CN110452966A - 一种利用raa-crispr蛋白酶系统快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用RAA‑CRISPR蛋白酶系统快速检测方法，其特征在于，将待检测样本模板加入RAA‑CRISPR蛋白酶系统中的检测试剂后，置于温控设备35‑38℃孵育50‑60分钟，孵育过程中保持温度均一恒定；同时，利用所述温控设备激发并检测信号。本发明将CRISPR‑Cas系统与(RT)RAA恒温核酸扩增有机结合，在保证痕量高灵敏度、高特异性检测的情况下，极大的降低对时间及环境的要求，使得利用基因分子检测技术建立快速、低耗的现场病毒核酸检测技术真正成为可能。

Description

一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，更具体的说是涉及一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法。

背景技术

基因分子检测是当代医学发展的重要前沿领域之一，是利用基因工程及分子生物学等理论和技术，通过直接探查核酸序列的存在或变化，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。其广泛用于现场诊断、床旁诊断、同伴诊断、个体化医疗诊断等多个方面，为疾病的预测、诊断、预防、治疗、预后和转归提供了重要信息和决策依据。

目前，基因分子检测技术的市场需求不断增加，发展趋势也日益精准化、便携化、微量化和一体化。而现有技术多存在弊端。简单、快捷的诊断方法往往敏感度不高，而高敏感度检测方法对环境及仪器的高要求又使其存在局限性。复杂多变的诊断环境，限制了基因分子检测技术的应用，同时也对技术的发展提出了挑战。

其中，CRISPR-Cas系统存于大约90％的古菌和40％的细菌中，作为一种原核生物抵御病毒等外源入侵核酸的获得性免疫系统而存在(Van der Oost J et al.,2014；Barrangou Ret al.,2014)。CRISPR-Cas系统被划分为三个主要类型：I型，II型和III型；它们分别有一个标志性蛋白：Cas3，Cas9和Cas10(Makarova KS et al.,2011)。其中CRISPR-Cas9系统，(Deltcheva E et al.,2011；Gasiunas G et al.,2012)，被广泛开发成真核生物基因组编辑工具(Jinek M et al.,2012；Wang H et al.,2013)。而最近发现的Cas13蛋白，同样属于CRISPR系统II型，它有一个突出的特点：在切开特异性RNA双链序列后，仍能保持RNA酶切活性，且不具备特异性。借助此特性可以针对特定序列的靶标核酸进行检测(J.S.Gootenberg et al.，2017)。然而虽然可利用CRISPR-Cas13系统，可以针对特定序列的靶标核酸进行检测，但是因为整个系统对靶标核酸浓度要求比较高，也就导致了CRISPR-Cas13检测限过高，敏感性很差。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。

因此，如何将CRISPR-Cas系统与(RT)RAA恒温核酸扩增技术有机结合，在保证痕量高灵敏度、高特异性检测的情况下，极大的降低对时间及环境的要求是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法，将CRISPR-Cas系统与(RT)RAA恒温核酸扩增技术有机结合，其中(RT)RAA恒温核酸扩增技术，能够避免了聚合酶链技术中循环变温加热器等大型设备的使用，同时大大提升了扩增速率；而CRISPR-Cas13系统高特异性检测系统，解决了简便、快捷和准确、敏感不能共存的情况，甚至能够在大量干扰核酸的存在下，检测出微量单位点突变的存在。本发明在保证痕量高灵敏度、高特异性检测的情况下，极大的降低对时间及环境的要求，使得利用基因分子检测技术建立快速、低耗的现场病毒核酸检测技术真正成为可能。同时，在疾病预防、疾病诊断、癌症检测、法医鉴定、食品安全、公共卫生等方面将发挥重要的作用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法将待检测样本模板加入RAA-CRISPR蛋白酶系统中的检测试剂后，置于温控设备35-38℃孵育50-60分钟，孵育过程中保持温度均一恒定；同时，利用温控设备激发并检测信号。

其中RAA-CRISPR蛋白酶系统中检测试剂包括，1)其中的基因工程酶或蛋白包括7种，分别是逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白、Cas13蛋白、T7转录酶；

2)化学组分包括RNase抑制剂；提供持续ATP能量的三磷腺苷酸(ATP)、磷酸肌酸二钠盐(PCr)和磷酸肌酶(CK)组合；提供合成单元的核糖核苷三磷酸(rNTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)；维持反应离子与酸碱度环境的乙酸钾(KAc)、二硫苏糖醇(DTT)和聚乙二醇(PEG)；以及保持冷冻干燥过程中蛋白活性的海藻糖(Treph lose)和甘露醇(Mannitol)；

