜伏期为4～5日，排放病毒的时间可持续1-5周。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎，其死亡率高达5％。引起呼吸道感染的病原体种类较多，且大多数有相似的临床表现。RSV感染的流行时间常常与流感病毒的流行时间重合，但他们的治疗方案差异很大。所以临床医生很难根据临床症状得出准确的病因诊断。快速确诊病因对临床早期诊断和指导治疗有重要意义，而病原体的检测是疾病确诊的前提条件。
目前呼吸道合胞病毒检测的方法主要有病毒分离培养法、免疫学方法和核酸检测法。病毒分离培养法虽有“金标准”之称，但其技术复杂、费时一般需要一周以上的时间且成本较高，不适合早期诊断；免疫学方法是目前最为广泛的技术，但这种方法需要含有一定量的抗原和高质量的特异性抗体，婴幼儿可能由于免疫力低下而出现假阴性，成人轻型患者常常不会引起抗体滴度升高，单靠免疫学检查很可能出现假阴性，结果难以判断；核酸检测最常用的分子诊断方法为RT-PCR技术，针对呼吸道合胞病毒的高保守F基因序列，设计引物进行RT-PCR扩增，但其价格昂贵，需要特殊设备和技术限制了其进一步普及。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas9蛋白家族已被广泛应用到基因编辑、抗病毒制剂和生物影像等众多领域。CRISPR-Cas12a(Cpf1)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。CRISPR/Cas12a酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine,T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并产生具有交错5'的PAM远端dsDNA断裂和3'端不通顺。当CRISPR/CRISPR/Cas12a蛋白以序列特异性方式切割双链DNA(dsDNA)时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。基于CRISPR/Cas12a上述特性，我们开发了一种快速准确的检测方法，用于检测临床标本中呼吸道合胞病毒。从待检临床样品中提取基因组DNA，并在等温条件下进行RT-基础型核酸扩增(RT-RAA)。CRISPR/Cas12a-crRNA复合物结合并切割靶标DNA，其激活ssDNA的反式切割。与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。这种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因的新方法，为快速准确检测呼吸道合胞病毒RSV核酸提供了强有力的平台。
胶体金免疫测定是临床快速检测的一种高效技术方案。当胶体金颗粒标记的抗体与相应的抗原结合时，可目视检测有色免疫反应物。胶体金检测作用时间短、可以长期稳定保存以及相对低成本，这些特性使其广泛适用临床上针对呼吸道合胞病毒RSV核酸的高特异性，高灵敏度，方便快捷的检测。
发明内容
本发明的目的在于针对临床上呼吸道合胞病毒核酸的快速检测，提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的呼吸道合胞病毒核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒及其检测方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒，其特征在于，包括适用于呼吸道合胞病毒的CRISPR/Cas12a检测体系。
所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：针对呼吸道合胞病毒高保守F基因的特异性crRNA，CRISPR/Cas12a蛋白以及单链DNA(ssDNA)报告系统。
所述特异性crRNA为针对呼吸道合胞病毒A和B亚型设计的crRNA1到crRNA4中的任意一种或多种crRNA，其序列见SEQ NO.7到SEQ NO.14。
所述单链DNA(ssDNA)报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter；其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQ reporter/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/；所述ssDNA DBreporter为利用地高辛(Digoxin)和生物素(Biotin)标记的ssDNA,标记产物如下：/5Dig/TTTATTT/3Bio/，命名为ssDNA DB reporter/5Dig/TTTATTT/3Bio/。
优选地，上述用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒还进一步包括免疫胶体金试纸条；所述免疫胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线。
优选地，所述特异性crRNA的制备方法包括：针对呼吸道合胞病毒A和B亚型的F基因，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计21nt长度的crRNA，分别命名为RSVAF-crRNA-1到RSVAF-crRNA-4和RSVBF-crRNA-1到RSVBF-crRNA-4，设计完成后，合成DNA oligo，构建到载体pGL3-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA。
优选地，所述CRISPR/Cas12a蛋白的制备方法包括：针对CRISPR/Cas12a蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列SEQ NO.15，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。
