CN108367287B

CN108367287B - 极端逆转录pcr

Info

Publication number: CN108367287B
Application number: CN201680064778.6A
Authority: CN
Inventors: C.T.维特维尔; J.F.夸肯布什; J.A.豪斯基珀
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2036-11-04
Also published as: US20190002954A1; EP3337615A1; US10900074B2; CN108367287A; PL3337615T3; WO2017079636A1; JP7319646B2; EP3337615A4; EP3337615B1; CA3000824C; ES2916153T3; CA3000824A1; DK3337615T3; JP2018538007A

Abstract

提供用于实施RT‑PCR的方法、试剂盒和混合物，其中RT温育不超过1分钟和PCR循环为每个循环<20秒。

Description

极端逆转录PCR

优先权声明

本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2015年11月5日提交的美国临时申请序列号62/251400的权益，其整个内容本文通过参照结合。

发明背景

聚合酶链式反应(PCR)为一种在分子生物学中广泛使用的技术。其名字源自其一种关键组分，即DNA聚合酶，该酶用于通过体外酶促复制扩增DNA片段。随着PCR进行，所产生的DNA (扩增子)本身被用作复制的模板。这启动DNA模板指数扩增的链式反应。通过PCR，有可能将DNA片段的单个或几个拷贝扩增跨越几个数量级，产生DNA片段的数百万或更多个拷贝。PCR采用热稳定聚合酶、dNTP和引物对。

PCR在概念上分成3个反应，每个反应通常假定在3种温度中的每一种下随着时间的推移而发生。PCR的这种“平衡范式”易于理解为在每个循环的3个时间段于3种温度下发生的3个反应(变性、退火和延伸)。然而，这种平衡范式并不完全符合物理现实。瞬间温度改变不会发生，改变样品温度需要时间。此外，单个反应速率随着温度而变化，并且一旦发生引物退火，聚合酶延伸紧随其后。更准确地，特别是对于快速PCR，为一种其中反应速率和温度总是在改变的动力学范式。只要产物变性和引物退火，保持温度在PCR期间恒定是不必要的。在PCR的动力学范式下，产物变性、引物退火和聚合酶延伸可能在时间上重叠，并且其速率随着温度连续变化。在平衡范式下，循环通过每种保持一段时间的3种温度来定义，而动力学范式则需要转换速率和靶标温度。平衡和动力学范式的说明性时间/温度概况显示在图15a-15b中。然而，应该理解，这些温度概况仅为说明性的，并且在PCR的一些实施中，将退火和延伸步骤组合，使得仅需要2种温度。

范式没有对或错，只是其用处各不相同。平衡范式简单易懂，并且非常适合于工程思维和仪器制造。动力学范式与生物化学、快速循环PCR和解链曲线分析更相关。

当PCR在20世纪80年代后期首次普及时，过程缓慢。一个典型方案为94℃下变性1分钟，55℃下退火2分钟和72℃下延伸3分钟。当包括温度之间的转换时间时，典型的是8分钟循环，导致在4小时内完成30个循环。25%的循环时间耗费在温度转换。随着循环速度增加，耗费在温度转换的时间比例也增加，并且动力学范式变得越来越相关。在快速循环PCR期间，温度通常会改变。对于短产物(<100 bp)的快速循环PCR，100%的时间可能耗费在温度转换，并且没有保持时间是必要的。对于较长产物的快速循环PCR，可包括在最佳延伸温度下保持的温度。

孤立地说，术语“快速PCR”既相对又模糊。1小时PCR比4小时快，但是比15分钟慢。此外，如果以较高模板浓度起始或使用较少循环，则可使PCR方案较短。更具体的量度为每个循环所需的时间。因此，1994年将“快速循环PCR”(或“快速循环”)定义为在10-30分钟内完成30个循环(1)，导致每个循环20-60秒。每个循环的这种实际时间超过对于变性、退火和延伸通常的编程化时间总和，因为需要时间来渐变这些阶段中每个之间的温度。20世纪90年代早期的初始工作确立了使用毛细管和热空气进行温度控制的快速循环的可行性。这些年来，系统变得更快速，并且变性、退火和延伸的动力学需要变得更清晰。

在一种早期快速系统中，来自吹风机的加热元件和风扇、热电偶和毛细管中的PCR样品被封闭在室中(2)。风扇创建加热空气通过热电偶和毛细管的快速流动。通过匹配热电偶对样品的热响应，即使在温度改变期间，热电偶的温度也密切跟踪样品温度。尽管空气的热导率低，但是快速移动的空气相对于毛细管所暴露的大表面积足以使样品在变性、退火和延伸温度之间循环。电子控制器监测温度，调节加热元件的功率，并且提供需要的定时和循环数目。为了进行冷却，控制器启动电磁铁，后者打开通向外部空气的入口，将冷却空气引入到本来密闭的室。

温度可使用毛细管/空气系统快速改变。使用低蓄热室、循环空气和玻璃毛细管中的样品，在PCR仅10分钟(30个循环，每个20秒)后，在溴化乙锭染色的凝胶上可见> 500 bp的PCR产物(3)。产物产率受延伸时间和聚合酶浓度的影响。用30秒循环时间(在70-80℃之间约10秒用于延伸)，带强度随着聚合酶浓度从每10 μl反应物0.1增加至0.8单位而增加。注意到聚合酶单位的定义可能会令人困惑。对于天然Taq聚合酶，在典型快速循环条件下，0.4 U/10 μl为约1.5 nM (50)。

快速方案使用瞬间或“0”秒保持在变性和退火温度下。也就是说，温度-时间概况显示变性和退火的温度尖峰，而没有保持顶部和底部温度。变性和退火可以很快速发生。

温度的快速和准确控制允许分析研究PCR所需的温度和时间。对于人基因组DNA(β-球蛋白)的说明性536 bp片段，变性温度在91℃-97℃之间同样有效，变性时间从<1秒到16秒也是如此。然而，发现变性时间超过16秒实际上减少产物产率。只要用于引物退火的时间有限，退火温度为50-60℃即可以良好产率获得特异性产物。也就是说，通过从变性到退火的快速冷却和退火时间<1秒获得最佳特异性。在延伸温度为75-79℃并且延伸时间增加至多达约40秒时，产率最佳。

这项早期工作的结论为：1) PCR产物的变性非常快速，不需要保持变性温度，2)引物的退火可以很快速发生并且退火温度保持可能不必要，和3) 所需的延伸时间取决于PCR产物长度和聚合酶浓度。同样，快速循环PCR不仅更快速，而且就特异性和产率而言更好(4, 5)，只要精确控制温度。PCR速度不受可用生物化学的限制，但是受到不能密切或快速控制样品温度的仪器限制。

然而，当前大部分实验室PCR仪器在瞬间变性和退火时间方面表现不佳，并且许多甚至使得不能编程“0”秒保持时间。通过锥形管壁传热的时间延迟、表面积-体积比率低和大样品的加热迫使大部分仪器依赖于延长变性和退火时间，以确保样品达到期望的温度。由于这些时间延迟，精确的温度与时间过程的关系变得不确定。结果是商业产品之间的重现性有限以及高度变化性(6)。许多仪器在温度转换期间显示显著的温度变化(7, 8)。温度的下冲和/或过冲为一个长期问题，很少通过取决于样品体积的尝试性软件预测来解决。这种困难由于与可能随着年限而改变的仪器的热性能而加剧。

随着时间的推移，常规热块(heat block)仪器已经由于“薄壁”管的逐步改善、样品之间更导热性分布、低蓄热块及其他“快速”改良而变得更快速。尽管如此，这些系统充分快速循环以在不到60秒内完成一个循环也是少见的。一些热块系统可实现<60秒循环，通常限于在有限的温度范围之间进行2温度循环。通过使样品容器变平，快速循环可通过电阻加热和空气冷却(9)，或者通过在保持在恒定温度下的加热区之间的柔性管中移动样品(美国专利第6706617号)来实现。

商业版本的用于PCR的空气/毛细管系统自1991年以来已可用(1)，并且自1996年以来已用于实时PCR (10, 11)。其他仪器的快速循环能力通常与首次证实20-60秒循环的空气/毛细管标准相比。说来也怪，这些年来一直趋于较慢运行毛细管/空气系统，或许反映许多用户对“0”秒变性和退火时间的不适。同样，热激活酶需要长的激活时间，甚至在使用“快速”激活酶时其运行时间通常会加倍。远离快速循环的另一个折衷方案为使用塑料毛细管。这些毛细管不与仪器热匹配，因此通常需要在变性和退火下保持20秒才能达到靶标温度(12)。

在天然处理小体积的微系统中发生了进一步减少PCR循环时间的一些进展(13,14)。然而，甚至对于高表面积-体积比样品室，如果加热元件具有高蓄热并且在室外部，则循环可能长(15)。用接近样品的薄膜电阻加热器和温度传感器，可实现10-30分钟扩增(16,17)。

尽管低蓄热系统的冷却通常通过被动热扩散和/或通过强制通风进行，但是已经开发了几种引人关注的加热方法。红外辐射可用于加热(18)，其中校准过的红外高温测量法用于温度监测(19)。或者，玻璃毛细管上的薄金属膜可用作电阻加热元件和温度传感器两者用于快速循环(20)。最后，通过电解电阻直接进行PCR溶液的焦耳加热和温度监测是可能的，并且已在毛细管中实施(21)。所有以上方法均可将热量传递给固定样品和从固定样品传递热量。

样品可物理移动至不同温度浴，或者通过具有固定温度区的通道，而不是将热量传递给静态样品和从静态样品传递热量。微流控方法已变得普及，其中PCR流体在通道内通过保持在变性、退火和延伸温度下的不同区段。在来回通过3个温度区的蛇形通道内(22)和在通过3个温度区的半径递增或递减的环路内(23)，连续流动式PCR已经证实。具有蛇形布局的变体使用静态热梯度而不是等温区，以更密切符合PCR的动力学范式(24)。为了限制对PCR必要的微通道长度，一些系统通过双向压力驱动流动(25)、气体力学(26)或电动力学力(27)在温度区之间来回穿梭样品。样品运动可使用单个圆形通道作为磁性铁磁流体(28)或通过对流(29)驱动，而不是样品的线性穿梭。微系统PCR(包括连续流动方法)的一个潜在优点为循环速度。