3)引物是一对寡链核苷酸单链，分别特异性识别靶标区域的上下游。引物一般长度约30-35nt，且本发明中成对引物中一条的5’端另含有T7启动子；

4)探针是一条两端修饰的单链cRNA分子，长度约为25nt，一端经荧光发光基团修饰(所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、JOE、Texas Red、Cy3、Cy5或TAMRA中的任意一种)，一端经荧光淬灭基团修饰(所述的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种)，在被水解后，能发出可被接收的荧光信号；

5)引导RNA为条长度约为70nt的单链cRNA分子，由两部分组成：5’端为通用区，含有发卡结构，可以帮助Cas13蛋白识别引导RNA；3’端为探针区，能特异性识别靶标区域，并与之结合形成双链RNA分子，激发Cas13蛋白的双链RNA酶切活性，继而激发其非特异性RNA酶切活性。

进一步的，温控设备具有温度控制模块、时间设置功能、样品孔和荧光激发模块、荧光检测模块；温控设备为反应提供合适温育环境，并能激发并检测荧光信号的仪器。

进一步的，RAA-CRISPR蛋白酶系统中的检测试剂为冻干粉反应试剂。

进一步的，将冻干粉反应试剂先利用缓冲液、双蒸水与12-15mM醋酸镁进行混匀后，再加入待检测样本模板。

进一步的，缓冲液为5-6％PEG。

其中，一种快速检测核酸的(RT)RAA-CRISPR蛋白酶系统，包括常温恒温扩增系统和CRISPR检测系统；CRISPR检测系统设置在常温恒温扩增系统的下游；其中常温恒温扩增系统包括核酸扩增系统和RNA转录系统；其中CRISPR检测系统包括RNA引导序列、检测蛋白Cas13和RAA探针。

RNA引导序列能够杂交到含有靶标序列的RNA片段上。

Cas13蛋白是一种依赖双链RNA进行双链RNA内切的基因工程蛋白酶，在本发明中引导序列与靶标序列杂交后，Cas13蛋白被激活；其特点是：1)可以识别双链RNA分子，并对其进行酶切；2)双链RNA分子的识别，需要引导RNA序列的引导；3)在进行酶切后，其RNA酶切活性仍会保留，并能接续非特异性切割其他RNA分子；4)序列可选的Cas13a蛋白；5)在反应体系中的用量为20-50ng/ul。

RAA探针是一条两端修饰的单链cRNA分子，长度约为25nt，在Cas13蛋白被激活后，能够被其催化酶切，继而发出可被检测的信号。

本发明公开的一种快速检测核酸的(RT)RAA-CRISPR蛋白酶系统，可在恒温常温条件下，快速、高效的完成核酸检测的系统和方法，克服了目前特异性强、灵敏度高的诊断方法对环境、精密仪器依赖性大，而简单、方便的诊断方法又存在特异性弱、灵敏度差的问题。

本发明将CRISPR-Cas系统与(RT)RAA恒温核酸扩增技术有机结合，不仅避免了大型设备的使用，同时大大提升了扩增速率；而且具有简便、快捷和准确的特点、在敏感不能共存的情况，甚至能够在大量干扰核酸的存在下，仍然可以检测出微量单位点突变的存在。

核酸扩增系统为重组酶介导核酸扩增系统；逆转录酶，重组酶，单链结合蛋白，DNA聚合酶，辅助蛋白，恒温常温扩增系统化学试剂和RAA引物组。

逆转录酶是一种采用点突变进行基因改造后的蛋白质，其特点是:1)具有DNA聚合酶活性，能以RNA为模板，催化dNTP聚成生成互补cDNA；2)通过点突变使原来具有的RNase活性失活，从而避免将DNA-RNA杂合链中的RNA水解；3)该酶序列来源于鼠白血病逆转录酶(M-MLV)；4)在反应体系中的用量约8-12单位/ul。

重组酶是一种基因工程蛋白酶，其特点是：1)具有结合单链DNA的能力，因此能与引物寡核苷酸单链形成起始复合体；2)具有和双联DNA分子结合的能力，因此才能在形成起始复合体的同时，也结合DNA双链或DNA-RNA杂合链，从而形成结构特异的三链DNA中间体；3)具有同源重组活性，当单链DNA侵入双链DNA或DNA-RNA杂合链，沿链寻找同源序列区后，可将同源的单链排挤出去，形成所谓的局部气泡区，进而方便后续DNA聚合酶的介入；4)该酶序列可来源于大肠杆菌的RecA，或T4噬菌体重组酶uvsX；5)在反应体系中的用量约为100-150ng/ul。

优选的，单链结合蛋白是一种DNA结合蛋白，其特点在于：1)沿形成的局部气泡区，局部结合被替换出来的同源单链，避免其被核酸酶降解；2)不具备酶活性，因此不和ATP结合；3)具有协同效应，因此可多个单链结合蛋白相邻结合于DNA单链上，便于气泡区的DNA合成；4)这种组合具有短时性，因此才能沿着“复制叉”不断结合，又不断重新组配；5)该酶序列可能源于E.coli或T4的GP32蛋白；6)在反应体系中的用量约为700-1000ng/ul。

