CN101932731A - 亚硫酸氢化核酸的扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于扩增核酸的反应混合物，所述核酸的未甲基化胞嘧啶碱基已通过亚硫酸氢化物反应转变成尿嘧啶碱基。本发明还涉及用于扩增亚硫酸氢化物反应的核酸和用于确定核酸甲基化状态的方法，以及涉及基于本发明的反应混合物的试剂盒。

Description

亚硫酸氢化核酸的扩增
技术领域
本发明属于分子生物学和表观遗传学领域，涉及核酸的扩增，所述核酸的未甲基化胞嘧啶碱基已经通过亚硫酸氢化反应转变成尿嘧啶碱基。还公开了用于本发明的核酸扩增的反应混合物和试剂盒，以及用于分析核酸甲基化状态的方法。
背景技术
表观遗传机制引起基因表达的改变，所述改变不伴有基因编码序列的变化，但是可以例如通过有丝分裂传递。在高等真核生物中，研究得最好的表观遗传机制除了RNA相关的沉默和组蛋白修饰以外就是DNA甲基化(Serman等，Coll Antropol.2006；30(3)：665-71)。
DNA在核酸的胞嘧啶残基上、优选在具有胞嘧啶-鸟嘌呤序列(CpG)的二核苷酸上被甲基化。在真核生物中，最重要的碱基修饰是胞嘧啶5’位处的甲基化。
然而，甲基化的类型可能是不同的，在植物中除CpG甲基化之外已经公开了CNG和不对称胞嘧啶甲基化，在果蝇(Drosophila)中已经检测到少量CT甲基化。此外，在各种不同的真菌中，已发现非CG甲基化。所述CpG二核苷酸通常聚集在核酸的相对小(500bp-4kb)的区段中，并且如果GC含量＞55％，被称为CpG岛。CpG岛通常被发现在基因调控区附近，并且可能影响所述基因的转录调控。在大多数情况下，CpG岛的甲基化引起受影响基因的失活，因此在许多生物学过程(印迹(imprinting)、X染色体失活、基因表达)中发挥作用，尽管特别是在良性以及恶性肿瘤的发展(Egger等，Nature.2004；429(6990)：457-63)、在某些表型、疾病和细胞衰老中发挥作用。
因此，分析核酸的甲基化在诊断学中是特别重要的(例如用于癌症和其他疾病的早期诊断和分类)，同时出于基因调控的目的对甲基化状态进行靶向修饰，代表了一种可能的治疗策略。因此，检测核酸的甲基化状态非常重要。
核酸的甲基化状态可以通过核酸的亚硫酸氢化作用来分析，所述分析包括将所述核酸的未甲基化胞嘧啶碱基转变成尿嘧啶碱基，同时甲基化的胞嘧啶碱基维持不变。用于分析核酸的甲基化状态的各种不同技术、特别是亚硫酸氢化作用的综述，可以在Fraga等，Biotechniques.2002；33(3)：632，634，636-49和Laird，Nat Rev Cancer.2003；3(4)：253-66中发现。因此，取决于起始核酸的甲基化状态，亚硫酸氢化反应产生具有不同序列的核酸序列，然后在尤其是通过PCR或通过测序分析所述序列后，可以推断起始核酸的甲基化状态。
取决于细胞的发育状态和生理状况，所有胞嘧啶碱基中大约5-15％是甲基化的。因为甲基化的胞嘧啶碱基保持不受亚硫酸氢化反应的影响，这导致起始核酸的所有胞嘧啶碱基中大约85-95％被转变成尿嘧啶碱基。结果，这为起始核酸提供了基本上新的碱基组成，其中胞嘧啶向尿嘧啶的转变从G∶C碱基对产生G∶U错配，因此从那以后，核酸的两条链不再彼此完全互补。产生的错配可以相当多，因为例如含有5％甲基化胞嘧啶的GC含量为50％的DNA，在亚硫酸氢化作用后可能只具有28％的GC含量。
亚硫酸氢化反应后得到的具有改变的碱基组成的该被转变的核酸的扩增，特别是在PCR扩增的情况下，可能引起极大困难。因此，对于通过亚硫酸氢化作用转变的核酸的改进的扩增，存在着需求。本发明为该问题提供了解决方案。
发明简内容
本发明涉及用于扩增通过亚硫酸氢化转变的核酸的改进的反应混合物和方法，用于分析核酸甲基化状态的方法，以及相应的试剂盒。本发明是基于令人吃惊的发现，即利用亚硫酸氢化反应进行了转变的核酸的扩增，可以通过将反应混合物中核苷酸dATP和dTTP的浓度增加到超过dCTP和dGTP的浓度，来显著改进。
本发明的一个方面涉及用于核酸扩增的反应混合物，所述反应混合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，以及包含尿嘧啶的核酸，其特征在于dATP和dTTP的起始浓度高于dCTP和dGTP的起始浓度。
特别优选情况下，使用的核苷酸不带标签或不被标记，即尤其是不具有任何荧光、发光或重量标志物、含有染料的或染色标志物(特别是酶标志物)、磁性、放射活性、可放射性检测或免疫标志物、抗原、凝集素或其他可检测标志物或标记物。
在优选实施方案中，反应混合物中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的200％到600％。在更优选实施方案中，反应混合物中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的300％到500％。
本发明的第二方面涉及用于扩增通过亚硫酸氢化反应转变的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：
a.将亚硫酸氢化的核酸与至少一组引物、至少一种聚合酶和dATP、dTTP、dCTP和dGTP接触；以及
b.利用聚合酶扩增核酸，
其特征在于dATP和dTTP的起始浓度高于dCTP和dGTP的起始浓度。在优选实施方案中，反应混合物中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP的起始浓度的200％到600％。在更优选实施方案中，反应混合物中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的300％到500％。在更优选实施方案中，扩增等温地或利用温度循环进行，更优选情况下扩增是RCA或MDA。