尽管一些微系统仍然需要> 60秒循环，但是许多微系统在快速循环PCR的20-60秒循环范围内运行(13, 30)。据报道，红外加热的最小循环时间在16-37秒范围内(18, 19)。金属包被的毛细管已经实现40秒PCR循环(20)，而直接电解加热已经用21秒循环扩增(20)。对闭环对流PCR报道的最小循环时间在24-42秒范围内(29, 31)。几个研究小组已经聚焦于将PCR循环时间减少至<20秒，快于1990年首次证实的快速循环PCR的初始定义。静态样品的薄膜电阻加热已经将循环时间减少至17秒(对于25 μl样品) (32)和8.5秒(对于100 nl样品) (17)。连续流动系统用热梯度PCR (24)和样品穿梭(26)已经实现12-14秒循环，而铁磁流体环路声称成功的PCR具有9秒循环(28)。对于各种大小PCR产物，通过玻璃和塑料基底的连续流动系统已经实现6.9秒(22)和5.2秒(23)的循环时间。通过铝基底交替进行热和冷水传导，用5.25秒循环在油下扩增1 μl液滴(33)。类似地，通过多孔铜块的水传导用4.6秒循环扩增5 μl样品(34)。通过蒸气压增强的1 μl反应塞的连续流动装置实现3秒循环(35)。另外，有报道声称通过将毛细管浸入夹在珀耳帖元件之间的镓中，用2.7秒循环扩增毛细管中大肠杆菌Stx细菌噬菌体的85 bp片段(36)。或者，通过加压的热和冷气体循环的毛细管中的PCR扩增获得2.6秒循环(48)。

表1概述使PCR循环时间最小化至少于初始定义“快速PCR”的20秒循环的工作。在过去的20年中，逐步改善循环速度的新的原型仪器已开发出来。然而，实际的PCR性能(效率和产率)通常不佳。一般来说，随着循环变得越来越短，对成功PCR的声称与以较高起始浓度使用的较低复杂性靶标(细菌、噬菌体、多拷贝质粒或者甚至PCR产物)相关联(参见例如美国专利第6210882号，其中5 ng扩增子用作起始样品)。确实，表1中列出的具有<20秒循环的研究均未使用复杂的真核生物DNA比如人DNA。模板分子的起始拷贝数通常很高(例如180000000个拷贝的λ噬菌体/μl)，使得在声称成功之前几乎不需要扩增。此外，在许多研究中缺乏无模板对照产生了关于阳性结果有效性的问题，尤其是在模板浓度高的环境中。一项仪器导向的报告广泛地聚焦于热循环装置的设计和建模，其中最终简短PCR证实使用高浓度的低复杂性靶标。已经报道了基于没有PCR样品存在的建模和测量的加热和冷却速率(高达175℃/秒) (17)。

表1

减少循环时间的一种方法为对PCR方案引入变化以放宽温度循环要求。具有较高Tm的较长引物允许较高退火温度。通过限制产物长度及其Tm，可将变性温度降低至略高于产物Tm。组合起来，较高退火温度和较低变性温度会减少成功扩增所需的温度范围。将3步循环(变性、退火和延伸)减少至2步(变性和组合退火/延伸步骤)还简化温度循环要求。减少的温度范围和2步循环两者对于表1中的研究(循环时间<20秒)均为典型的。然而，如果组合退火/延伸步骤在低于聚合酶最具活性的最佳70-80℃温度的温度下实施，则两步循环可能损害聚合酶延伸速率。聚合酶延伸速率与温度呈对数线性关系，直至约70-80℃，报道的最大值为60-120 bp/秒(50)。

甚至有方案变化时，当与对照反应相比循环时间<20秒时，扩增效率和产率通常不佳(22, 23)。这些对于更快速PCR的努力似乎以工程为主，很少关注于生物化学。随着循环时间从20秒减少至2秒，PCR产率减少并且最终消失，反映甚至对于高拷贝数的简单靶标也缺乏稳健性。

如果反应条件相容，表1中公开的各种参考文献中的仪器可适合于极端快速PCR。如本文公开的那样，聚焦于增加引物、聚合酶和Mg++的浓度允许“极端PCR”(具有<20秒循环的PCR (<10分钟内30个循环))，同时保持反应稳健性和产率。同样如本文公开的那样，聚焦于增加引物、逆转录酶的浓度并且包括糖比如海藻糖允许用于逆转录PCR (RT-PCR)的更快速逆转录(RT)。

发明概述

在本发明的一个实施方案中，提供了用于在扩增期间扩增生物样品中的靶标RNA的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含生物样品、逆转录酶、热稳定聚合酶及配置用于对生物样品扩增靶标RNA的引物的反应混合物，其中聚合酶以至少0.5 μM的浓度提供，和引物各自以至少2 μM的浓度提供；通过温育不超过5分钟将RNA逆转录成DNA，并且使用极端温度循环概况(profile)，通过在至少变性温度与延伸温度之间热循环生物样品通过多个扩增循环，通过聚合酶链式反应扩增DNA，其中每个循环在每个循环少于20秒的循环时间内完成。

本文还提供试剂盒和反应混合物。

在考虑以下优选实施方案的详述(以如目前所知的实施本发明的最佳模式为例)时，本发明的另外特征对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图简述

图1a显示用于实施极端PCR的示意图。

图1b为用于实施极端PCR并具有实时监测水浴中一个样品管的能力的说明性装置。

图1c为用于以3温度循环实施极端PCR的说明性装置。

图1d为图1b中装置的光学元件的近视图，其还显示温度参照毛细管。

图2a为将图1b的样品架位置(-----)与样品温度(——)叠加的图表。

图2b为使用图1b中显示的装置进行极端PCR的温度图。

图2c为显示用于与图2b相比使用转盘式(carousel) LightCycler (Roche)的快速循环PCR的温度图。

图3a显示极端PCR产物(-----)和快速循环PCR产物(—••—)的导数解链曲线，其中阴性对照为极端(——)和快速(— − —)循环，使用图2b的温度概况扩增。

图3b为图3a中相同样品的2% SeaKem LE琼脂糖凝胶，泳道1和8为大小标记物，泳道2和3为从30秒极端PCR生成的产物，泳道4为30秒极端PCR的无模板对照，泳道5和6为从12分钟PCR生成的产物，和泳道7为12分钟PCR的无模板对照。

图3c显示扩增图3a和3b中显示的相同产物的极端PCR温度示踪(-----)连同相同反应的实时监测(——)。

图4a显示通过温度控制增加延伸速率的极端PCR温度示踪。

图4b显示图4a的放大部分，其将图1b的样品架位置(——)与样本温度(-----)叠加。

图4c为IRL10RB的58 bp扩增子的负导数解链曲线(-dF/dT)，其中AA (——)、AG(— − —)和GG (-----)基因型得以显示。

图5a为使用极端PCR绘制聚合酶浓度与引物浓度与PCR产物浓度关系的三维图表。

图5b为图5a中使用的极端PCR温度示踪。

图5c显示来自图5a的4 μM KlenTaq聚合酶(KT POL)产物的负导数解链曲线。

图5d为显示来自图5a的在10 μM引物浓度下使用不同聚合酶浓度的极端PCR结果的琼脂糖凝胶。

图6a为在19号不锈钢管中实施的极端PCR的温度示踪。

图6b为通过图6a的极端温度循环产生的PCR产物的凝胶。

图7a为对于长(1秒)组合退火/延伸步骤的极端PCR温度示踪。

图7b为使用极端PCR对102 bp产物绘制聚合酶浓度与引物浓度与PCR产物浓度关系的三维图表。

图8a显示使用1秒组合退火/延伸步骤用于扩增226 bp产物的极端PCR温度概况。

图8b显示使用4秒组合退火/延伸步骤用于扩增428 bp产物的极端PCR温度概况。

图8c显示得自图8a的实时结果和使用2秒退火/延伸步骤(每个包括无模板对照)的类似温度示踪。

图8d显示得自图8b的实时结果和使用5秒退火/延伸步骤(每个包括无模板对照)的类似温度示踪。

图9a显示在不同起始浓度下KCNE1的45 bp片段的扩增曲线。

图9b为来自图9a数据的Cq与log10 (初始模板拷贝)的关系图。反应一式五份实施。除了显示NQO1的102 bp片段的扩增以外，图 9c-9d类似于图9a-9b。

图10a为使用极端PCR对300 bp产物(20个循环，每个循环4.9秒)绘制聚合酶浓度与引物浓度与PCR产物浓度关系的三维图表。

图10b显示使用KAPA2G FAST聚合酶和1-5秒延伸时间对500 bp合成模板进行PCR扩增的荧光与循环数目关系图。

图10c为几种KlenTaq聚合酶浓度和KAPA2G FAST聚合酶的延伸长度与最小延伸时间关系图。

图11a-11e显示用于PCR扩增以下大小的产物的荧光与循环数目关系图：100 bp(图11a)、200 bp (图11b)、300 bp (图11c)、400 bp (图11d)和500 bp (图11e)。

图12a显示使用不同镁浓度在35个极端PCR循环之后AKAP10的60 bp片段的负导数解链曲线。

图12b为在图12a的负导数解链曲线中显示的PCR产物的凝胶。

图13a显示用5 mM Mg++使用不同循环时间，在35个循环之后AKAP10的60 bp片段的负导数解链曲线。循环时间为0.32秒(——)、0.42秒(—··—)、0.52秒(— − —)和0.62秒(-----)。循环时间包括在60℃浴中保持0.1-0.4秒。

图13b为图13a的负导数解链曲线中显示的PCR产物的凝胶。

图14a显示如在以下3种不同仪器上扩增的AKAP10的60 bp片段的负导数解链曲线：(1) 极端PCR，(2) LightCycler和(3) CFX96 (Bio-Rad)。

图14b为图14a的负导数解链曲线中显示的PCR产物的凝胶。

图15a-15b显示PCR的平衡范式(图15a)和动力学范式(图15b)的说明性概况。纯黑色代表热循环期间核酸的变性，条纹代表退火和纯白色代表延伸。

图16a-16c显示双重RT-PCR方案中AKAP10和ACTB的扩增概况(图16a)、解链概况(图16b)和解链峰(图16c)。显示两次运行。

图17显示与30分钟温育时间相比，较短温育时间内的% RT。

图18为对RT步骤使用各种温度和时间的RT-PCR的PCR产物的凝胶。泳道1-3分别显示45℃温育15、20和25秒，泳道4-6分别显示47.5℃温育15、20和25秒，泳道7-9分别显示50℃温育15、20和25秒，和泳道10-11分别显示55℃温育15秒和20秒。

图19a-19b为显示使用含有海藻糖(——)和不含海藻糖(----)的iScript (图19a)以及用iScript (——)和RocketScript (----)(两者含有海藻糖) (图19b)，在各种RT温育温度下0.6 M海藻糖对RT步骤影响的图表。