本发明提供的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒既可利用酶标仪荧光检测也可以利用免疫胶体金试纸条检测。当使用酶标仪荧光检测时，CRISPR/Cas12a检测体系中DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA FQ reporter，当使用免疫胶体金试纸条检测时，DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA DB reporter。
在使用酶标仪荧光检测时，当CRISPR/Cas12a检测体系中存在呼吸道合胞病毒基因时，会由在呼吸道合胞病毒特异性crRNA介导下特异性激活CRISPR/Cas12a蛋白的核酸内切酶活性。激活后的CRISPR/Cas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQreporter,从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数。相对应的，待检测样品中不存在呼吸道合胞病毒基因序列时，荧光读数显示为基底值。
在使用免疫胶体金试纸条检测时，将CRISPR/Cas12a切割后待检测样品加入到胶体金试纸条后，被胶体金标的鼠抗地高辛抗体会与地高辛标记的ssDNA报告系统结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标的ssDNA报告系统，从而显示条带；当CRISPR/Cas12a检测到呼吸道合胞病毒的基因时时，会将标记有地高辛和生物素ssDNA报告系统切割断开，从而会有地高辛标记的ssDNA片段被检测线抓获显色，当CRISPR/Cas12a检测不到合胞病毒的基因序列时，不能将标记有地高辛和生物素ssDNA报告系统切割断开，从而不会产生地高辛标记的ssDNA片段被检测线抓获的显色。
本发明还提供了一种呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，其特征在于，采用上述用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测CRISPR/Cas12a试剂盒。
优选地，所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法包括以下步骤：
步骤a：利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；
步骤b：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用呼吸道合胞病毒A和B亚型的特异性引物SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6，加入RT-RAA等温扩增体系，在37℃反应20min扩增获得特异性产物；
步骤c：利用CRISPR/Cas12a检测体系切割呼吸道合胞病毒核酸：将步骤b中产物加入CRISPR/Cas12a检测体系，于37℃反应30min；
步骤d：利用酶标仪或免疫胶体金试纸条检测样品中呼吸道合胞病毒核酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过利用CRISPR/Cas12a特异识别核酸联合免疫测流层析技术，实现对呼吸道合胞病毒核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。根据研究发现，呼吸道合胞病毒F基因介导膜融合，可使病毒包膜与素质细胞膜融合形成合胞体，与多核巨细胞的形成有关。F基因具有高度保守型，选定F基因作为检测的靶序列。根据CRISPR/Cas12a识别特定PAM序列特点，在A和B亚型的F基因靶序列上设计4条特异性crRNA。通过检测发现A亚型的crRNA2和B亚型的crRNA3对于呼吸道合胞病毒的检出有更高的灵敏度，因此选定对呼吸道合胞病毒检测中使用RSVAF-crRNA-2和RSVBF-crRNA-3,进一步建立CRISPR/Cas12a快速检测呼吸道合胞病毒核酸系统。
(2)本发明是基于CRISPR/Cas12a呼吸道合胞病毒的快速检测工具，该工具包含免疫层析条带检测，能实现方便快捷的结果判读。
(3)本发明利用CRISPR/Cas12a对特异性序列切割和免疫测流层析技术实现对呼吸道合胞病毒核酸的快速、高特异性、高灵敏性和可视化检测。同时，基于设计不同序列的crRNA，实现对呼吸道合胞病毒A和B亚型检测的最适crRNA分析。本发明所建立的呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，为临床诊断和实验室研究提供了一个准确、快速、简便的检测方法。
(4)本发明公开了一系列用于呼吸道合胞病毒核酸检测的CRISPR/Cas12a反应体系和crRNA以及RT-RAA扩增引物，其序列依次如SEQ NO.3至NO.14所示。所述CRISPR/Cas12a，crRNA和RT-RAA扩增引物组合可用于呼吸道合胞病毒核酸检测。本发明系首次采用CRISPR/Cas12a检测呼吸道合胞病毒，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。这些优势使得本发明开发的基于CRISPR/Cas12a胶体金试纸检测方法方便用于实验室和临床医学对呼吸道合胞病毒核酸的快速检测和诊断。
附图说明
图1基于CRISPR/Cas12a快速检测呼吸道合胞病毒核酸方法示意图；
图2基于CRISPR/Cas12a快速检测呼吸道合胞病毒核酸的特异性crRNA设计；
图3基于CRISPR/Cas12a不同crRNA检测A亚型呼吸道合胞病毒荧光检测结果(2h)；
图4基于CRISPR/Cas12a不同crRNA检测B亚型呼吸道合胞病毒荧光检测结果(2h)；
图5基于CRISPR/Cas12a不同crRNA检测A亚型呼吸道合胞病毒荧光检测结果(30min)；
图6基于CRISPR/Cas12a不同crRNA检测B亚型呼吸道合胞病毒荧光检测结果(30min)；
图7RSVA-crA-2检测A亚型呼吸道合胞病毒荧光法灵敏度；
图8RSVB-crB-3检测B亚型呼吸道合胞病毒荧光法灵敏度；
图9CRISPR/Cas12a荧光法检测临床样品中A亚型呼吸道合胞病毒核酸(RSVA-crA-2)；