优选的，DNA聚合酶是一种依赖DNA模板进行互补DNA序列合成的基因工程蛋白酶，其特点是：1)具有较高的连续合成能力；2)具有置换链活性，在合成新链的同时，能通过链置换能力配合单链结合蛋白将局部气泡区沿“复制叉”方向持续推进，从而将同源链替换出；3)具有3’-5’外切酶(校正能力)活性，从而保证合成的保真型；4)不耐高温，因此非常适合在常温恒温条件下反应，并完成DNA链的合成；5)该酶的序列可源于E.coli的DNA聚合酶IKlenow大片段、Bst聚合酶、Phi-29聚合酶或枯草芽孢杆菌Po1I(Bsu)；6)在反应体系中的用量约为60-90ug/ul。

辅助蛋白是一种协助或增强重组酶活性的蛋白，其特点是：1)促进并稳定起始复合体与DNA双链间的结合；2)序列可选T4噬菌体的uvsY蛋白；3)在反应体系中的用量约20-40ng/ul。

RNA转录系统为T7转录系统；T7转录系统包括T7转录酶。

T7转录酶是一种以一条DNA链或者RNA链为模板催化RNA合成的基因工程蛋白酶，其特点是：1)RNA转录酶能识别模板上的启动子，并与之结合2)具有较高的连续合成能力，3)不耐高温，因此非常适合常温恒温条件下反应，完成DNA转录为RNA；4)序列可选；5)在反应体系中的用量为20-100ng/ul。

恒温常温扩增系统化学试剂包括Tris、RNase抑制剂、dNTPs、rNTP、磷酸肌酸二钠盐、乙酸钾、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、二硫苏糖醇、PCR引物、引导RNA和taqman探针。

ATP提供持续能量；核糖核苷三磷酸(rNTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)提供合成单元；乙酸钾(KAc)、二硫苏糖醇(DTT)和聚乙二醇(PEG)维持反应离子与酸碱度环境的；海藻糖(Trephlose)和甘露醇(Mannitol)保持冷冻干燥过程中蛋白活性。

RAA引物中含有T7启动子。

RAA引物是一对寡链核苷酸单链，分别特异性识别靶标区域的上下游。引物长度约30-35nt，且本发明中成对引物中一条的5’端另含有T7启动子。

RNA引导序列由探针区和通用区组成；探针区为靶标序列高度同源的序列；通用区含有发卡状结构，引导检测蛋白Cas13识别并酶切探针区与RNA模板的结合区域。RNA引导序列长度约为70nt的单链cRNA分子，由两部分组成：5’端为通用区，含有发卡结构，可以帮助Cas13蛋白识别引导RNA；3’端为探针区，能特异性识别靶标区域，并与之结合形成双链RNA分子，激发Cas13蛋白的双链RNA酶切活性，继而激发其非特异性RNA酶切活性。

RAA探针为RNA探针，RNA探针的一端利用荧光发光基团修饰，另一端利用荧光淬灭基团修饰。

荧光发光基团为FAM、HEX、VIC、JOE、TexasRed、Cy3、Cy5或TAMRA中的任意一种。

荧光淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

本发明公开提供了一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法，至少有以下优点：

(1)本发明公开的一种快速检测核酸的(RT)RAA-CRISPR蛋白酶系统可以在常温恒温下进行检测，(RT)RAA-CRISPR蛋白酶系统能够最大程度模拟生物体内核酸扩增和CRISPR功能的环境，而且系统内的各种工具酶都各司其职，在最适的反应温度上工作，因此工作效率高。

(2)本发明公开的一种快速检测核酸的(RT)RAA-CRISPR蛋白酶系统可以在大量相似序列的干扰情况下，区分出靶标序列单个碱基的差异，因此特异性非常强；同时，前期(RT)RAA对靶标区域的扩增，可以使含靶标序列的核酸分子浓度提升至较高水平，因此可以检测到更低浓度的模板，灵敏度很高。

(3)本发明从核酸的前期扩增，到后期的CRISPR检测，都在同一管反应中进行，也

只通过一次性加样完成，因此操作更简单。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的各实验组信号随时间变动结果图；

图2附图为本发明提供的各实验组40min后，各组荧光信号对比图；

其中图2附图中单号标签为沙门氏菌试验组荧光信号；双号标签为沙门氏菌突变组荧光信号。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

根据NCBI GenBank与相关文献报道，根据沙门氏菌invA基因；SEQ ID No.6，设计一对引物，且上游引物前端加上T7启动子序列为是S-F/R；

S-F:5’-TAATACGACTCACTATAGGATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTA-3；SEQID No.1；