图20为显示反向引物浓度伴随温育20秒(----)和60秒(——)对两步法RT-PCR影响的图表。

图21为显示RSV RNA以5000、500、50或5个拷贝(从左到右，一式三份)的一步法RT-PCR扩增的凝胶。

图22为显示温育时间为10毫秒-20秒的RT-PCR的凝胶。

图23显示使用5000个RSV RNA的初始模板拷贝以及5秒RT步骤和45个PCR循环的一步法RT-PCR的实时结果。

图24为对说明性RT步骤显示很短时间的凝胶。从左到右，阴性对照(NC)为两条左侧泳道，接下来的3条泳道为在56℃下温育0、1和5秒的冷制备样品，和最后3条泳道为室温下1分钟及在56℃下温育0、1和5秒。

图25为比较海藻糖对说明性RT步骤影响的凝胶。海藻糖组在左侧，从左到右为无模板对照、空白、温育1、2、5和10秒，随后为相同顺序的无海藻糖。

图26为显示用AMV作为酶，在42℃下用不同时间和Mg++浓度实施的一步法RT-PCR的凝胶。以3 (左上)、6 (右上)、10 (左下)和13(右下) mM MgCl₂包括Mg++，每种的RT时间为1、2、5和10秒(从左到右)。

图27为显示以0、10、20、40和75 (从左到右) mM KCl实施的说明性一步法RT-PCR方案结果的凝胶，RT步骤在42℃下持续1 (左上)、5 (右上)和10 (左下)秒。

图28为显示于42℃下，用0、10或38 mM DTT和0或40 mM KCl (如指明的那样)实施说明性一步法RT-PCR方案1秒(左上)、5秒(右上)和10秒(左下) RT温育结果的凝胶。

图29为显示MMLV浓度和RT时间对Cq影响的图表。

图30为显示AMV浓度以2秒RT反应时间对Cq影响的图表。

图31为显示MMLV和AMV浓度对Cq影响的图表，其中反应使用含有8 mM Mg++的AMV，48℃下反应时间2秒，以及反应使用含有3.8 mM Mg++的MMLV，45℃下反应时间2.5秒。

图32为显示RT温度和时间对Cq影响的图表。

图33为显示RT温度对Cq影响的图表，AMV作为RT酶。

图34为显示RT温度对Cq影响的图表，显示使用MMLV和AMV两者的结果，其中空心圆代表MMLV和实心圆代表AMV。

图35为显示Mg++浓度使用AMV和使用2秒RT反应时间对Cq影响的图表。

图36为显示Mg++浓度使用MMLV和使用2秒和5秒RT反应时间对Cq影响的图表，其中实线(实心圆形)代表2秒RT，和虚线(空心圆形)代表5秒RT。

图37为显示Mg++浓度在45℃下以1.25 U/μL使用MMLV 2秒(实心菱形)和在45℃下以0.31 U/μL使用AMV 2秒(空心方形)对Cq影响的图表。

图38为显示RT反应时间在45℃下以1.25 U/μL使用MMLV 2秒和7.4 mM MgCl₂对Cq影响的图表。

图39为显示RT反应时间在45℃下以0.31 U/μL使用AMV 2秒和11 mM MgCl₂对Cq影响的图表。

图40为组合图38-39中显示的结果的图表(AMV (空心圆形)和MMLV (实心圆形))。

图41为显示使用含有和不含Zika模板(两个左侧条)及含有和不含hRSV模板(两个右侧条)的冻结(glaciate)技术的Cq之间差异的图表。

图42为使用冻结技术比较不同冷冻和冷藏部分的图表，其中实验＃1、＃2和＃3描述于实施例26中，并且实验＃1对应于表4，实验＃2对应于表5和实验＃3对应于表6。

图43为显示使用实施例26中描述的冻结技术的温度对阳性和阴性对照的Cq影响的图表。

图44为使用人基因组DNA和快速循环PCR的适配体Trnc.2-30对阳性对照、阴性对照的Cq及其差异(ΔCq)影响的图表，其中菱形代表阴性对照的Cq，方形代表阳性对照的Cq，和三角形代表ΔCq。

图45为比较含有和不含3’-封端剂的不同DNA适配体影响的图表，其中无为无封端剂)，Phos具有3’-磷酸，和Amino在3’-末端用C6-氨基末端修饰剂修饰。

图46为显示DNA适配体浓度对Cq影响的图表，其中菱形代表阴性对照的Cq，方形代表阳性对照的Cq，和三角形代表ΔCq。

图47为显示RNA适配体浓度对Cq影响的图表，其中菱形代表阴性对照的Cq，方形代表阳性对照的Cq，和三角形代表ΔCq。

详述

本文使用的术语“一”、“一个”和“该”定义为意指一个或多个并且包括复数形式，除非上下文不合适。范围可在本文表示为“约”一个特定数值和/或至“约”另一个特定数值。术语“约”本文用于意指大约在...区域内、大致地或在其周围。当术语“约”连同数值范围一起使用时，其通过将边界延伸至高于和低于所示数值来修饰该范围。通常，术语“约”本文用于将数值修饰为高于和低于所述数值5%方差。当表示这种范围时，另一个实施方案包括从一个特定数值和/或至另一个特定数值。类似地，当数值被表示为近似值时，通过使用先行词“约”，应理解为该特定数值形成另一个实施方案。应进一步理解，范围的每个端点既相对于另一个端点是重要的，也独立于另一个端点是重要的。

本文使用的单词“或”意指特定列表中的任何一个成员，并且还包括所述列表成员的任何组合。

本文使用的过渡性短语“基本上由...组成”意指权利要求的范围解释为包括该权利要求中列举的指定材料或步骤，以及要求保护的发明的“不实质上影响基本和新颖特征的那些材料或步骤”。参见re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463(CCPA 1976) (以原文强调)，另见MPEP§2111.03。因此，当用于本发明的权利要求时，术语“基本上由......组成”不打算解释为相当于“包含”。

所谓的“样品”意指动物、来自动物的组织或器官、细胞(在受试者体内、直接取自受试者、或者保持在培养物中或来自培养细胞系的细胞)、细胞裂解物(或裂解物部分)或细胞提取物、含有一种或多种源自细胞、细胞材料或病毒材料的分子(例如多肽或核酸)的溶液、或含有天然或非天然存在的核酸的溶液，其如本文描述的那样进行测定。样品还可为含有细胞、细胞组分或核酸的任何体液或排泄物(例如(但不限于)血液、尿液、粪便、唾液、眼泪、胆汁)。

本文使用的短语“核酸”指的是天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA还是RNA还是DNA-RNA杂合体，单链还是双链，正义还是反义，其能够经沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对杂交于互补核酸。本发明的核酸还可包括核苷酸类似物(例如BrdU、dUTP、7-脱氮-dGTP)和非磷酸二酯核苷间键(例如肽核酸(PNA)或硫代二酯键)。具体地讲，核酸可包括(非限制性地) DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。

所谓的“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指可与含有互补序列的第二DNA或RNA分子(“靶标”)碱基配对的确定序列的单链DNA或RNA分子。生成的杂合体的稳定性取决于长度、GC含量、最邻近堆叠能量以及发生的碱基配对的程度。碱基配对的程度受参数比如探针与靶标分子之间的互补性程度以及杂交条件的严格性程度的影响。杂交严格性程度受参数比如温度、盐浓度和有机分子比如甲酰胺浓度的影响，并且通过本领域技术人员已知的方法确定。探针、引物和寡核苷酸可为通过本领域技术人员熟知的方法的可检测标记(放射性、荧光或非放射地)。dsDNA结合染料(当结合于双链DNA时比结合于单链DNA或在溶液中游离时发荧光更强烈的染料)可用于检测dsDNA。应该理解，“引物”被具体配置成通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸” 可能会或可能不会如此配置。

所谓的“特异性地杂交”意指探针、引物或寡核苷酸在高严格性条件下识别并与基本互补的核酸(例如样品核酸)物理相互作用(即碱基配对)，并且基本不与其他核酸碱基配对。

所谓的“高严格性条件”意指一般地发生于约解链温度(Tm)-5℃(即低于探针的Tm5°)下。功能上，高严格性条件用于鉴定具有至少80%序列同一性的核酸序列。

在说明性的实施方案中，方法和试剂盒提供给<20秒循环时间的PCR ，一些实施方案使用<10秒、<5秒、<2秒、<1秒和<0.5秒循环时间。对于这些循环时间，30个循环PCR分别在<10分钟、<5分钟、<2.5分钟、<1分钟、<30秒和<15秒内完成。随着PCR速度变得越来越快，引物或聚合酶浓度或两者均增加，从而保持PCR效率和产率。

损害PCR的3组分反应中的任何一个(引物退火、聚合酶延伸和模板变性)可能限制PCR的效率和产率。例如，如果引物仅对95%的模板退火，PCR效率不会大于95%，即使100%的模板变性和100%的引发(primed)模板延伸成全长产物。类似地，如果延伸效率仅为95%，则最大可能的PCR效率仅为95%。为了使PCR产物浓度每个循环加倍，所有组分必须达到100%完成。变性、退火和延伸将在以下段落中依序考虑。

在慢速(>60秒循环)、快速(20-60秒循环)和极端(<20秒循环) PCR温度循环中，变性不足为PCR失败的常见原因。目标为每个循环完全变性，为引物退火提供定量模板可用性。在PCR之前模板的初始变性，特别是基因组DNA，通常需要比PCR期间扩增产物变性更苛刻的条件。快速循环PCR的初始优化(4)在使模板沸腾后实施，这是确保基因组DNA初始变性的一种好方法。对于高Tm靶标可能发生初始变性不完全，特别是具有高稳定性侧翼区的那些靶标(37)。这可能损害定量PCR，说明性地对于基因组插入或缺失，特别是如果变性期间的微小温度差异影响PCR效率(37-39)。如果不期望之前沸腾或限制性消化(37)，并且较高的变性温度会损害聚合酶，那么降低产物Tm的佐剂可用于帮助变性。

尽管94℃通常用作变性的默认靶标温度，但是其很少是最佳的。PCR产物在40℃范围内解链，主要取决于GC含量和长度(43)。当PCR产物解链足够低以致可使用较低变性温度时，低变性靶标温度具有速度和特异性两者优点。变性温度越低，样品可达到变性温度越快，并且可实施更快速PCR。消除所有具有较高变性温度的潜在产物会增加特异性，因为这些潜在产物将保持双链并且不能用于引物退火。为了扩增高Tm产物，靶标温度可能需要增加至高于94℃。然而，当前大部分热稳定聚合酶在高于97℃开始变性，并且PCR溶液可能在95℃(或更低)和100℃之间沸腾，这取决于海拔高度，因此没有太多空间来增加温度。降低单价盐和Mg++浓度会降低产物Tm。类似地，掺入dUTP和/或7-脱氮-dGTP还降低产物Tm，但是可能降低聚合酶延伸速率。大部分专有PCR“增强剂”为简单有机物，其降低产物Tm，使得高Tm产物能够变性(和扩增)。其中最普及的为DMSO、甜菜碱、甘油、乙二醇和甲酰胺。除了降低Tm，这些添加剂中的一些还会升高PCR混合物的沸点(在高海拔地区特别有用)。随着增强剂浓度增加，产物Tm降低，但是聚合酶抑制作用可能增加。