本发明的另一方面涉及分析核酸甲基化状态的方法，所述方法包括下列步骤：
a.对核酸进行亚硫酸氢化；
b.按照本发明的第二方面对来自步骤a的亚硫酸氢化的核酸进行扩增；
c.检测由于所述亚硫酸氢化而从胞嘧啶转变成尿嘧啶的核酸碱基，
其中每个检测到的尿嘧啶对应于原始核酸中存在的未甲基化胞嘧啶。
本发明的另一方面涉及具有上述反应混合物的试剂盒。试剂盒包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP以及至少一种聚合酶，并且其特征在于dATP和dTTP的浓度高于dCTP和dGTP的浓度。
在本发明的方法或反应混合物中使用的核酸优选为DNA，特别优选为基因组DNA或线粒体DNA。
在优选实施方案中，试剂盒中dATP和dTTP的浓度相当于dCTP和dGTP浓度的200％到600％，优选为dCTP和dGTP浓度的300％到500％。
本发明的反应混合物或方法可用于特别是扩增复杂的核酸混合物。尽管在开头时提到的标记反应能用于最高大约103个核苷酸的复杂度，但本发明的反应混合物或使用所述反应混合物进行的方法，适合于扩增具有≥104个核苷酸、优选≥105、特别优选≥106、非常特别优选≥107个核苷酸并且最高达到1011个核苷酸的复杂度的核酸。
本发明的其他实施方案出现在权利要求书、详细描述和实施例中。
附图说明
图1显示了基于通过实时PCR测定的Ct值表示的序列的增加(表1)。1个Ct循环的差异相当于2倍差异。
发明详述
核酸的甲基化是在真核生物中对基因调控相当重要的复制后表观遗传学机制。在甲基化反应中，向胞嘧啶的嘧啶碱基的5号碳原子添加甲基，导致形成5-甲基胞嘧啶。在体内，该甲基的添加在DNA甲基化酶(DNMT)的帮助下，通过S-腺苷甲硫氨酸(甲基供体)的甲基向胞嘧啶(甲基受体)的转移来催化，并且优选发生在位于鸟嘌呤5’处的胞嘧啶中(CpG)。
由于进化机制以及甲基胞嘧啶的自发脱氨基倾向，基因组中的CpG二核苷酸是未被充分代表的。但是，它们聚集在特别是被称为“CpG岛”的基因调控区中，该岛大小为约500bp-4kb，并具有＞55％的GC含量。这些CpG岛包含所有CpG二核苷酸的大约20％，与特定基因组的所有基因中大约一半的调控区相关。一般来说，具有高转录活性的基因位于未甲基化基因组区域中。相比之下，只具有低转录活性或完全没有活性的基因位于甲基化区域中。
因为DNA的甲基化可以导致例如DNA堆积密度、基因的表达或失活的生理性变化，并且因为甲基化样式的变化与特别是癌症、某些遗传疾病和细胞衰老的发展相关，因此考虑到了将甲基化状态的靶向改变/校正治疗性地用于基因调控目的。特别为此，但是也出于例如诊断应用的目的，可靠地分析甲基化状态是绝对需要的。
首先由Frommer等(Proc Natl Acad Sci U S A.1992；89(5)：1827-31)描述的例如伴有随后的扩增/测序的亚硫酸氢化作用，已被证明适合于分析核酸的甲基化状态，特别是特异性CpG位点的甲基化状态。
本发明提供了用于扩增通过亚硫酸氢化作用转变的核酸的改进的反应混合物和方法、用于分析核酸甲基化状态的方法以及相应的试剂盒。
定义
本文中使用的术语“核酸”是指核糖核酸、优选为脱氧核糖核酸，它可以是天然来源的，即它可以从尤其是生物体、组织、细胞或活检样品获取，或可以通过其他方法、尤其是通过酶或化学体外反应来制备。这里的核酸也指修饰形式的核酸，尤其是包含硫酯键而不是磷酸酯键、碱基或脱氧核糖修饰例如通过附加有机或无机基团、或引入的碱基类似物(也包括非嘌呤或非嘧啶类似物)的核酸。在优选实施方案中，核酸是DNA(脱氧核糖核酸)、PNA或cDNA，更优选为基因组或线粒体DNA。核酸可以是单链、双链或多链的核酸。
本文中使用的术语“转变的核酸”或“转变的DNA”是指核酸或DNA，其组成对于A、G、C或T彼此的相对比例来说已被改变。优选情况下，所述术语意味着通过所述核酸的亚硫酸氢化作用将未甲基化胞嘧啶转变成尿嘧啶。更具体来说，它意味通过所述核酸的亚硫酸氢化作用将大部分或所有未甲基化胞嘧啶转变成尿嘧啶，使得至少50％、优选75％以上、特别优选90％以上的未甲基化胞嘧啶已被转变成尿嘧啶。通过亚硫酸氢化反应转变的核酸也被称为“亚硫酸氢化的”。因为亚硫酸氢化作用将未甲基化胞嘧啶转变成尿嘧啶，因此如果最初存在至少一个未甲基化胞嘧啶，那么转变的核酸包含至少一个尿嘧啶。此外，因为只是胞嘧啶而不是互补链的鸟嘌呤被转变，因此转变产生的核酸具有G∶C比率不等于1的互补链，即DNA不再符合碱基比例的Chargaff’s规则。此外，取决于核酸的未甲基化胞嘧啶的数量，可能存在各种不同的转变的核酸的变体。例如，含有2个胞嘧啶的核酸在亚硫酸氢化作用后，取决于所述胞嘧啶的甲基化状态，可以相应地产生4种不同的变体，因为无、第一、第二或两个所述胞嘧啶可以是未甲基化的，并转变成尿嘧啶。这些不同变体可以利用特异性引物或引物组来检测。纯化的核酸或裂解物都可以被转变。
本文中使用的术语“扩增”是指核酸(模板或基质核酸)以至少2的倍数增殖。优选的核酸扩增方法是扩增样品的整个被转变核酸的全扩增方法。它们包括等温或非等温全基因组扩增(WGA)方法。用于本发明的目的的两种特别优选的扩增方法是RCA(滚环扩增)和MDA(多重置换扩增)。