图10CRISPR/Cas12a荧光法检测临床样品中B亚型呼吸道合胞病毒核酸(RSVB-crB-3)；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明中：RT-基础型核酸扩增试剂盒(RT-RAA)购自杭州众测公司；crRNA体外转录盒子MEGA shortscript T7 Transcription Kit和纯化盒子MEGA clear Kit购自Ambion公司；常规试剂如Tris-Base,NaCl,Tris-HCl，MgCl2,BSA和甘油等购自Thermo Fisher；核酸和ssDNA探针合成由南京金斯瑞公司完成；本发明使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。
本发明的总体技术示意图如附图1所示，包括以下4大部分：待检测核酸样品制备、靶基因预扩增，CRISPR/Cas12a检测成分设计制备和体系构建、荧光及胶体金试纸条设计和结果解读。
实施例1：呼吸道合胞病毒核酸片段快速灵敏检测
1.1核酸制备
本案例中RSV基因片段，是参考NCBI数据库中RSV的A和B亚型对应的F基因片段，由南京金斯瑞公司合成A亚型F部分基因的620bp SEQ NO.1和B亚型F部分基因的710bp SEQNO.2并构建到pUC57载体，命名为pUC57-RSVA-F和pUC57-RSVB-F，在合成片段前引入T7启动子，利用体外转录试剂将合成的DNA片段转录成RNA，命名为pUC57-RSVA-F-RNA和pUC57-RSVB-F-RNA。
利用本发明中RT-RAA扩增引物RSVA-RT-RAA-F(SEQ NO.3)，RSVA-RT-RAA-R(SEQNO.4)，RSVB-RT-RAA-F(SEQ NO.5)和RSVB-RT-RAA-R(SEQ NO.6)，参考RT-RAA等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。具体操作如下：
将1μL(10ng)pUC57-RSVA-F-RNA和pUC57-RSVB-F-RNA样品，分别进行RT-RAA扩增反应：25μL 2*Buffer，2μL RT-RAA-F，2μL RAA-R和2.5μL乙酸镁，混合均匀，于37℃反应20min,获得样品进行下一步核酸检测。
1.2RSVA特异性crRNA的设计制备
如图2所示，crRNA制备按照如下方案进行，针对呼吸道合胞病毒A和B亚型F基因保守区，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计识别长度为23nt的crRNA，分别命名为RSVAF-crRNA-1到4(SEQ NO.7-SEQ NO.10)和RSVBF-crRNA-1到4(SEQNO.11-SEQ NO.14)，其中。设计完成后，交于南京金斯瑞公司合成DNA oligo，构建到载体pGL3-T7载体上，通过体外转录获得目的crRNA。
本发明提供的RSV crRNA包括SEQ ID NO.7到SEQ ID NO.14，具体靶向识别区域信息如表1所示。
表1.呼吸道合胞病毒A/B亚型F基因特异性crRNA
Figure BDA0002580554180000061
Figure BDA0002580554180000071
本检测采用20μL体系如表2所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表2.呼吸道合胞病毒CRISPR/Cas12a检测体系
Figure BDA0002580554180000072
其中，ssDNA reporter为ssDNA FQ reporter或ssDNA DB reporter。
1.3全波长酶标仪荧光检测
酶标仪荧光检测中，CRISPR/Cas12a对目的基因检测体系依次加入各种组分。各组分混合均匀后于37℃反应30min。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，CRISPR/Cas12a为200ng/μL，ssDNA FQ reporter浓度为25pmol/μL，crRNA浓度为1pmol/μL。
利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测2小时。取检测30min荧光数值为反应值。其中呼吸道合胞病毒A亚型检测中，针对RSVA和RSVB的每条crRNA(图中简称crA-1～4和crB-1～4)切割检测动力学监测如图3(0-2小时)，呼吸道合胞病毒B亚型检测中，针对RSVA和RSVB的每条crRNA(图中简称crA-1～4和crB-1～4)切割检测动力学监测如图3(0-2小时)该发明利用荧光法结果判定方案，可实现对呼吸道合胞病毒A和B亚型的检测。
1.4胶体金试纸条检测
胶体金试纸条检测中，CRISPR/Cas12a对目的基因检测体系依次加入各种组分。各组分混合均匀后于37℃反应30min。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，CRISPR/Cas12a为200ng/μL，ssDNA DB reporter浓度为25pnol/μL，crRNA浓度为1pmol/μL。
本发明中免疫胶体金试纸条检测步骤如下：将20μL CRISPR/Cas12a切割产物与40μL胶体金试纸条缓冲液(4×SSC，2％BSA和0.05％Tween-20，pH 7.0)混合。将测试条浸入混合物中，反应3分钟后，可由肉眼进行结果判定，拍照后进行灰度值分析。
本实施例中，应用CRISPR/Cas12a荧光和胶体金能够实现呼吸道合胞病毒核酸的快速检测。且发现RSVAF-crRNA-2(crA-2)对于A亚型呼吸道合胞病毒F基因的检出有较高的灵敏度(图5)；RSVBF-crRNA-3(crB-3)对于B亚型呼吸道合胞病毒F基因的检出有较高的灵敏度(图6)。
实施例2：CRISPR/Cas12a检测呼吸道合胞病毒核酸灵敏度
在灵敏度检测案例中，将质粒DNA进行体外转录成为RSVA/B亚型的RNA，根据分子量转换为拷贝数，进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2*e7、2*e6、2*e5、2*e4、2*e3、2*e2、2*e1和2*e0拷贝数(copy/μL)。将1μL梯度稀释样品，分别进行RT-RAA扩增反应：25μL 2*Buffer，2μL RT-RAA-F，2μLRT-RAA-R和2.5μL乙酸镁，混合均匀，于37℃反应20min,获得样品进行下一步核酸检测。