然而，甚至在极端循环条件下变性也不需要速率限制，因为甚至当温度仅略高于产物Tm时DNA解旋为一级反应并且很快速(10-100毫秒)。变性在高于扩增产物Tm 2-3℃下发生如此快速，以致难以测量，但是扩增子完全变性可能发生于少于0.1秒内。如果产物在多个结构域解链，靶标变性温度应高于最高解链结构域2-3℃。只要样品达到该温度，甚至是对于长产物变性也很快速。使用毛细管和水浴(40)，在少于1秒内发生高于20 kB PCR产物的完全变性(52)。产物Tm和解链结构域用DNA染料和高分辨率解链说明性地实验确定(41)。尽管Tm估计可通过软件预测获得(42)，但是其准确性有限。此外，观察到的Tm强烈取决于局部反应条件，比如盐浓度及任何染料和佐剂的存在。因此，观察到的Tm通常与反应条件更好地匹配。

在对效率没有任何影响的情况下，接近变性的速率可以尽可能快，例如200-400℃/秒，如图2a和6a中显示的那样。在这些速率下，达到变性温度仅需要约0.1-0.2秒。然而，接近靶标温度时的速率较慢降低超过靶标温度的风险，并且避免可能的聚合酶失活或溶液沸腾。实现较慢接近温度的一种说明性方法为将样品浸没在超过靶标温度5-10℃的热浴中。靶标温度与浴温之间的温度差异确定随着差异减少而自动减慢的指数趋近曲线。通过连续监测温度，当达到变性靶标时触发下一个阶段(朝着退火冷却)。总之，在高于产物最高解链结构域温度2-3℃的温度下，PCR中的完全产物变性需要<0.2秒，并且可以尽可能快速地接近变性温度，说明性地以40-400℃/秒。因为变性为一级反应，其速率仅取决于产物浓度，并且效率(或变性产物的百分比)与产物浓度无关。

不完全和/或误导的引物退火可能会导致PCR不佳。如果不是所有模板位点被引发，则结果是效率低。此外，如果引发发生在不期望的位点，则可能产生替代产物。目标为基本上每个循环仅对期望的位点进行完全引物退火，为聚合酶延伸提供定量引发模板。

具有20-60秒循环的快速PCR方案表明，在低于Tm 5℃下，用500 nM引物的退火时间<1秒(52)。用于试图进行<20秒循环的仪器的引物浓度范围为每种200-1000 nM (表1)。这些浓度类似于其中使用长退火时间的常规PCR (>60秒循环)中使用的那些浓度。通常使用降低引物浓度来改善特异性，并且由于担心非特异性扩增而很少考虑增加引物浓度。然而，对于快速循环，特异性改善归因于退火时间较短(5)。如果这种趋势持续，则预计极端PCR的很短退火时间应容忍高引物浓度。为了促进退火，对于20-60秒循环推荐退火温度低于引物Tm 5℃。通过在用于扩增的相同缓冲条件下使用饱和DNA染料和寡核苷酸进行解链分析，来最佳地实验测量Tm。引物与其具有5’-延伸作为悬挂端的互补靶标组合，以最佳地接近对其模板退火的引物的稳定性，并且实施解链分析。

与变性形成对比，退火效率取决于引物浓度。引物退火可在很快速循环速度下成为限制。引物退火为取决于引物和靶标浓度两者的二级反应。然而，在大部分PCR期间，引物浓度比靶标浓度高得多，退火为有效的伪一级反应并且仅取决于引物浓度。在这种情况下，引发的产物部分(退火效率)仅取决于引物浓度而不取决于产物浓度，使得较高引物浓度应允许较短退火时间。此外，不受理论的束缚，据信关系为线性的。随着退火时间变得越来越短，增加引物浓度对于保持PCR的效率和产率变得必要。例如，快速循环使得允许在低于引物Tm 5℃的温度下退火约1-3秒(3)。如果在极端PCR中这种退火时间(在或低于Tm-5℃)减少至1/10，那么预计具有类似的引发效率，条件是引物浓度增加至10倍。随着可用退火时间变得越来越短，应使引物浓度越来越高大约相同的倍数。典型的快速PCR方案使用每种引物500 nM。如果极端PCR中的退火时间减少至1/3-1/40，则获得相同引发效率所需的引物浓度为每种引物1500-20000 nM。这相当于3000-40000 nM总引物，高于表1中的任何引物浓度。这表明，在<20秒循环下的之前尝试中效率不佳的一个原因是由于引物浓度不足导致的退火效率不佳。在极端PCR中，尽管退火时间为0.05-0.3秒，但是引物浓度每种增加至1.5-20μM以获得极好的退火效率。对于甚至更短的退火时间可考虑比以往更大的引物浓度，以使用增加的引物浓度来抵消减少的退火时间，从而获得相同退火效率。注意到大部分商业仪器需要至少1秒的保持时间，而少数仪器允许保持时间为“0”秒，但是没有商业仪器允许保持时间为小数秒。对于极端PCR的一些说明性实例，可期望保持时间的增量为0.1或0.01秒。

增加退火速率和缩短退火时间而不损害效率的另一种方法为增加离子强度，说明性地通过增加Mg++浓度。本领域已知退火速率随着离子强度增加而增加，并且二价阳离子对于增加杂交速率(包括引物退火)特别有效。

说明性地，接近退火靶标温度的速率可以尽可能快。例如，以200-800℃/秒(图2a和6a)，退火温度可在0.05-0.2秒内达到。快速冷却还可使全长产物再杂交最小化。就在冷却期间形成双链扩增产物而言，PCR效率因为引物不能对双链产物退火而减少。尽管这在PCR早期很少见，但是随着产物浓度增加，在冷却期间形成越来越多的双链。用SYBR®Green I进行连续监测表明，这种产物重新退火可能是PCR平台期的主要原因(44)。

聚合酶延伸还需要时间并且当延伸时间短时可能限制PCR效率。已知较长产物在PCR期间需要较长延伸时间，并且在PCR结束时通常附加几分钟的最终延伸，可能是为了完成所有产物的延伸。长产物的通常做法为延长延伸时间。使用较低延伸温度进一步增加所需时间，如在两步法循环的某些情况下，其中引物退火和聚合酶延伸在相同温度下实施。

为了获得最佳PCR效率，每个循环需要引发模板的基本上完全延伸。大部分聚合酶延伸速率随着温度而增加，至高达一定的最大值。对于Taq聚合酶，在75-80℃时最大值为约100个核苷酸/秒，并且温度每减少10℃其会减少至约1/4(50)。对于536 bp的β-球蛋白产物，在快速循环PCR中发现76℃为最佳(4)。最近引入了更快速聚合酶，商业上声称其可减少总体PCR时间，表明其可能能够消除或缩短较长产物的延伸保持时间。

作为更快速聚合酶延伸速率的替代或补充，已经发现增加聚合酶浓度减少所需的延伸时间。假定PCR中的标准Taq聚合酶浓度(0.04 U/µl)或1.5 nM (49)和每种引物500nM，如果每种引物连接于模板，则聚合酶一次仅足够延伸0.15%的模板，需要将聚合酶一遍又一遍地再循环至新引发模板以使其全部延伸。通过增加聚合酶浓度，可同时延伸更多可用的引发模板，减少延伸所有模板所需的时间，可能不是通过较快速延伸速率，而是通过在任何给定时间延伸较大比例的引发模板。

大致上，对于小PCR产物(<100 bp)，所需的聚合时间似乎与酶的聚合速率(本身为温度的函数)和聚合酶浓度成正比。所需的时间也与待延伸的模板长度(产物长度减去引物长度)成反比。通过增加聚合酶活性为PCR中0.04 U/μl的标准活性的20-300倍，<20秒循环的极端PCR可导致高产率的特定产物。也就是说，0.8-12 U/μl (1-16 µM的KlenTaq)的活性使得能够实现两步法极端PCR，其中组合退火/延伸时间为0.1-1.0秒。先前使用的最高聚合酶活性为0.5 U/μl (表1)。对于在极端PCR的说明性实例中使用的两步法PCR，在70-75℃下的组合退火/延伸步骤有利于较快速聚合速率。此外，因为其简化温度循环，所以在极端循环(<20秒循环)的说明性实例中一般地使用两步法PCR，并且在组合退火/延伸步骤期间必须发生快速退火和快速延伸两者。因此，在说明性实例中使用增加的引物浓度和增加的聚合酶浓度两者，导致在极端双温度循环下稳健的PCR。说明性地，每种引物浓度为1.5-20 μM和聚合酶浓度为0.4-12 U/μl的任何标准聚合酶(0.5-16 µM的KlenTaq)对于在50-75℃下组合退火/延伸时间为0.05-5.0秒是必要的，如随后的实施例中说明的那样。因为对于退火和延伸两者仅有一个PCR循环区段，所以极端PCR条件需要增强两个过程，说明性地通过增加引物和聚合酶两者的浓度。

还设想极端三温度循环，其中退火和延伸步骤在不同温度下单独保持。在这种情况下，分配给退火和延伸步骤的时间可单个控制并且根据具体需要调整。例如，如果仅有退火时间短(0.05-0.2秒)并且延伸时间保持较长(说明性地为1、2、5、10或15秒)，则为了有效PCR仅需要增加引物浓度。或者，如果延伸时间短(在70-80℃内<1秒)，但是退火时间长，据信仅需要增加聚合酶浓度以获得有效PCR。应该理解，有效PCR具有至少70%的说明性效率，更具说明性地为至少80%，和最具说明性地为至少90%，在许多情况下可实现> 95%的效率。

对于长度超过100 bp的产物，使用极端PCR的有效延伸可能需要高聚合酶浓度和增加的延伸时间的组合。如果聚合酶过量，说明性的最短时间应为以碱基为单位的延伸长度(定义为产物长度减去引物长度)除以以碱基/秒为单位的聚合酶延伸速率。然而，如先前指出的那样，在模板浓度增加至大于聚合酶浓度之前，聚合酶通常仅在PCR开始时饱和。减少循环时间的一种方法为在聚合酶最高温度附近使用双温度PCR，一般地为70-80℃。所需的延伸时间可使用实时PCR和监测定量循环或Cq来实验确定。例如，在75℃下，于100个碱基/秒的聚合酶延伸速率下，如果聚合酶浓度过量，则200 bp产物预计需要约2秒。类似地，只要其浓度大于待延伸的模板，使用这种相同聚合酶预计400 bp产物需要约4秒。如果聚合酶不是过量，则加入更多聚合酶允许更多模板能够同时延伸，与聚合酶浓度成比例地减少所需的延伸时间。