S-R:5’-CGAGCGCTTCCATAATTAATTTCATATTACGC-3；SEQ ID No.2；

一条引导RNA：CR-S；5’-FAMAGCGUUUGUUAAGCGAACGUGUUUCBHQ-3；SEQ ID No.4。

引物和引导RNA探针区的设计，位于沙门氏菌属invA基因的高同源区。

人工合成一条荧光RNA探针Pro-U；

Pro-U：6-FAM-5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUUUUACUCCUUCUUCAUGCGUUACCCA-3’-BHQ1；SEQ ID No.3；

合成一段该基因片段的单碱基突变序列SEQ ID No.5，用于SNP检测。

利用冻干技术，将反应主要成分按如下体系按照配置，并制成干粉状后再进行后续实验。

分别以沙门氏菌invA基因序列，该基因片段的单碱基突变序列DNA为模板设置试验组；以无酶水为模板设置阴性对照组，每组设置6个重复。检测的反应体系为表1。

表1检测的反应体系

冻干粉反应试剂	1管
		PEG35000	5％
引物A-F	0.48uM
		引物A-R	0.48uM
crRNA	22.5nM
		醋酸镁	14mM
样品	5uL
		双蒸水	补至50uL

反应程序：37℃恒温，2h，检测通道为FAM，每5min检测一次荧光信号；试验在ABI7500仪器上开展，其检测结果如图1-2。6.如图1所示，沙门氏菌试验组扩增时间荧光信号不断增加，突变试验组和阴性对照组荧光信号为平直线，证明此次检测的结果是有效的。如图2，在40min后，沙门氏菌试验组荧光信号较突变组荧光信号差异显著，且差异不断增加。既证明有沙门氏菌invA的存在，又证明了在40min完成了检测。本次实例证明了(RT)RAA-CRISPR系统可以在体外恒温常温条件下快速完成指定病原体基因特异性检测。

综上所述，本发明提供的一种(RT)RAA-CRISPR蛋白酶系统，将CRISPR-Cas系统与(RT)RAA恒温核酸扩增技术有机结合，其中(RT)RAA恒温核酸扩增技术，能够避免了聚合酶链技术中循环变温加热器等大型设备的使用，同时大大提升了扩增速率；而CRISPR-Cas13系统高特异性检测系统，解决了简便、快捷和准确、敏感不能共存的情况，甚至能够在大量干扰核酸的存在下，检测出微量单位点突变的存在。本发明在保证痕量高灵敏度、高特异性检测的情况下，极大的降低对时间及环境的要求，使得利用基因分子检测技术建立快速、低耗的现场病毒核酸检测技术真正成为可能。同时，在疾病预防、疾病诊断、癌症检测、法医鉴定、食品安全、公共卫生等方面将发挥重要的作用。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 浙江善测禾骑士生物科技有限公司

<120> 一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taatacgact cactatagga ttaatgagat ccgtgttgaa caatttacgg tcta 54

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgagcgcttc cataattaat ttcatattac gc 32

<210> 3

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uuuuacuccu ucuucaugcg 60

uuaccca 67

<210> 4

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcguuuguu aagcgaacgu guuuc 25

<210> 5

<211> 419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gattaatgag atccgtgttg aacaatttac ggtctacttt gatttgatgc gcgtggtaaa 60

ttattcggat gaagtcgctt cctttggcat taatccaacg acctatcatc aaggtagtag 120

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<210> 6

<211> 419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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ccctttgtta agcgaacgtg tttccgtgcg taatatgaaa ttaattatgg aagcgctcg 419

Claims (5)

1.一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法，其特征在于，将待检测样本模板加入RAA-CRISPR蛋白酶系统中的检测试剂后，置于温控设备35-38℃孵育50-60分钟，孵育过程中保持温度均一恒定；同时，利用所述温控设备激发并检测信号。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测核酸的(RT)RAA-CRISPR蛋白酶系统，其特征在于，所述温控设备具有温度控制模块、时间设置功能、样品孔和荧光激发模块、荧光检测模块；所述温控设备为反应提供合适温育环境，并能激发并检测荧光信号的仪器。

3.根据权利要求1所述的一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法，其特征在于，所述RAA-CRISPR蛋白酶系统中的检测试剂为冻干粉反应试剂。

4.根据权利要求3所述的一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法，其特征在于，将所述冻干粉反应试剂先利用缓冲液、双蒸水与12-15mM醋酸镁进行混匀后，再加入待检测样本模板。

5.根据权利要求4所述的一种利用RAA-CRISPR蛋白酶系统快速检测方法，其特征在于，所述缓冲液为5-6％PEG。