RCA是基于尤其是许多病毒所发生的滚环复制(参见例如Baker，T.A.&Kornberg，A.(1992)《DNA复制》(DNA Replication)；Freeman，New York)。RCA一般包括多轮在等温下进行的、酶催化的核酸链合成，该合成使用聚合酶延伸与环状核酸杂交的引物以给出核酸链，同时在所述环状核酸(靶环)上连续进行。这种首先被Fire等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1995)；92(10)：4641-5)描述的方法，具有线性动力学、容易放大、使用可能的聚合酶的多样性(与PCR不同，不需要热稳定聚合酶)、高特异性和灵敏性的特点，因此可用于可靠地、可重复地复制高达微克级的核酸。RCA也可用于指数地复制核酸。这通过至少两种引物或一组引物来实现，其中所述引物与靶环上的至少两个结合位点杂交，或与靶环上的至少一个结合位点和互补链上的至少一个结合位点杂交。关于RCA的综述可以在Demidov，V.(2005)《诊断基因组学和蛋白质组学百科全书》(Encyclopedia of Diagnostic Genomicsand Proteomics)；Marcel Dekker，Inc.；1175-1179中发现。
同样在等温下进行并与上述RCA具有同样优点的MDA，包括通过引物杂交并利用聚合酶来扩增线性核酸、例如基因组DNA，其中形成的核酸链被同时用于所有情况下的所述引物的第二次杂交，即在第一次扩增产物上引发的第二轮扩增。对于RCA以及MDA来说，优选使用具有链置换活性、并具有或不具有3’→5’外切核酸酶校读活性的高生产率聚合酶，该聚合酶能够高质量地复制长达100kb的核酸，而不从核酸模板上掉下。这样的聚合酶的优选例子是Phi29DNA聚合酶。由于使用热不稳定聚合酶并在恒定温度下进行反应，以这种方式进行的扩增与例如利用PCR进行的扩增相比具有多种优点。因此，使用的聚合酶在扩增反应后可以被热失活，以便防止所述聚合酶降解扩增产物。此外，由于反应在恒定的低温下进行，不形成可能污染邻近反应的含有扩增子的气溶胶。此外，同时使用外切核酸酶抗性随机引物，能够以极其均匀的方式扩增完整基因组，事实上不受模板核酸序列影响(全基因组扩增；WGA)。关于MDA以及在WGA中的应用的综述，可以在尤其是Dean等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)；99(8)：5261-6)中发现。
在本发明的特别优选实施方案中，利用MDA的WGA使用
Figure BPA00001187350800081
试剂盒(QIAGEN)，它包括在将模板核酸化学变性和中和后，在存在Phi-29DNA聚合酶和外切核酸酶抗性随机引物的情况下，在30℃下扩增大约8到10小时或过夜。利用试剂盒在WGA中产生的产物的平均长度，典型地大于10kb，在大约2kb到100kb的范围内。
其他适合于本发明的线性和指数扩增方法对于技术人员来说是熟知的，尤其是PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)、NASBA(基于核酸序列的扩增)、SDA(链置换扩增)、TMA(转录介导的扩增)、3SR(自持续序列复制)、LAMP(环介导的扩增)、HAD(解旋酶依赖性扩增)、RPA(重组酶-聚合酶扩增)。
本文中使用的术语“引物”是指用作具有核酸聚合酶或核酸连接酶活性的酶的起始位点的分子。引物可以是蛋白、核酸或另一种本领域技术人员认为适合作为聚合酶或连接酶起始位点的分子。所述分子由于分子间或分子内相互作用而可以作为起始位点。优选的是核酸引物。它们可以在其整个长度上与模板核酸杂交，或可以在某种程度上具有错配，其长度通常为4到30个核苷酸(nt)。引物可以包含随机序列或简并序列，使得所述引物可以与利用亚硫酸氢化作用转变的核酸的许多不同序列杂交。在其他情况下，引物可以包含使得所述引物只能与利用亚硫酸氢化作用转变的核酸中的一种或几种特定序列杂交的序列。引物的长度为4到100nt，优选为5到50nt，非常特别优选为6到25nt。
本文中使用的术语“引物组”是指进行扩增所需的一组引物，由至少一条引物构成。对于线性扩增来说，引物组由至少一条引物构成。对于指数扩增来说，引物组同样由至少一条引物构成，如果该引物与模板核酸的至少两个不同位置杂交的话，从而指数扩增杂交位置之间的核酸区段。但是，优选情况下，用于指数扩增的引物组由至少两条与模板核酸的两个不同位置杂交的引物(引物对)构成；在这里同样地，指数扩增了杂交位置之间的核酸区段。
本文中使用的术语“相应引物组”是指至少两组引物，它们对所有情况下的未亚硫酸氢化的变体特异和对核酸的至少一个亚硫酸氢化的变体特异。
本文中使用的术语“聚合酶”是指催化核酸链中单个核苷酸之间的磷酸二酯键形成的酶(例如DNA和RNA聚合酶)。特别优选的是在本发明的扩增方法中使用适合于扩增反应的聚合酶，特别是所有DNA聚合酶。聚合酶可以分成热不稳定或热稳定酶。优选的聚合酶包括具有酶编号EC 2.7.7.7的聚合酶、Taq聚合酶、具有校读活性的聚合酶、具有链置换活性的聚合酶、突变的聚合酶，以及含有辅助因子(例如解旋酶、单链结合蛋白、重组蛋白)聚合酶和、形成有功能的DNA聚合酶复合物的全酶。在优选实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶、更优选为Taq聚合酶、具有校读活性的DNA聚合酶或具有链置换活性的聚合酶。链置换活性是聚合酶的一种性质，通过这种性质，在聚合酶反应过程中，双链核酸的一条“旧”链从另一条“旧”链上被置换(链置换)。链置换聚合酶包括所有能够进行链置换的聚合酶。它们包括酶例如Phi29DNA聚合酶、Klenow exo minus DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep VentTM DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、9oNmTM DNA聚合酶和Bca DNA聚合酶。
链置换聚合酶也可以突变形式存在，例如作为“exo minus”变体(即无外切核酸酶活性)。这些包括聚合酶，例如Phi29DNA聚合酶、Klenow exo minus DNA聚合酶。其他适合的聚合酶是Taq DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶。