任何DNA分析方法的实用性取决于其实施有多快，获得多少信息以及操作难度如何。与常规克隆技术相比，PCR快速且简单。快速循环和极端PCR聚焦于持续减少所需的时间。实时PCR通过每个循环获取数据来增加信息内容。解链分析可在PCR期间或之后实施，以随着温度增加而连续监测DNA杂交。

返回到PCR的平衡和动力学范式(图15a-15b)，产物<100 bp的极端PCR例证了动力学模型的良好应用。温度总是在改变，并且变性、退火和延伸的速率取决于温度，因此只有通过整合组分反应在整个温度范围内的速率才能获得足够的PCR评价。对于大于100 bp的产物，较长延伸时间可能是必要的，并且动力学模型和平衡模型两者的组分均是合适的。

当根据本文的至少一个实施方案配置反应条件时，已经发现PCR可以很快速率实施，说明性地对于一些实施方案在少于1分钟内完全扩增，其中循环时间少于2秒。说明性地，增加聚合酶和引物浓度的各种组合用于这种极端PCR。不受任何特定理论的束缚，据信过量的引物浓度将通常允许完全引物退火，从而提高PCR效率。同样不受任何特定理论的束缚，据信通过允许更完全延伸，增加聚合酶浓度改善PCR效率。增加聚合酶浓度有利于结合于退火引物，并且如果聚合酶在完全延伸之前脱落还有利于重新结合。以下实例显示，即使用复杂的真核基因组DNA和单拷贝靶标开始，极端PCR也是成功的。

尽管在随后的实施例中使用了KlenTaq，但是考虑到聚合酶延伸速率，相信任何类似活性的热稳定聚合酶在极端PCR中将以类似的方式实施。例如，Herculase、Kapa2G FAST、KOD Phusion、天然或克隆栖热水生菌(Thermus aquaticus)聚合酶、Platinum Taq、GoTaq和Fast Start为聚合酶的商业制剂，当以这里呈现的增加的浓度使用时应使得能够进行极端PCR，说明性地针对酶活性速率的差异进行调节。

因为当前的商业PCR仪器不允许两个第二循环时间，因此建立了系统4以测试极端PCR的概念验证。然而，应该理解，系统4为说明性的，可快速热循环的其他系统处于本公开的范围内。如图1a中显示的那样，95.5℃的热水浴10 (Salt Lake City, UT的沸水温度,实施本实施例的位置)和30-60℃的冷水浴14用于改变样品容器20中含有的1-5 μl样品的温度。说明性的水浴10、14为4.5夸脱不锈钢敷料罐(Lab Safety Supply, #41634)，但是在一些实例中使用500 ml玻璃烧杯，并且伴随磁力搅拌在电热板12、16上加热(FisherScientific Isotemp Digital Hotplates (#11-300-49SHP)。然而，应该理解，可使用其他实施方案来加热和冷却样品。在图1a中显示的实施方案中，样品容器20为复合玻璃/塑料反应管(BioFire Diagnostics #1720, 0.8 mm ID和1.0 mm OD)。然而，在其他实例中，皮下注射针(Becton Dickenson #305187, 0.042” ID, 0.075” OD)和由不锈钢管构成(SmallParts, 0.042” ID/0.075” OD, 0.035” ID /0.042”OD或0.0265”ID/0.035”OD)并装配到BioFire管的塑料顶部中的复合不锈钢/塑料反应管用作样品容器20。尽管其他样品容器处于本发明的范围内，但是期望样品容器具有大的表面积-体积比率和具有快速传热速率。对于某些实施方案，金属管的开口端通过使用气体火焰加热至红白色并以夹钳进行压制来密封。对于实时PCR，期望管为光学透明或具有光学透明部分。通过短暂离心将样品旋转至每个管的底部。

样品容器20通过经臂21连接于步进电机轴26的管架22保持。管架22由黑色Delrin塑料机加工以保持2-5个样品容器20 (图1a中仅可见一个样品容器20，但是可存在一排这种样品容器20)，使得反应溶液保持在半径6.5-7.5 cm。尽管图1a中不可见，但是可使用热电偶(Omega T型精密细丝热电偶#5SRTC-TT-T-40-36, 36”导线，0.003’直径，具有Teflon绝缘)来测量温度。参照图1d，其显示图1b的类似管架和臂，其中相同数字代表类似组件，存在被设计保持两个样品容器的管架222，管架222中的一个位置由热电偶228占据。应该理解，如图1d中显示的那样，任何数目的样品容器20或220可用于本文描述的任何实施方案中(具有或不具有热电偶)。热电偶放大和线性化用Analog Devices AD595芯片(未显示)实施。首先将AD595输出的热电偶电压计算为T型电压=(AD595输出/247.3)-11 μV。然后，对于T型热电偶的电压/温度相关性，使用美国国家标准与技术研究院(National Institute ofStandards and Technology)系数将热电偶电压转换为温度。模拟信号被数字化(PCIe-6363采集板)，并用安装在CPU 40上的LabView软件(版本2010，National Instruments)处理且在用户界面42上查看。说明性地，步进运动在87-92℃和60-75℃下动态触发，或者可在每个水浴中保持一段计算机控制的时间。一般地实施30-50个循环。

步进电机24 (Applied Motion Products, #HT23-401, 3V, 3A)位于水浴10和14之间，使得管架22中的所有样品容器20可在每个水浴10和14之间翻动，从而含有样品的每个样品容器20的部分被完全浸没。说明性地，步进电机24由4SX-411 nuDrive (NationalInstruments，未显示)供电，并且用安装在CPU 40上的PCI-7344运动控制器和NI-Motion软件(版本8.2，National Instruments)控制。步进电机24在约0.1秒内，在水浴10和14之间旋转。图2a显示对于其中步进运动在90℃和50℃下被触发的运行，在样品容器20的位置示踪(——)上并置的样品温度示踪(-----)。如图2a中可见的那样，温度低于50℃会出现一些过冲，可能是由于将样品容器20移出水浴14所需的时间所致。因此，如以上讨论的那样，可能期望以稍微较高的温度触发步进电机24。在以下实例中，给出的温度为达到的样品温度而不是触发温度。从图2a计算的最大加热速率为385℃/秒和最大冷却速率为333℃/秒。说明性地，极端PCR可以至少200℃/秒的升降温速率实施。在其他实施方案中，升降温速率可为300℃/秒或者更大。

在一些实例中，系统4还被配置用于实时监测。如图1a中显示的那样，为了实时监测，光学装置25的光纤末端50安装在样品容器20上方，使得当样品容器20通过步进电机24从热水浴10向冷水浴移动时，样品容器20经过光纤末端50 (有或没有保持在该监测位置)。在该说明性实施方案中，光纤末端提供在水浴上方的空气中。热循环装置4可通过CPU 40控制并在用户界面42上查看。

图1b显示类似于图1a的实施方案。提供热板212和216用于控制热水浴210和冷水浴214的温度。提供步进电机224用于通过移动臂221和管架222 (说明性地由铝制成)来移动样品容器220和热电偶228 (显示在图1d中)。然而，在该实施方案中，光纤电缆252的末端250通过定位装置254保持在水浴214中。光纤电缆252通过端口248进入水浴214，并向光学装置225提供信号。热循环装置204可通过CPU 240控制并在用户界面242上查看。

来自Ocean Optics LLS-455 LED Light Source 256的光通过光纤光缆252(Ocean Optics P600-2-UV-VIS, 纤芯直径600 µm)引导至具有440 +/- 20 nm激发干涉滤光片、分束458 nm二向色滤光片和490 +/- 5 nm发射滤光片(全部来自Semrock, 未显示)的Hamamatsu Optics Block 258。当定位于较冷水浴中时，用另一个光纤电缆(未显示)实现毛细管的落射荧光照明，所述另一个光纤电缆置于距一个样品毛细管大约1-2 mm远并与其成直线。发射检测用Hamamatsu PMT 62。

图1c显示用于三温度PCR的说明性系统304。95.5℃的热水浴310、30-60℃的冷水浴314和70-80℃的中温水浴313用于改变样品容器320中含有的1-5 μl样品的温度，并且伴随磁力搅拌在3个电热板312、316和318上加热。样品容器320通过经臂321连接于步进电机324的管架322保持。热电偶328也通过管架322保持。臂321可随着步进电机324旋转而升高。光纤末端350说明性地提供在中温水浴313中，但是应该理解其可置于空气中，与图1a一样。由于该说明性实施方案的设置，不可能彼此等距放置3个水浴310、313和314。因此，最大空间被置于热水浴310与冷水浴314之间，因为期望在这些浴之间冷却样品，而样品在其他水浴之间移动以被加热。然而，应该理解，这种配置仅为说明性的，并且其他配置处于本公开的精神范围内。因为两个步进电机同时使用(一个将毛细管从水中提出来和一个在水浴之间转移)，每个的角向运动可最小化以减少水浴之间的移动时间。在2水浴系统中，步进器在浴之间转移样品所需的角向运动大于270度。然而，在3水浴系统中，升高样品的步进电机需要横越少于45度，而步进器在水浴之间移动样品需要仅移动90度或者更少。水浴还可配置为圆形的扇形(饼形楔形)以进一步限制所需的角向运动。最小化角向运动减少水浴之间的转移时间。设想转移时间少于100毫秒或者甚至少于50毫秒。该系统304的其他组件类似于图1a-b中显示的和图1c中未显示的系统4、204。还设想扩展为 4水浴系统。第4个水浴的用途包括确保冷启动以限制初始PCR变性之前的延伸量的冰水浴，以及用于PCR (RT-PCR)之前的逆转录的37-56℃的水浴。如果需要冷启动和逆转录两者，则可使用5水浴系统。