根据实施例1所得结果，RSVAF-crRNA-2和RSVBF-crRNA-3对与检测A和B亚型的呼吸道合胞病毒基因有较高灵敏度，因此采用这两条特异性crRNA进行后续检测。本检测采用20μL体系如表3所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表3.呼吸道合胞病毒CRISPR/Cas12a检测体系
Figure BDA0002580554180000081
其中，ssDNA reporter为ssDNA FQ reporter或ssDNA DB reporter。
本实施案例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测2小时。取检测30min荧光数值为反应值。
本案例中，应用CRISPR/Cas12a荧光法检测呼吸道合胞病毒核酸，能够实现2e1拷贝的高灵敏度检出(图7，8)。
实施例3：对临床样品核酸进行呼吸道合胞病毒核酸的快速检测
本实施例对临床样品的核酸进行快速检测，所有样品及操作均在实验室中完成，本案例中样本为咽拭子获得的核酸进行CRISPR/Cas12a检测。本实施例使用购自诺唯赞公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)获得预处理的核酸。步骤如下：将口腔拭子用PBS清洗，清洗液加20μL蛋白酶K裂解后加入磁珠孵育，常温静置5分钟，利用磁力架清洗两次磁珠，加入50μL洗脱液洗脱并进行下一步检测。
利用本发明中RT-RAA扩增引物SEQ NO.3和SEQ NO.6，参考RT-RAA等温扩增操作步骤，对每个待检测样品取2μl进行RT-RAA预扩增获取待检测样品。具体操作如下：
25μL 2*Buffer，2μL RT-RAA-F，2μL RT-RAA-R，2.5μL乙酸镁，2μL DNA样品，加水补至50μL，混合均匀，于37℃反应20min,获得样品进行下一步核酸检测。
本实施案例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。在CRISPR/Cas12a检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μL Rnase Inhibitors、1μL CRISPR/Cas12a、1μL ssDNA FQ reporter、5μL RT-RAA sample、1μL crRNA和9μL H2O。各组分混合均匀后使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测2小时。取检测30min荧光数值为反应值，利用RSVA的特异性crRNA检测结果如图9所示，#1，#2，#4和#7为阴性样本，#3，#5，#6和#8为呼吸道合胞病毒A亚型阳性；利用RSVB的特异性crRNA检测结果如图10所示，#1，#3，#4，#5，#6和#8为阴性样本，#2和#7为呼吸道合胞病毒B亚型阳性；对样本检测结果总结分析：#1和#4为阴性，#3，#5，#6和#8为呼吸道合胞病毒A亚型阳性，#2和#7为呼吸道合胞病毒B亚型阳性。阳性判定结果与临床样本检测结果一致。结果显示，基于CRISPR/Cas12a的核酸检测技术能够实现对临床咽拭子中呼吸道合胞病毒核酸的灵敏、快速、准确检测。
序列表
<110> 国家卫生健康委科学技术研究所
<120> 基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 620
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaggtaaatc tctgcaacat tgacatattc aaccccaaat atgattgcaa aattatgact 60
tcaaaaacag atgtaagcag ctccgttatc acatctctag gagccattgt gtcatgctat 120
ggcaaaacca aatgtacagc atccaataaa aatcgtggga tcataaagac attctctaac 180
gggtgtgatt atgtatcaaa taagggggtg gatactgtgt ctgtaggtaa tacattatat 240
tatgtaaata agcaagaagg caaaagtctc tatgtaaaag gtgaaccaat aataaatttc 300
tatgatccat tagtgttccc ctctgatgaa tttgatgcat caatatctca agtcaatgag 360
aaaattaatc agagtctagc atttatccgt aaatcagatg aattattaca taatgtaaat 420
gctggtaaat ccaccacaaa tatcatgata actaccataa ttatagtaat tatagtaata 480
ttgttagcat taattgcagt tggactgctt ctatactgca aggccagaag cacaccagtc 540
acattaagta aggatcaact gagtggtata aataatattg catttagtaa ctgaataaaa 600
atagcaccta atcatattct 620
<210> 2
<211> 710
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gctgtagtca gtctatcaaa tggggtcagt gttttaacca gcaaagtgtt agatctcaag 60
aattatataa acaaccaatt attacctata gtaaatcaac agagttgtcg catatccaac 120
attgaaacag ttatagaatt ccagcagaag aacagcagat tgttggaaat caccagagaa 180