原则上，所述聚合酶也可以采取修饰的形式。这包括截短的变体或与相应野生型相比具有突变的变体。所述突变可以是影响、例如增强聚合酶的功能性的突变，或者是例如由于保守取代而不影响所述聚合酶的功能性的突变。
这样的保守取代包括其中氨基酸被来自下列组的另一个氨基酸取代的变异：
Figure BPA00001187350800101
下述列表描述了提到的类型的优选保守取代：
  原始残基   取代
  Ala   Gly，Ser
  Arg   Lys
  Asn   Gln，His
  Asp   Glu
  Cys   Ser
  Gln   Asn
  Glu   Asp
  Gly   Ala，Pro
  His   Asn，Gln
  Ile   Leu，Val
  Leu   Ile，Val
  Lys   Arg，Gln，Glu
  Met   Leu，Tyr，Ile
  Phe   Met，Leu，Tyr
  Ser   Thr
  Thr   Ser
  Trp   Tyr
  Tyr   Trp，Phe
  Val   Ile，Leu
此外，所述聚合酶可以进一步被化学修饰。
特别优选情况下，本发明为使用的聚合酶提供了修饰，以便具有“热启动”性质。这样的聚合酶适合用于“热启动PCR”中，它与已知PCR区别仅在于第一步。在这里，只有当反应混合物已经达到所需最高温度时，聚合酶链反应才开始。由此，它实现了只有当引物已与DNA序列特异性结合时才起始聚合反应，从而产生较少假产物。在这里，优选有三种途径用于赋予聚合酶以“热启动”性质：
1.通过抗体进行修饰：
在这种情况下，使用与聚合酶可逆结合并在正常室温下抑制聚合酶活性的抗体。因为抗体与聚合酶不同，不是热稳定的，它在第一个加热步骤过程中变性并解离。然后聚合酶可以开始工作。
2.化学修饰：
在这种情况下，聚合酶用化学试剂例如甲醛或二羧酸酐进行可逆失活。
3.竞争性抑制：
在这种情况下，聚合酶被例如结合于活性位点的聚阴离子竞争性抑制。
也可以向聚合酶添加改进或能够对利用亚硫酸氢化作用转变的核酸进行扩增的其他辅助因子。所述因子包括例如解旋酶、单链DNA结合蛋白(例如SSB、T4gp32)、重组蛋白(例如，recA、Mut蛋白)。
本文中使用的术语“连接酶”是指通过产生磷酯键来连结(“连接”)两条核酸链的连接酶。它包括DNA和RNA连接酶。因此，“连接酶”是指具有酶编号EC 6.5.1.1、EC 6.5.1.2或EC 6.5.1.3的酶。
本文中使用的术语“起始浓度”是指在核酸扩增开始时存在的特定物质的浓度。例如，dATP、dTTP、dCTP和/或dGTP(dNTP)的起始浓度是指在转变的核酸扩增开始时、例如在MDA开始时特定的脱氧核糖核苷三磷酸的浓度。因为用作所述扩增的模板的转变的核酸含有不同量的各种核苷酸(A、T、C、G、U)，因此所述dNTP的浓度在扩增过程中以不同的速率降低，即作为所有情况下的转变的核酸的互补核苷酸的频率的函数。
本文中使用的术语“甲基化状态”是指所讨论核酸的单个胞嘧啶碱基存在或不存在甲基化。因此，例如按照本发明的方法确定核酸的甲基化状态，鉴定了所讨论核酸中以甲基化或未甲基化形式存在的胞嘧啶。
亚硫酸氢化反应和甲基化状态的确定
核酸的甲基化状态可以不同的方式确定。本领域技术人员已知的特别适合于此的方法，是利用亚硫酸氢钠(NaHSO3)将核酸亚硫酸氢化，然后扩增(例如利用RCA或MDA)转变的核酸以确定转变的胞嘧啶或未转变的5-甲基胞嘧啶。所述确定可以尤其是通过测序来进行，或通过使用对转变的或未转变的核酸区域特异的各种不同的引物组(互补引物组)纯粹定性地或定量地进行。
由Frommer等(Proc Natl Acad Sci U S A.1992；89(5)：1827-31)描述的亚硫酸氢化反应，包括将已经变性成单链的DNA在3.1M亚硫酸氢钠和0.5mM氢醌的混合物中，在pH 5.0和50℃下温育16到40小时，以便将未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶。在亚硫酸氢化反应完成后，在进一步使用转变的核酸之前通过透析除去过量的亚硫酸氢钠。
执行亚硫酸氢化反应的另一种选择是亚硫酸氢化物试剂盒(可以从QIAGEN获得)，该试剂盒允许亚硫酸氢化反应在避免核酸断裂的受控条件下进行，并允许方便地纯化转变的核酸。
转变的核酸的转变和纯化通常跟随有至少一个扩增步骤，通过该步骤使转变的核酸增殖，以便能够检测转变的胞嘧啶。在优选实施方案中，扩增通过RCA或MDA、更优选通过使用
Figure BPA00001187350800132
试剂盒来进行。但是，多种其他适合的扩增和检测方法对于本领域技术人员来说是已知的。在此参考例如由Frommer等描述的亚硫酸氢化物基因组测序(BGS)(Proc Natl Acad Sci U S A.1992；89(5)：1827-31)，或由Herman等描述的甲基化特异性PCR(MSP)(Proc Natl Acad Sci U S A.1996；93(18)：9821-26)。BGS包括对转变的DNA在将其扩增并克隆到载体中之后，通过标准方法(例如链终止方法)进行测序，而MSP是基于提供至少一组引物(正向和反向引物)，它们对甲基化并因而未转变的、或未甲基化并转变的核酸序列特异。当对于每个目标核酸位置使用两组引物(对所有情况下转变或未转变的核酸特异)时，然后可以利用扩增，通过扩增子的形成，对每个目标核酸位置特异地确定甲基化或未甲基化状态的存在。
用于通过亚硫酸氢化作用转变的核酸扩增的反应混合物，用于转变的核酸的扩增(和甲基化状态的分析)的方法