实施例

实施例1

除非另外指明，否则PCR以5 μl反应体积实施，所述反应体积含有50 mM Tris (pH8.3, 在25℃下)、3 mM MgCl₂、200 μM每种dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)、500 μg/ml非乙酰化牛血清白蛋白(Sigma)、2% (v/v)甘油(Sigma)、50 ng纯化的人基因组DNA和1XLCGreen® Plus (BioFire Diagnostics)。引物和聚合酶的浓度根据具体实验方案而变化。Klentaq1TM DNA聚合酶得自AB Peptides, St.Louis, MO，或得自WashingtonUniversity的Wayne Barnes (St. Louis)。如从序列计算的那样(美国专利第5436149号)，KlenTaq的分子量为62.1 kD，280 nm处的消光系数为69130 M-1cm-1。质谱确认主要分子量为62 kD，并且变性聚丙烯酰胺凝胶显示通过整合，主要带纯度大于80%。使用吸光度和纯度来计算浓度表明为在10%甘油中的80 μM储备液。最终聚合酶浓度一般地为0.25-16 μM。1 μM KlenTaq相当于0.75 U/μl，其中一个单位定义为在72℃下用激活的鲑鱼精子DNA于30分钟内合成的10 nmol产物。引物由University of Utah中心设施合成，脱盐，并且浓度通过A260确定。每种引物的最终浓度一般地在2.5-20 μM变化。

KCNE1的45 bp片段使用引物CCCATTCAACGTCTACATCGAGTC (SEQ ID NO:1)和TCCTTCTCTTGCCAGGCAT (SEQ ID NO:2)自人基因组DNA扩增。引物包含变体rs#1805128(c.253G>A)并扩增以下序列：CCCATTCAACGTCTACATCGAGTCC(G/A)ATGCCTGGCAAGAGAAGGA(SEQ ID NO:3)。

图3a显示使用图1a中显示的装置，通过极端PCR产生的PCR产物的解链曲线，其中使用0.64 μM KlenTaq和10 μM每种引物，并如图2b中显示的那样在91℃-50℃之间循环35个循环并且总扩增时间为28秒。每个循环需要0.8秒。图3a中还显示通过在LightCycler中快速循环产生的相同扩增子的解链曲线，其中使用0.064 μM KlenTaq和0.5 μM每种引物，并在90℃-50℃之间循环35个循环并且总扩增时间为12分钟(图2c)。每个循环需要10.3秒。注意到由于图2b和2c中的时间标度不同，图2b的整个极端PCR方案在其对应的快速循环PCR的少于2个循环内完成。两者反应均产生在凝胶电泳上具有类似Tm和强带的扩增子(图3b)，而通过解链分析或凝胶电泳，阴性对照均未显示扩增。在该说明性实例中，当在凝胶上分析时，极端PCR条件显示比快速循环PCR条件更大的产率(图3b)。据信解链曲线上Tm的0.5℃差异是由于每个反应中甘油的量不同，这是由于聚合酶储存缓冲液中的甘油含量引起的(在极端条件下PCR中的最终甘油浓度为1.3%和在快速条件下为0.1%)。图3b还确认扩增子的大小类似，正如预测的。另外，尽管聚合酶和引物浓度高，但是反应似乎为特异性的，没有表明非特异性产物。然而，高分辨率解链分析不能区分3种基因型。聚合酶对总引物浓度的化学计量百分比对于极端PCR为3%和对于快速循环PCR为6.4%。

45 bp KCNE1反应的实时监测使用1 μM聚合酶、10 μM每种引物和1.3%甘油实施。使用图1a的装置在两个水浴之间的空气中监测每个循环的样品。封闭室空气温度保持在70℃，并且每个循环查询(interrogate)样品0.2秒。如通过温度参照毛细管测量的那样，样品在60-90℃之间循环，如图3c中显示的那样。由于增加了用于定位和测量的时间，循环时间从0.8秒增加至1.12秒。因此，50个循环在56秒内完成。扩增因约30个循环时或约34秒后的荧光增加而明显(图3c)。当样品在空气中用于测量时，温度保持在接近60℃来限制聚合酶的延伸速率。

如图3c中见到的那样，该反应具有约25个循环的定量循环(Cq)，但是似乎直至至少50个循环才能达到平台期。同样，因为反应在64个循环之后停止，所以可能的是，扩增子的数量可能会持续增加，并且直至显著更晚时才能达到平台期。不受理论的束缚，相信增加引物浓度允许改善产率并延迟平台期，说明性地在Cq之后20个循环，和更具说明性地在Cq之后25或者更多个循环。

实施例2

在该实施例中，包含白细胞介素10β受体中A>G变体(rs#2834167)的58 bp片段用引物CTACAGTGGGAGTCACCTGC (SEQ ID NO:4)和GGTACTGAGCTGTGAAAGTCAGGTT (SEQ ID NO:5)扩增，以产生以下扩增子：CTACAGTGGGAGTCACCTGCTTTTGCC(A/G)AAGGGAACCTGACTTTCACAGCTCAGTACC (SEQ ID NO:6)。极端PCR使用图1a中显示的仪器，如在实施例1中描述的那样实施。使用1 μM聚合酶、10 μM每种引物和1.3%甘油(聚合酶对总引物百分比=5%)。为了将用于聚合酶延伸的温度增加至70-80℃，此时聚合酶具有较高延伸速率，使用不同定位方案。在达到退火温度之后，将样品转移至热水浴中直至达到延伸温度，而不是立即定位于空气中用于监测。然后使样品定位于热水浴正上方的空气中，产生图4a和4b显示的温度循环，并使得能够在70-77℃之间的最佳温度下进行较快速聚合酶延伸。通过极端PCR使用0.97秒循环扩增3种不同基因型的每一种，在38秒内完成39个循环。在极端PCR之后，在经改良接受LC24毛细管的HR-1仪器上获得每种基因型的高分辨率解链曲线。图4c揭示，如所预计的那样，所有3种基因型均被扩增和区分。

实施例3

除了聚合酶和引物的量以及明显引起图3a中所见的Tm改变的甘油浓度的微小差异以外，实施例1中的反应混合物对于极端PCR和快速循环PCR两者均相同。在这个和所有之后的实施例中，甘油浓度保持在2% (根据需要通过均衡其浓度)。对于极端PCR使用1 μM聚合酶和10 μM每种引物，而对于快速循环PCR使用0.064 μM聚合酶和0.5 μM每种引物。如以上讨论的那样，据信较快退火时间提供改善的引物特异性。用这种改善的特异性，可使用增加的引物浓度，据信这有利于引物结合并允许减少退火时间。类似地，增加聚合酶浓度有利于结合于退火引物，并且如果聚合酶在完全延伸之前脱落还有利于重新结合于不完全扩增子。另外，由于聚合酶浓度较高，甚至在PCR后期也可立即延伸较大比例的引发模板，减少单个聚合酶必须延伸的模板数目和减少总体延伸时间。

图5a概述用各种聚合酶和引物浓度进行极端PCR循环的结果。在该实施例中，用引物GGGAGTCACCTGCTTTTGCC (SEQ ID NO:7)和TACTGAGCTGTGAAAGTCAGGTTCC (SEQ ID NO:8)和3 mM MgCl₂扩增白细胞介素10β受体的49 bp片段，以产生：GGGAGTCACCTGCTTTTGCCAAAGGGAACCTGACTTTCACAGCTCAGTA (SEQ ID NO:9)。对于每种极端PCR反应，使用图1b中显示的装置而没有实时监测。温度在90℃-63℃之间循环35个循环，总反应时间略低于26秒(0.73秒循环)，如图5b中显示的那样。除了聚合酶和引物的量变化以外，反应条件如实施例1中讨论的那样，如图5a中显示的那样。图5a中的垂直轴被量化为解链曲线的负导数曲线的峰值，其在HR-1仪器上未经归一化而获得。在0.5 μM聚合酶下，于任何引物浓度水平下都几乎没有见到扩增。然而，在1.0 μM聚合酶下，于引物浓度为5 μM及更高时见到可辨别的扩增水平。随着聚合酶水平增加，扩增子的量也增加，至高达约4 μM的水平。在8 μM聚合酶下，扩增子的量会取决于引物浓度而达到平台期或下降，在较低引物浓度下于16 μM时显著下降。似乎对于49 bp产物在这些极端温度循环条件下，聚合酶具有在约1-8 μM之间，并且更具体地讲在2-8 μM之间的有利浓度范围，这取决于引物浓度。

类似地，用2.5 μM的引物浓度几乎见不到扩增。然而，在5 μM引物下扩增为成功的，KlenTaq浓度为2-8 μM，并且随着浓度增加扩增持续改善。用约10-20 μM引物的引物浓度实现了极好扩增。图5c显示在4 μM KlenTaq下各种引物浓度的解链曲线，而图5d验证当聚合酶浓度变化而引物浓度保持在10 μM时产物的大小。尽管聚合酶和引物浓度高，但是未见非特异性扩增。

不受理论的束缚，似乎酶的量与引物的量之间的比率对于极端PCR循环是重要的，条件是两者均高于阈值量。注意到以上量为基于每种引物提供。假定聚合酶结合于成双链的引物中的每一种，总引物浓度可能是最重要的。对于KlenTaq，合适的比率为0.03-0.4(对于总引物浓度为3-40%酶)，对于极端PCR，说明性的最小KlenTaq浓度为约0.5 μM，并且更具说明性地为约1.0 μM。对于不对称PCR，引物可以等摩尔量提供，或者可以过量提供。最佳聚合酶:引物百分比也可取决于温度循环条件和产物大小。例如，标准(慢)温度循环通常使用低得多的聚合酶:引物百分比，一般地为1.5 nM (0.04 U/μl)聚合酶(49)和1000 nM总引物浓度，百分比为0.15%，低至小于对极端PCR有效的百分比的1/10。

实施例4

在19号钢制皮下注射针中用8 μM聚合酶和20 μM每种引物扩增与实施例3中相同的PCR靶标，以增加传热和循环速度。聚合酶:总引物百分比为20%。扩增在图1b的仪器上实施，并使用每个0.46秒的35个循环在16秒内完成(图6a)，循环在91℃与59-63℃之间进行。循环期间的最大加热速率为407℃/秒和最大冷却速率为815℃/秒，证实PCR可在升降温速率大于400℃/秒时发生(无需保持)。在4% NuSieve 3:1琼脂糖凝胶上分析产物揭示出正确大小的强特异性带(图6b)。无模板对照显示在49 bp处没有产物，但是确实显示出与阳性样品类似的显著引物带。