tttagtgtca atgcaggtgt aacgacacct ttaagcactt acatgttaac aaacagtgag 240
ttactatcat taatcaatga tatgcctata acaaatgatc agaaaaaatt aatgtcaagc 300
aatgttcaga tagtaaggca acaaagttat tctatcatgt ctataataaa ggaagaagtc 360
cttgcatatg ttgtacagct acctatctat ggtgtaattg atacaccttg ctggaaatta 420
cacacatcac ctctgtgcac caccaacatc aaagaaggat caaatatttg tttaacaagg 480
actgatagag gatggtactg tgataatgca ggatcagtat ccttctttcc acaagctgac 540
acttgtaaag tacagtccaa tcgagtattt tgtgacacta tgaacagttt gacattacca 600
agtgaagtca gcctttgtaa cactgacata ttcaattcca agtatgactg caaaattatg 660
acatcaaaaa cagacataag cagctcagta attacttctc taggagctat 710
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gacttcaaaa acagatgtaa gcagctccgt tatca 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
taatgctaac aatattacta taattactat aatta 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gttttaacca gcaaagtgtt agatctcaag aatta 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgacttcact tggtaatgtc aaactgttca tagtg 35
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
taatttctac taagtgtaga tccatagcat gacacaatgg ctcc 44
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
taatttctac taagtgtaga tatgcatcaa tatctcaagt caat 44
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
taatttctac taagtgtaga ttccgtaaat cagatgaatt atta 44
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
taatttctac taagtgtaga ttggtggatt taccagcatt taca 44
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
taatttctac taagtgtaga tcaacaatct gctgttcttc tgct 44
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
taatttctac taagtgtaga tgtgtcaatg caggtgtaac gaca 44
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
taatttctac taagtgtaga tttataggca tatcattgat taat 44
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
taatttctac taagtgtaga tacaaggact gatagaggat ggta 44
<210> 15
<211> 3744
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
agcaagctgg aaaaatttac caactgctac agcctgagca agaccctgcg tttcaaagcg 60
atcccggttg gcaagaccca ggaaaacatt gacaacaaac gtctgctggt tgaggacgaa 120
aagcgtgcgg aggattataa aggtgtgaag aaactgctgg atcgttacta tctgagcttt 180
atcaacgacg tgctgcacag cattaagctg aaaaacctga acaactacat cagcctgttc 240
cgtaagaaaa cccgtaccga gaaggaaaac aaagagctgg aaaacctgga aatcaacctg 300
cgtaaggaga ttgcgaaggc gttcaagggt aacgagggct acaagagcct gttcaagaaa 360
gatatcatcg aaaccatcct gccggagttc ctggacgata aggacgaaat tgcgctggtt 420
aacagcttca acggttttac caccgcgttc accggcttct ttgataaccg tgagaacatg 480
tttagcgagg aagcgaaaag caccagcatc gcgttccgtt gcattaacga aaacctgacc 540
cgttacatca gcaacatgga cattttcgag aaggttgacg cgatctttga taaacacgag 600
gtgcaggaaa tcaaggagaa aattctgaac agcgactatg atgttgaaga tttctttgag 660
ggtgaattct ttaactttgt tctgacccaa gagggcatcg acgtgtacaa cgcgatcatt 720