本发明提供的用于核酸扩增的反应混合物是基于令人吃惊的发现，即通过亚硫酸氢化反应进行转变的核酸的扩增，可以通过使反应混合物中核苷酸dATP和dTTP的浓度增加到超过dCTP和dGTP的浓度，来显著地改进。
本发明的第一方面涉及用于核酸扩增的反应混合物，所述反应混合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP和包含尿嘧啶的核酸，其中dATP和dTTP的起始浓度高于dCTP和dGTP的起始浓度。在一个实施方案中，反应混合物还包含连接酶。
本发明的第二方面涉及使用本发明的反应混合物，对通过亚硫酸氢化反应转变的核酸进行扩增的方法，所述方法包含下列步骤：
a.将亚硫酸氢化的核酸与至少一组引物、至少一种聚合酶以及dATP、dTTP、dCTP和dGTP接触，其中dATP和dTTP的起始浓度高于dCTP和dGTP的起始浓度；和
b.利用所述聚合酶扩增所述核酸。
在本发明的优选实施方案中，扩增通过MDA或RCA、更优选通过使用
Figure BPA00001187350800141
试剂盒来进行。
在另一个优选实施方案中，核酸的扩增在连接酶存在下进行。
用于例如通过MDA或RCA进行核酸扩增的适合条件，为本领域技术人员所充分了解，事实是，所述条件可以并且应该根据所述核酸的具体性质进行调整，以便确保最适扩增。因此，例如，MDA或RCA过程中的反应温度可以根据使用的引物对和/或聚合酶进行调整。同样地，PCR过程中的退火时间和/或退火温度可以随着待扩增的核酸而变化。同样地，可以使用不同的聚合酶、缓冲液或核苷酸或待扩增核酸的起始浓度。
本发明的第三方面涉及用于分析核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括下列步骤：
a.对核酸进行亚硫酸氢化；
b.按照本发明的第二方面，即通过使用本发明的反应混合物，扩增来自步骤a的亚硫酸氢化的核酸，
c.检测由于所述亚硫酸氢化而从胞嘧啶转变成尿嘧啶的核酸碱基，
其中每个检测到的尿嘧啶对应于原始核酸中存在的未甲基化胞嘧啶。
在本发明的反应混合物和方法的优选实施方案中，dATP的起始浓度与dTTP相同，dCTP的起始浓度与dGTP相同。在另一个优选实施方案中，dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP的起始浓度的500％以上。在另一个优选实施方案中，dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP的起始浓度的200％到600％；更优选情况下，dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的300％到500％。在另一个优选实施方案中，dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的300％、400％或500％。在另一个优选实施方案中，反应混合物中dCTP和dGTP的起始浓度为20-3000μM、50-2000μM或100-1000μM。
在本发明的反应混合物和方法的优选实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶，更优选为Taq聚合酶、具有校读活性的DNA聚合酶或具有链置换活性的聚合酶。更优选情况下，聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、Klenow exo minus DNA聚合酶、VentTM DNA聚合酶、Deep VentTM DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、9oNmTM DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶及其外切活性阴性(exo minus)的变体。在另一个优选实施方案中，向聚合酶添加了其他增强或能够使通过亚硫酸氢化作用转变的核酸扩增的辅助因子。
在本发明的反应混合物和第二方面的另一个实施方案中，核酸是通过亚硫酸氢化作用转变的核酸，它优选基本上不含未甲基化胞嘧啶碱基、更优选不含未甲基化胞嘧啶碱基。这同样适用于从本发明的第三方面的步骤a得到的核酸。在另一个实施方案中，核酸的互补链的G∶C比率不等于1，和/或核酸的互补链彼此不完全互补。在优选实施方案中，核酸的互补链彼此之间的互补性为1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-99.9％，或介于(不包含端值)50到100％、75到100％或90到100％之间。
在本发明的反应混合物和方法的另一个优选实施方案中，核酸选自DNA、PNA、基因组DNA、线粒体DNA和cDNA。更优选情况下，核酸是线粒体或基因组DNA。在另一个优选实施方案中，核酸是单链的。
在本发明的反应混合物和方法的另一个优选实施方案中，所述反应混合物还包含至少一组引物。在优选实施方案中，反应混合物具有至少两个相应的引物组，它们对核酸所有情况下的甲基化和因而未转变的变体、或对核酸的至少一个未甲基化并因而转变的变体特异。在另一个优选实施方案中，至少一组引物或至少两个相应引物组对至少一个CpG岛核酸序列特异，和/或位于至少一个基因的至少一个调控区(例如启动子)中。
CpG岛是具有统计学上增加的CpG二核苷酸密度的基因组区域。所述密度是基于所讨论的整个基因组区段中单核苷酸和二核苷酸的频率。CpG是指胞嘧啶-磷脂酰基-鸟嘌呤。为了更好地将磷酸核苷链(＝DNA分子)中的GC与CG分辨开，也陈述了字母p(也参见5’末端、3’末端)。CpG岛被定义为长度为0.5kb到2kb、具有60％以上的增加的GC含量的DNA区段，而总基因组的GC含量为40％。CpG岛的产生机制涉及使用遗传材料作为信息载体。结果，CpG岛是对于例如遗传学、医学和生物信息学来说重要的重要标记。