实施例5

NQO1基因的102 bp片段使用引物CTCTGTGCTTTCTGTATCCTCAGAGTGGCATTCT (SEQID NO:10)和CGTCTGCTGGAGTGTGCCCAATGCTATA (SEQ ID NO:11)及图1b的仪器(没有实时组件)进行扩增。聚合酶浓度在0.25-4 μM之间变化，而每种引物浓度在0.5-8 μM之间变化。引物被设计为在较高温度(低于70s)下退火，使得组合退火/延伸阶段的延伸将处于更适合聚合酶的理想温度下。预计在这些温度下聚合速率较大使得能够扩增较长产物。较冷水浴控制在72℃下，并且退火/延伸阶段的结束根据时间(1秒)而不是温度触发。使用1.93秒循环，在72-90℃之间循环30个循环需要58秒(图7a)。如图7a中见到的那样，当样品穿过空气进入热水浴时，其温度下降比退火/延伸温度低约3℃。图7b通过如图5a中那样量化解链曲线显示扩增的产物量。解链曲线分析仅显示Tm 84℃的单一产物。在0.25 μM聚合酶或1 μM每种引物下观察到很少产物。一些扩增在2 μM每种引物下发生，在2-4 μM聚合酶和8 μM每种引物下具有最佳扩增。在2-4 μM引物浓度下，产率随着聚合酶浓度增加而减少，但是这在8 μM引物浓度下未见到。尽管热循环和靶标长度不同于实施例3，但是最佳扩增发生于聚合酶:总引物浓度为3.1-50%。

实施例6

使用图1b中显示的仪器(伴随实时监测)，极端PCR用于扩增BBS2基因的135 bp和337 bp片段。为了研究产物长度对极端PCR的影响和控制不同引物可能的混杂效应，片段首先使用具有共同5’-末端延伸的引物自基因组DNA扩增。对于135 bp片段，引物为ACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAAATTCAGTGGCATTAAATACG (SEQ ID NO:12)和GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAACCAGAGCTAAAGGGAAG (SEQ ID NO:13)。对于337 bp片段，引物为ACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAAAGCTGGTGTCTGCTATAGAACTGATT (SEQ ID NO:14)和GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAGTTGCCAGAGCTAAAGGGAAGG (SEQ ID NO:15)。在自基因组DNA进行标准PCR扩增之后，引物和dNTP通过ExoSAP-IT (Affymetrix, CA)降解，随后使用QuickStep™ 2 PCRPurification Kit (Catalog #33617, Edge BioSystems, Gaithersburg, MD)进行PCR产物纯化。将PCR产物稀释大约100万倍，并通过均衡经标准实时PCR获得的Cq而调节至相同浓度，以获得25个循环的Cq (大约10000个拷贝/10 μl反应物)。

使用共同引物ACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAAA(SEQ ID NO:16)和GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAA (SEQ ID NO:17) (每种2 μM)和用2 μM聚合酶和2%甘油，以总体积5 μl对1000个拷贝的扩增模板实施极端PCR。135 bpBBS2片段导致需要延伸176或185个碱基(取决于引物)的226 bp产物，而337 bp BBS2片段导致需要延伸378或387个碱基的428 bp PCR产物。在琼脂糖凝胶上并通过解链分析验证特异性扩增。用于226 bp产物的极端PCR温度概况显示在图8a中，其包括在75℃下1秒组合退火/延伸和在87℃下变性。同样在相同温度下(示踪未显示)实施2秒退火/延伸阶段。图8c中显示这些扩增的实时PCR结果，揭示1秒延伸与2秒延伸相比，约5个循环向更高Cq的改变，可能反映效率随着延伸时间减少而降低。用于428 bp产物的极端PCR温度概况显示在图8b中，显示75℃下4秒组合退火/延伸和87℃下变性。同样在相同温度下(示踪未显示)实施5秒退火/延伸阶段。图8d中显示这些扩增的实时PCR结果，揭示4秒延伸与5秒延伸相比，约2个循环向更高Cq的改变，可能反映效率随着延伸时间减少而降低。

实施例7

使用2 μM KlenTaq和 NQO1的8μM每种引物及8 μM KlenTaq和KNCE1的20 μM每种引物，使用人基因组DNA的系列稀释物，使用图1b的实时仪器对实施例5的NQO1的102 bp片段和实施例1的KCNE1的45 bp片段评价PCR的定量性能。如图9a和9b中见到的那样，动态范围为至少4个十进位，从标准曲线计算的扩增效率对于NQO1是95.8%和对于KCNE1为91.7%。无模板对照反应在50个循环之后不扩增，并且单拷贝复制(平均拷贝数为每个反应1.5个拷贝)在扩增曲线形状和强度方面类似于较高浓度(图9a和9c)。在平均拷贝数为0.15个拷贝/反应的情况下，17个中的2个反应为阳性(组合NQO1和KCNE1试验两者)，通过二项展开式计算的期望值为0.13个拷贝/反应。

实施例8

使用实时PCR对于不同产物长度所需的延伸时间(图10a-c)。为了控制不同引物可能的混杂效应，使用以下共同高Tm (77℃)引物合成100-500 bp的模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCC (SEQ ID NO:18)和GCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(SEQ ID NO:19)。

合成模板序列为：

100 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCGGATGGATTGTGAAGAGGCCCAAGATACTGGTCATATTATCCTTTGATCTAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:20)。

200 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTCAATGCTGACAAATCGAAAGAATAGGAATAGCGTAATTACTAGAGGACTCCAATATAGTATATTACCCTGGTGACCGCCTGTACTGTAGGAACACTACCGCGGTTATATTGACAGCTTAGCAATCTACCCTGTTGGGATCTGTTTAAGTGGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:21)。

300 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCCCTTCGAATATAAAGTACGACATTACTAGCAATGACAGTTCCAGGATTTAAGAAAGTAGTGTTCCACATCAATGCATATCCAGTGAAAGCATAACGTCAAAAAAAGCCTGGCACCGTTCGCGATCTGGACTTACTTAGATTTGTTGTAGTCAAGCCGGCTATCAGCGATTTATCCCGGAAACACATACTAGTGAGTTATTTGTATGTTACCTAGAATAGCTGTCACGAATCACTAATACATTCACCCACCAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:22)。

400 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTGAATACAAGACGACAGTCCTGATTATATTTTCATTTAATTACGCCAATTTAATTATGATGAATATTAACGGAATTAAATATGTATTGATAAGTACTAAGTAATGGTTTACCCACGGCGATCTATATGCAAGGGAAACATTAACAAATTTAAACATCTGATGTGGACAAAACTTGTAATGTGGTATAGTTAAAAATATAGGTTTCAGGGACACGTAAGTATCTATCTTGAATGTTTAAGTAGGTCCTGTCTACCATTCTGAAATTTAGAAAATCGCGTTCATCGGGCTGTCGGCTACACCTCAGAAAACCATTTCGTGTTGCACAGGAGGAACTTTCGAGGGTTCGTATGAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:23)。

500 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCACCGCTTGACGACGTAGGGTATTTGGTATCTGAATCTACTCATTTACCTACATACTGAAGATTTTGCGATCGTCTAATATATTGGACTAATGCCCGATTTCTGATCAATTACTCTAGGCGATACTTCATCGCTGGCCTTATTTGGATTTTGCTCAAGTGCTAAACTCTCTGCGCGTCAATACTAGTCTGACATCAGTCAAGACCTGCTATCTGAAAACTACTAGAGAGATATACCTAACAACTTTAGTGGATAAATCAGGTCTGGAGATTGTCATATAATGCCACTAGGGTCAGAAGGCTGTGTCAAAGTTAGTGGTTAGTAGGTCTCCGCTCTGCGGTACTATTCTTATATTCTCTTACTATGCATCAAACAAAATAGAATGCATAGACAAACCGCCTGCCAAGTTTACAAGATAACTTGCGTATAGGTTTATAAGGGTTCTTCTGTATCGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:24)。

首先使用4秒组合退火/延伸区段(每个循环4.9秒)对中等长度300-bp产物确定引物和聚合酶的最佳浓度(图10a)。然后对所有产物长度使用相同引物(4 µM)和聚合酶(2 µM)浓度并确定最小延伸时间(图11a-e)。依产物长度而定，增加的延伸时间导致减少部分的定量循环(Cq)，直至观察不到进一步改变，反映有效PCR所需的最小延伸时间。例如，对于500 bp产物使用KAPA2G^TM FAST聚合酶(Kapa Biosystems)的扩增曲线显示在图10b中。与使用KlenTaq1 (Taq聚合酶的缺失突变体, AB Peptides)的7秒相比，使用KAPA2G FAST聚合酶的最小延伸时间为3秒。当聚合酶的身份保持恒定时，较长产物需要较长延伸时间(图10c)。对于KlenTaq1聚合酶，每60 bp需要约1秒，而对于KAPA2G FAST，每158 bp需要1秒。注意到选择这两种聚合酶是因为其可以足够的浓度商业可用，而大部分其他聚合酶不能以这种高浓度商业可用。应该理解，延伸所需的时间直接且线性地取决于待延伸的长度，并且与聚合酶浓度和聚合酶速度成反比。可定义使这3个参数相关的比例常数(k2)：

所需的延伸时间= k2*(延伸长度)/([聚合酶]*(聚合酶速度))

实施例9

极端PCR时间还可用高Mg++浓度来减少。AKAP10的60 bp片段用引物GCTTGGAAGATTGCTAAAATGATAGTCAGTG (SEQ ID NO:25)和TTGATCATACTGAGCCTGCTGCATAA(SEQ ID NO:26)扩增，以产生扩增子GCTTGGAAGATTGCTAAAATGATAGTCAGTGAC(A/G)TTATGCAGCAGGCTCAGTATGATCAA (SEQ ID NO:27)。

使用2-7 mM MgCl₂，对于35个循环，每个反应体积为1 μl，基于时间控制(在94℃水浴中0.07秒，在60℃水浴中0.1-0.4秒)，。样品体积为1 μl，含5 ng人基因组DNA、20 μM引物和8 μM聚合酶。使用每个循环0.42秒的方案，当MgCl₂为2-3 mM时，在解链曲线(图12a)或凝胶(图12b)上未观察到产物。最小产物以4 mM存在，但是在用5-7 mM MgCl₂扩增之后观察到大量产物。在5 mM MgCl₂下，在循环时间为0.32秒时在解链曲线(图13a)或凝胶(图13b)上未观察到产物，但是在循环时间为0.42秒、0.52秒和0.62时存在大量产物，证实在15秒内实施的PCR (14.7秒内进行35个循环)可获得特异性的高产率60 bp产物。因此，说明性Mg++浓度为至少4 mM、至少5 mM、至少6 mM、至少7 mM或者更多，并且应该理解，这些说明性的Mg++浓度可与本文描述的任何实施方案一起使用。