ggtggcttcg tgaccgaaag cggcgagaag atcaaaggcc tgaacgagta cattaacctg 780
tataaccaga agaccaaaca aaagctgccg aaatttaagc cgctgtataa gcaggtgctg 840
agcgatcgtg aaagcctgag cttctacggc gagggctata ccagcgacga ggaagttctg 900
gaagtgtttc gtaacaccct gaacaaaaac agcgagatct tcagcagcat taagaaactg 960
gaaaagctgt tcaaaaactt tgacgagtac agcagcgcgg gtatctttgt taagaacggc 1020
ccggcgatca gcaccattag caaagatatc ttcggtgaat ggaacgtgat tcgtgacaag 1080
tggaacgcgg agtatgacga tatccacctg aagaaaaagg cggtggttac cgaaaagtac 1140
gaggacgatc gtcgtaaaag cttcaaaaag attggcagct ttagcctgga acagctgcaa 1200
gagtacgcgg acgcggatct gagcgtggtt gaaaaactga aggagatcat tatccagaag 1260
gttgatgaaa tctacaaagt gtatggtagc agcgagaagc tgttcgacgc ggattttgtt 1320
ctggagaaga gcctgaaaaa gaacgacgcg gtggttgcga tcatgaagga cctgctggat 1380
agcgtgaaaa gcttcgaaaa ctacattaag gcgttctttg gtgaaggcaa agagaccaac 1440
cgtgacgaga gcttctatgg cgattttgtt ctggcgtacg acatcctgct gaaggtggac 1500
cacatctacg atgcgattcg taactatgtt acccaaaaac cgtacagcaa ggataagttc 1560
aagctgtact tccagaaccc gcaattcatg ggtggctggg acaaggataa agagaccgac 1620
tatcgtgcga ccatcctgcg ttacggtagc aagtactatc tggcgattat ggataaaaag 1680
tacgcgaaat gcctgcagaa gatcgacaaa gacgatgtta acggtaacta cgaaaagatc 1740
aactacaagc tgctgccggg cccgaacaag atgctgccga aagtgttctt tagcaaaaag 1800
tggatggcgt actataaccc gagcgaggac atccaaaaga tctacaagaa cggtaccttc 1860
aaaaagggcg atatgtttaa cctgaacgac tgccacaagc tgatcgactt ctttaaagat 1920
agcattagcc gttatccgaa gtggagcaac gcgtacgatt tcaactttag cgagaccgaa 1980
aagtataaag acatcgcggg tttttaccgt gaggttgagg aacagggcta taaagtgagc 2040
ttcgaaagcg cgagcaagaa agaggtggat aaactggtgg aggaaggtaa actgtacatg 2100
ttccaaatct acaacaagga cttcagcgat aagagccacg gcaccccgaa cctgcacacc 2160
atgtacttca agctgctgtt tgacgaaaac aaccatggtc agatccgtct gagcggtggc 2220
gcggagctgt tcatgcgtcg tgcgagcctg aagaaagagg agctggttgt gcacccggcg 2280
aacagcccga ttgcgaacaa aaacccggat aacccgaaaa agaccaccac cctgagctac 2340
gacgtgtata aggataaacg ttttagcgaa gaccaatacg agctgcacat tccgatcgcg 2400
attaacaagt gcccgaaaaa catcttcaag attaacaccg aagttcgtgt gctgctgaaa 2460
cacgacgata acccgtatgt tatcggtatt gaccgtggcg agcgtaacct gctgtacatc 2520
gtggttgtgg acggtaaagg caacattgtg gaacagtata gcctgaacga gattatcaac 2580
aactttaacg gtatccgtat taagaccgat taccacagcc tgctggacaa aaaggagaag 2640
gaacgtttcg aggcgcgtca gaactggacc agcatcgaaa acattaagga gctgaaagcg 2700
ggctatatca gccaagttgt gcacaagatt tgcgaactgg ttgagaaata cgatgcggtg 2760
atcgcgctgg aggacctgaa cagcggtttt aagaacagcc gtgttaaggt ggaaaagcag 2820
gtttaccaaa agttcgagaa gatgctgatc gataagctga actacatggt ggacaaaaag 2880
agcaacccgt gcgcgaccgg tggcgcgctg aaaggttatc agattaccaa caagttcgaa 2940
agctttaaaa gcatgagcac ccaaaacggc ttcatctttt acattccggc gtggctgacc 3000