在另一个优选实施方案中，至少一组引物或至少两个相应引物组对含有至少一个CpG岛的至少一个核酸序列特异。在另一个优选实施方案中，至少一组引物或至少两个相应引物组对至少一个其甲基化状态与表型相关的CpG岛核酸序列特异。反应混合物优选包含5到10、10到20、20到50、50到100、100到250或250个以上的引物组、相应引物组或随机引物。在另一个优选实施方案中，这些引物组中的至少一个、优选一半、更优选全部对其甲基化状态与疾病相关的CpG岛核酸序列特异。
在本发明的反应混合物和方法的另一个实施方案中，反应混合物还包含扩增缓冲液。该缓冲液的组成对于本领域技术人员来说是充分公知的。
在本发明的方法的另一个实施方案中，在亚硫酸氢化反应之前进行了附加的变性核酸的步骤。在优选实施方案中，所述变性可逆地和/或用热的方法和/或在碱性条件下进行。在另一个实施方案中，在亚硫酸氢化反应后跟随附加的纯化转变的核酸的步骤。在优选实施方案中，所述纯化通过透析或沉淀进行。在另一个实施方案中，核酸以线性或指数、优选指数方式进行扩增。
在本发明的用于分析核酸的甲基化状态的方法的另一个实施方案中，核酸的亚硫酸氢化作用使用上述Frommer等的方法、优选使用QIAGEN试剂盒来进行。在另一个实施方案中，检测通过凝胶分级、Southern印迹、测序或RT-PCR来进行。
试剂盒
本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒用于改进的扩增通过亚硫酸氢化作用转变的核酸，以及用于确定核酸的甲基化状态。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含dATP、dTTP、dCTP、dGTP和至少一种聚合酶，其中dATP和dTTP的浓度高于dCTP和dGTP的浓度。在优选实施方案中，dATP和dTTP的浓度为dCTP和dGTP浓度的200％到600％，优选为dCTP和dGTP浓度的300％到500％。在另一个实施方案中，dCTP和dGTP的浓度是10mM。在另一个实施方案中，核苷酸采用冻干形式，它在用溶剂例如水复溶后，给出符合本发明的浓度和浓度比。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒还包含至少一组引物。在优选实施方案中，试剂盒包含至少两个相应引物组，它们对核酸所有情况下的甲基化以及因而未转变的变体、或对所述核酸的至少一个未甲基化并因而转变的变体特异。在另一个优选实施方案中，至少一组引物或至少两个相应引物组对至少一个CpG岛核酸序列特异，和/或位于至少一个基因的至少一个调控区(例如启动子)中。在另一个优选实施方案中，至少一组引物或至少两个相应引物组对含有至少一个CpG岛的至少一个核酸序列特异。在另一个优选实施方案中，至少一组引物或至少两个相应引物组对至少一个其甲基化状态与表型相关的CpG岛核酸序列特异。反应混合物优选包含5到10、10到20、20到50、50到100、100到250或250个以上的引物组、相应引物组或随机引物。在另一个优选实施方案中，这些引物组中的至少一个、优选一半、更优选全部对其甲基化状态与疾病相关的CpG岛核酸序列特异。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒在连接酶存在下包含聚合酶。
在优选实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶，更优选为Taq聚合酶、具有校读活性的DNA聚合酶或具有链置换活性的聚合酶。更优选情况下，聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、Klenow exo minus DNA聚合酶、VentTM DNA聚合酶、Deep VentTM DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、9oNmTM DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶及其外切活性阴性的变体。在另一个优选实施方案中，向聚合酶添加其他增强或能够使通过亚硫酸氢化作用转变的核酸扩增的辅助因子。
实施例
实施例1：
在QIAamp方法(QIAGEN)帮助下，按照标准流程从人类血液获得基因组DNA。使用EpiTect试剂盒(QIAGEN)，按照标准流程，将通过该方式获得的1μg DNA用于亚硫酸氢化反应(转变反应)。将5μl纯化的转变的DNA用于全基因组扩增。为此，使用了REPLI-g试剂盒(QIAGEN)，向5μl纯化的转变的DNA添加29μl REPLI-g Midi反应缓冲液、2μl REPLI-g Midi聚合酶(Phi29聚合酶)和不同体积的10mM dATP与dTTP的混合物。dGTP和dCTP的起始浓度恒定固定在1mM。
表1：添加到REPLI-g反应中的dATP/dTTP混合物的体积以及由此在混合物中得到的起始浓度
dATP dTTP dGTP dCTP
 混合物1   0μl dATP/dTTP   1mM   1mM   1mM   1mM
 混合物2   1μl dATP/dTTP   1.24mM   1.24mM   1mM   1mM
 混合物3   2μl dATP/dTTP   1.48mM   1.48mM   1mM   1mM
 混合物4   3μl dATP/dTTP   1.73mM   1.73mM   1mM   1mM
 混合物5   4μl dATP/dTTP   1.97mM   1.97mM   1mM   1mM
 混合物6   5μl dATP/dTTP   2.22mM   2.22mM   1mM   1mM
反应混合物的总体积是41μl。反应在30℃温育8小时。在温育后，通过在65℃温育5分钟终止反应。产生的DNA通过PicoGreen(Invitrogen)定量。将10ng扩增的DNA通过实时PCR来分析亚硫酸氢化的基因组序列。实时PCR使用QuantiTect SybrGreen试剂(QIAGEN)，按照标准流程来进行。
对于使用QuantiTect SybrGreen试剂盒(QIAGEN)的实时PCR来说，使用了下列引物对：
2560/61：GTGATGGTGGGTATGGGTTAGAAGGATTTT和CAACTCATTATAAAAAATATAATACCAAA
1393/94：CCCCTTCTAAAAACTCCCCAA和TGTAGGGGAATTGGAATTAGGT
Ecad3：TGGTTGTAGTTATGTATTTATTTTTAGTGGTGTT和ACACCAAATACAATCAAATCAAACCAAA
1386/89：GAGAGAGAAGTAGTTGTGTA和CCATTCTATCTCCAATAACACCCT
2558/59：GGATTTGATTGATTATTTTATGAAGATTTTTAT和CCATACCCAAAAAAAAAAACTAAAAAAATACC
表2显示了通过实时PCR测定的各种不同引物对的Ct值。Ct值(阈值循环数)对应于荧光第一次增加到明显超过背景荧光时的PCR循环。因此，模板DNA起始量相同时，较低Ct值对应于更有效的PCR。
表2：通过实时PCR测定的Ct值
2560/61 1393/94 E-cad 3 1386/89 2558/59
  混合物1   28.89   31.07   31.65   32.40   34.26
  混合物2   28.2   27.50   28.4   29.42   33.18
  混合物3   27.58   25.65   26.00   28.18   31.36
  混合物4   27.19   24.59   26.47   28.46   32.16
  混合物5   27.2   25.16   26.5   28.01   31.99
  混合物6   27.59   25.07   26.70   28.22   32.14
正如结果所示，对于通过亚硫酸氢化反应进行转变的核酸的扩增来说，通过将反应混合物中核苷酸dATP和dTTP的起始浓度增加到高于dCTP和dGTP的起始浓度，其Ct值显著降低，对应于改进和更有效的PCR。这适用于所有被测试的引物组合，特别是混合物3到6，即反应混合物中核苷酸dATP和dTTP的起始浓度增加超过dCTP和dGTP的起始浓度大约50％-120％。
图1显示了基于测定的Ct值表示的序列的增加，1个Ct循环的差异相当于2倍差异。在这里也清楚地表明，反应混合物中核苷酸dATP和dTTP的起始浓度增加高于dCTP和dGTP的起始浓度，对于所有被测试的引物组合来说，导致了亚硫酸氢化核酸的扩增的显著改进。
实施例2：
在QIAamp方法(QIAGEN)帮助下，按照标准流程从人类血液获得基因组DNA。使用EpiTect试剂盒(QIAGEN)，按照标准流程，将通过该方式获得的1μg DNA用于亚硫酸氢化反应(转变反应)。将5μl纯化的转变的DNA用于全基因组扩增。为此，使用了REPLI-g试剂盒(QIAGEN)，向5μl纯化的转变的DNA添加29μl REPLI-g Midi反应缓冲液、1μl REPLI-g Midi聚合酶(Phi29聚合酶)和不同体积的5mM dATP与dTTP的混合物。dGTP和dCTP的起始浓度恒定固定在0.24mM。
表3：添加到REPLI-g反应中的dATP/dTTP混合物的体积以及由此在混合物中得到的起始浓度
dATP dTTP dGTP dCTP
 混合物1   0μl dATP/dTTP   0.24mM   0.24mM   0.24mM   0.24mM
 混合物2   5μl dATP/dTTP   0.83mM   0.83mM   0.24mM   0.24mM
 混合物3   6μl dATP/dTTP   0.95mM   0.95mM   0.24mM   0.24mM
 混合物4   7μl dATP/dTTP   1.07mM   1.07mM   0.24mM   0.24mM
 混合物5   8μl dATP/dTTP   1.19mM   1.19mM   0.24mM   0.24mM
 混合物6   9μl dATP/dTTP   1.31mM   1.31mM   0.24mM   0.24mM
反应混合物的总体积是41μl。反应在30℃温育8小时。在温育后，通过在65℃温育5分钟终止反应。产生的DNA通过PicoGreen(Invitrogen)定量。将10ng扩增的DNA通过实时PCR来分析亚硫酸氢化的基因组序列。实时PCR使用QuantiTect SybrGreen试剂(QIAGEN)，按照标准流程来进行。
对于使用QuantiTect SybrGreen试剂盒(QIAGEN)的实时PCR来说，使用了下列引物对：
699bis：GGTAGGGATTTGTGATATTGT和AATACCATAACACATAACCTAA
1386/89：GAGAGAGAAGTAGTTGTGTA和CCATTCTATCTCCAATAACACCCT
C3：GGAGTGGA GGAAATTGAGAT和CCACACAACAAATACTCAAAAC
表4显示了通过实时PCR测定的各种不同引物对的Ct值。Ct值(阈值循环数)对应于荧光第一次增加到明显超过背景荧光时的PCR循环。因此，模板DNA起始量相同时，较低Ct值对应于更有效的PCR。