agcaaaatcg atccgagcac cggttttgtt aacctgctga agaccaaata taccagcatt 3060
gcggatagca aaaagttcat cagcagcttt gaccgtatta tgtacgtgcc ggaggaagac 3120
ctgttcgagt ttgcgctgga ctataagaac ttcagccgta ccgacgcgga ctacatcaaa 3180
aagtggaaac tgtacagcta tggtaaccgt atccgtattt tccgtaaccc gaaaaagaac 3240
aacgtttttg actgggagga agtgtgcctg accagcgcgt ataaggaact gttcaacaaa 3300
tacggtatca actatcagca aggcgatatt cgtgcgctgc tgtgcgagca gagcgacaag 3360
gcgttctaca gcagctttat ggcgctgatg agcctgatgc tgcaaatgcg taacagcatc 3420
accggtcgta ccgatgttga ttttctgatc agcccggtga aaaacagcga cggcattttc 3480
tacgatagcc gtaactatga agcgcaggag aacgcgattc tgccgaagaa cgcggacgcg 3540
aacggtgcgt ataacatcgc gcgtaaagtt ctgtgggcga ttggccagtt caaaaaggcg 3600
gaggacgaaa agctggataa ggtgaaaatc gcgattagca acaaagaatg gctggagtac 3660
gcgcaaacca gcgttaagca cgagaacctg tacttccaat cccaccacca ccaccaccac 3720
caccaccacc accaccacca ctga 3744

Claims (6)

1.一种用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒，其特征在于，包括适用于呼吸道合胞病毒快速检测的CRISPR/Cas12a检测体系；
所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：针对呼吸道合胞病毒F基因的特异性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和ssDNA报告系统；
所述特异性crRNA为针对A亚型的RSVA-F-crRNA1到RSVA-F-crRNA4和针对B亚型的RSVB-F-crRNA1到RSVB-F-crRNA4中的任意一种或多种，其序列为SEQ NO.7到SEQ NO.14；
所述ssDNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter；其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQreporter/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/；所述ssDNA DB reporter为利用地高辛和生物素标记的ssDNA，标记产物如下：/5Dig/TTTATTT/3Bio/，命名为ssDNA DB reporter/5Dig/TTTATTT/3Bio/。
2.如权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒，其特征在于，还包括免疫胶体金试纸条；
所述免疫胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线。
3.如权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒，其特征在于，所述特异性crRNA的制备方法包括：针对呼吸道合胞病毒保守区域F基因，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列TTTN的靶向序列，设计crRNA，设计完成后，合成oligo，构建到载体pGL3-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA。
4.如权利要求1所述的用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a蛋白的制备方法包括：针对CRISPR/Cas12a蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列SEQ NO.15，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。
5.一种呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，其特征在于，采用权利要求1～4任一项所述用于呼吸道合胞病毒核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒。
6.如权利要求5所述的呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒核酸快速检测方法包括以下步骤：
步骤a：利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；
步骤b：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用特异性引物SEQ NO.3和SEQ NO.6，加入RT-RAA等温扩增体系，在37℃反应20min扩增获得特异性产物；
步骤c：利用CRISPR/Cas12a检测体系检测呼吸道合胞病毒核酸：将步骤b中产物加入CRISPR/Cas12a检测体系，于37℃反应30min；
步骤d：利用荧光检测法或免疫胶体金试纸条检测样品中呼吸道合胞病毒核酸。
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