表4：通过实时PCR测定的Ct值
699bis 1386/89 C3
  混合物1   30.21   30.76   31.43
  混合物2   27.41   28.11   28.47
  混合物3   26.35   29.34   28.90
  混合物4   26.98   28.87   29.01
  混合物5   25.54   27.92   28.04
  混合物6   26.18   29.34   28.17
正如结果所示，对于通过亚硫酸氢化反应进行转变的核酸的扩增来说，通过将反应混合物中核苷酸dATP和dTTP的起始浓度增加到高于dCTP和dGTP的起始浓度，其Ct值显著降低，对应于改进和更有效的PCR。这适用于所有被测试的引物组合，特别是混合物2到6，即反应混合物中核苷酸dATP和dTTP的起始浓度增加超过dCTP和dGTP的起始浓度大约350％-550％。

Claims (28)

1.用于核酸扩增的反应混合物，所述反应混合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，以及包含尿嘧啶的核酸，其特征在于dATP和dTTP的起始浓度高于dCTP和dGTP的起始浓度。
2.权利要求1的反应混合物，其中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的200％到600％，优选为dCTP和dGTP起始浓度的300％到500％。
3.前述权利要求任一项的反应混合物，还包含至少一组引物。
4.权利要求3的反应混合物，其中至少一组引物对所有情况下的未亚硫酸氢化的变体特异和/或对核酸的至少一个亚硫酸氢化的变体特异。
5.权利要求3或4的反应混合物，其中至少一组引物对至少一个CpG岛核酸序列特异，该CpG岛核酸序列的甲基化状态与表型或疾病相关。
6.前述权利要求任一项的反应混合物，其中dCTP和dGTP的起始浓度是20-3000μM、50-2000μM或100-1000μM。
7.前述权利要求任一项的反应混合物，还包含至少一种聚合酶。
8.权利要求7的反应混合物，其中聚合酶是链置换聚合酶。
9.权利要求7的反应混合物，其中聚合酶是热稳定聚合酶。
10.权利要求7-9任一项的反应混合物，其中聚合酶选自Phi29-DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、9oNm DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶和/或Klenow exo minus DNA聚合酶，以及上面提到的聚合酶的修饰形式，包括“热启动聚合酶”。
11.权利要求7-10任一项的反应混合物，其还包含连接酶。
12.用于扩增通过亚硫酸氢化反应转变的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：
a.将亚硫酸氢化的核酸与至少一组引物、至少一种聚合酶以及dATP、dTTP、dCTP和dGTP接触；和
b.利用所述至少一种聚合酶扩增所述核酸，
其特征在于dATP和dTTP的起始浓度高于dCTP和dGTP的起始浓度。
13.权利要求12的方法，其中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的200％到600％，优选为dCTP和dGTP起始浓度的300％到500％。
14.权利要求12或13的方法，其中核酸与至少两个相应引物组接触，所述引物组对所有情况下的未亚硫酸氢化的变体特异和/或对核酸的至少一个亚硫酸氢化的变体特异。
15.权利要求12-14任一项的方法，其中引物组对至少一个CpG岛核酸序列特异，该CpG岛核酸序列的甲基化状态与表型或疾病相关。
16.权利要求12-15任一项的方法，其中核酸与5到10、10到20、20到50、50到100、100到250或250个以上的这种引物组接触。
17.权利要求12-16任一项的方法，其特征在于核酸在连接酶存在下进行扩增。
18.权利要求12-17任一项的方法，其中扩增在等温下或利用温度循环来进行。
19.权利要求18的方法，其中扩增是RCA、MDA、SDA或PCR。
20.用于分析核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括下列步骤：
a.对核酸进行亚硫酸氢化；
b.按照权利要求12-19任一项，对来自步骤a的亚硫酸氢化的核酸进行扩增；以及
c.检测由于所述亚硫酸氢化从胞嘧啶转变成尿嘧啶的核酸碱基，
其中每个检测到的尿嘧啶对应于原始核酸中存在的未甲基化的胞嘧啶。
21.权利要求1-11任一项的反应混合物或权利要求12-20任一项的方法，其中核酸是DNA。
22.权利要求21的反应混合物或方法，其中DNA是基因组DNA或线粒体DNA。
23.试剂盒，具有权利要求1-11和/或21-22任一项的反应混合物。
24.权利要求23的试剂盒，还包含连接酶。
25.权利要求23或24的试剂盒，其中dATP和dTTP的浓度为dCTP和dGTP浓度的200％到600％，优选为dCTP和dGTP浓度的300％到500％。
26.权利要求23-25任一项的试剂盒，还包含至少一组引物。
27.权利要求26的试剂盒，包含至少2、5到10、10到20、20到50、50到100、100到250或250个以上的相应引物组，所述引物组对所有情况下的未亚硫酸氢化的变体和/或对核酸的至少一个亚硫酸氢化的变体特异。
28.权利要求26-27任一项的试剂盒，其中至少一组引物对至少一个CpG岛核酸序列特异，该CpG岛核酸序列的甲基化状态与表型或疾病相关。
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