实施例10

在极端PCR中使用的高浓度引物和聚合酶在以较慢循环速度使用时可能具有不利影响。在基于快速循环或装置(block)的仪器上获得非特异性产物分别慢32倍或106倍。图14a-b显示比较实施例9中使用的AKAP10 60 bp产物扩增的结果，其中扩增使用20 μM每种引物、8 μM KlenTaq和10 ng人基因组DNA和使用以下实施40个循环：(1) 极端PCR，在94℃下设定时间为0.5秒和在60℃下为0.2秒，得到总时间为大约17秒，(2) 快速循环PCR(Roche LightCycler)，使用在94℃下设定时间为10秒进行初始变性，随后是85℃ 0秒和60℃ 0秒的循环，得到总时间为大约9分钟，和(3) 传统(装置)温度循环(Bio-Rad CFX96)，在94℃下初始变性10秒，随后是85℃下0秒和60℃下5秒的温度循环，总时间为大约30分钟。如可见的那样，甚至LightCycler的快速循环也导致相当的非特异性扩增，而极端循环条件导致凝胶上出现单一解链峰和最小非特异性扩增。

还注意到由高引物和聚合酶浓度造成的极端PCR的产率增加。与快速循环PCR相比，极端PCR产生超过30倍的产物量，使用定量PCR进行比较(数据未显示)。

实施例1-17全部使用图1a-1d中描述的一种或多种装置实施，或者对那些配置进行微小变化，某些步骤在LightCycler上实施，以确认qPCR结果。然而，应该理解，本文描述的方法和反应可发生于多种仪器。用于这些实施例的水浴和管允许足够快速的温度改变以研究升高引物和聚合酶浓度的影响。然而，其他实施方案可能更适合于商业用途。微流控系统体积小和表面积-体积比率高，可能非常适合于极端PCR。这种系统允许用于极端PCR的高浓度引物和聚合酶所需的快速温度改变。微流控系统包括微流动系统(35, 53)，其包含反复携带样品通过变性、退火和延伸温度区的小型化通道。这些系统中的一些已经证实，对于较低复杂性的靶标，有效PCR循环时间快至3秒。预计如果聚合酶以至少0.5 μM的浓度提供和引物每种以至少2 μM的浓度提供，则可以这种系统扩增更复杂的靶标。静态PCR芯片和PCR液滴系统(54)还可得益于增加引物和探针浓度，因为体积可以小至1 nl或者更小，并且可以足够低以允许很快速循环。应该理解，精确的仪器对于本发明是不重要的，条件是仪器温度循环足够快速以利用增加的引物和聚合酶浓度，而不会遭受在较慢循环速度下与较高引物浓度相关的特异性丧失。

尽管以上实施例全部采用PCR，但是应该理解PCR仅为说明性的，并且设想增加引物和酶浓度组合较短扩增时间用于除PCR之外的核酸扩增方法。其量值可增加的说明性酶活性包括聚合(DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶)、连接、螺旋解旋(解旋酶)或核酸外切酶活性(5’至3’或3’至5’)、链置换和/或切割、核酸内切酶活性及DNA/RNA杂合体的RNA消化(RNAse H)。扩增反应非限制性地包括聚合酶链式反应、连接酶链式反应、转录介导的扩增(包括基于转录的扩增系统、自我持续序列复制和基于核酸序列的扩增)、链置换扩增、全基因组扩增、多重置换扩增、反义RNA扩增、环介导扩增、线性连接扩增、滚环扩增、分枝扩增、等温寡核苷酸扩增、解旋酶链式反应和连续侵入信号扩增。

通常，随着酶活性变化，扩增时间以相同的因子反向变化。对于包括引物的反应，随着引物浓度变化，扩增时间以相同的因子反向变化。当扩增需要引物和酶两者时，酶和引物两者浓度均应变化以使反应速度最大化。如果引物退火发生在扩增循环的独特区段(例如3温度PCR期间的独特温度)，那么预计在所述区段令人满意地完成引物退火所需的时间与引物浓度呈负相关。类似地，如果在扩增循环的独特区段(例如在3温度PCR期间的独特温度)需要酶活性，那么预计在所述区段令人满意地完成酶促过程所需的时间与一定范围内的酶浓度呈负相关。改变引物或酶浓度可用于改变其单个区段所需的时间，或者如果两者均发生于相同条件下(比如在2温度PCR中或在等温反应过程期间)，则预计改变两者浓度对防止一个反应的反应速度受限可能是必要的。增加Mg++浓度也可与增加的酶和引物浓度组合使用，以进一步加速扩增过程。较高Mg++浓度既增加引物退火速度，又减少用于核酸扩增的许多酶促反应的时间。

当其伴随较短扩增时间或区段时，较高浓度的Mg++、酶和引物特别有用。当使用较高浓度而没有缩短时间时，在某些情况下可能会发生非特异性扩增产物，因为反应的“严格性”已经减少。减少扩增时间或区段时间引入较高的严格性，这似乎补偿由反应物浓度增加引起的严格性丧失。相反，如果这些较低浓度通过增加扩增时间或区段时间来补偿，则试剂成本可通过减少反应物浓度来最小化。

增加聚合酶浓度可减少长程PCR所必要的时间，说明性地其中靶标为5-50 kb。一般地，10分钟-30分钟延伸时间用于扩增大的靶标，因为靶标很长，以致需要时间：1) 用于聚合酶完成单一靶标的延伸，和2) 用于酶再循环以聚合另外的引发模板。聚合酶的这种再循环在PCR开始时不需要，此时可用的酶数目超过引发模板分子。然而，甚至在指数阶段完成之前，聚合酶分子的数目通常会变得有限，并且酶再循环为必要的。通过增加聚合酶的浓度，所需的延伸时间可减少至少于5分钟，并且可能少于2分钟，同时由于高引物浓度而保持增加的产率。尽管实际的酶速度未增加，但较少再循环为必要的，这影响所需的最短时间，大约与酶浓度呈线性关系。

循环测序时间还可通过增加引物和聚合酶浓度来减少。一般地，标准循环测序引物浓度为0.16 μM，并且组合退火/延伸时间在50-60℃下为10分钟。通过将引物和聚合酶浓度增加至10倍，退火/延伸所需的时间可减少至大约1/10。在长PCR和循环测序两者中，所需的预计时间与聚合酶或引物浓度成反比，无论哪种限制。

与当前通过组合极端温度循环与较高浓度的引物、聚合酶和/或Mg++实施的PCR相比，用连接接头用作准备大规模平行测序的引物对片段进行PCR可以少得多的时间完成。

在所有以上应用中，预计通过较短扩增时间来保持反应的特异性。尽管本领域技术人员预计高引物和聚合酶浓度会引起非特异性扩增的困难，但是使总体循环时间和/或单个区段时间最小化导致PCR的高特异性和效率。

表2. 针对不同靶标的极端PCR条件

表3. 使用A) 历史范围，B) 引物退火方程，和C) 聚合酶延伸方程推导速率常数(k1 (引物退火)和k2 (聚合酶延伸)).

极端PCR的具体条件显示在表2中。除了针对3种靶标的聚合酶和引物浓度的同时优化实验以外，所有数据均被呈现。在表3中，变量之间的定量关系得以详述。使所需的退火时间与引物浓度相关联的反比例关系近似为常数(k1)，并通过方程(所需的退火时间)=k1/[引物]定义。在传统(标准) PCR、快速循环PCR和极端PCR条件下，对这些变量使用一定范围的典型值产生在很大程度上重叠的反比例常数范围(传统0.75-30，快速循环0.2-10和极端1-20)。由于该恒定的反比例关系，当前实施的那些以外的期望的退火时间可用于对期望的时间预测所需的引物浓度。例如，使用常数为5 (s*μM)，对于退火时间为0.01秒，可计算引物浓度为500 μM。相反，如果期望引物浓度为0.01 μM，则所需的退火时间应为500秒。尽管这些条件超出了传统和极端PCR两者的界限，但是其预测了引物浓度与退火时间之间的关系，这对于PCR成功有用。跨越传统、快速循环和极端PCR的k1合理界限为0.5-20 (s xµM)，更优选的为1-10 (s x µM)和最优选的为3-6 (s x µM)。

可实施类似的计算以使期望的延伸时间与聚合酶浓度、聚合酶速度和待扩增的产物长度相关联。然而，由于在不同实验室中随着时间的推移实施的在传统、快速循环和极端PCR之间会影响PCR的许多另外变量(聚合酶、Mg++、缓冲液)，所以可最好查看这里呈现的极端PCR的良好受控条件，以建立变量之间的反比例关系。这允许在极端PCR条件下进行聚合酶浓度、聚合酶速度、产物长度和所需的延伸时间之间的定量表达。定义方程为(所需的延伸时间)=k2(产物长度)/([聚合酶] *(聚合酶速度))。实验确定的k2定义为以上方程在恒定温度、Mg++、聚合酶类型、缓冲液、添加剂和dsDNA染料浓度条件下的比例常数。对于具有[聚合酶]和[引物]二维优化的3种极端PCR靶标，成功扩增边缘处的[聚合酶]可在整个引物浓度辨别，并与其他3个变量相关联。如表3中显示的那样，这3种不同靶标的k2值变化小于2倍，由此推断出k2为常数，并且如果已知其他变量则可用于预测一个变量。所需的延伸时间与延伸长度(产物长度减去引物长度)成正比，与聚合酶速度和聚合酶浓度成反比。k2的单位为(1/µM)，并且这里使用的极端PCR条件的最佳值为0.5 (1/µM)，范围为0.3-0.7 (1/µM)。对于聚合酶类型、Mg++浓度或不同缓冲液或染料条件变化的其他反应条件，可导出类似的k2值。

极端PCR可在任何种类的容器中实施，只要样品温度可快速改变，并且优选均一地改变。样品内和样品间的均一性两者在许多应用方面为重要的，说明性地对于定量PCR，其中不同样品的不同PCR效率直接转化为量化误差。除了标准管和毛细管以外，悬浮于油流中的含水反应物的微滴或薄的2维晶片提供良好的热接触。在不同温度下通过空间区段的样品流的连续流动PCR (分散为液滴、通过气泡分离或防止混合的其他手段)为一种用于极端PCR速度需要的温度控制的好方法。WO 2015/069743中描述的感应加热可提供用于极端PCR的合适方法和装置，本文通过参照以其全部结合。

实施例11

尽管PCR为用于检测和定量特定DNA片段的研究和临床诊断的基本方法，但是RNA不能通过PCR直接扩增。必须首先将RNA逆转录成DNA。一般地，这通过称为“逆转录酶”的酶酶促进行。酶促反应需要时间，推荐用于逆转录的典型时间量为30-50分钟(参见例如Superscript II Reverse Transcriptase的产品说明书, MAN0001342, Rev. Date: 20May, 2010, Invitrogen/Life Technology/ThermoFisher)。

在许多情况下快速逆转录(RT)为有用的，例如在RNA病毒的即时临床诊断中，其中快速结果效率(time-to-result)增加测试的价值，并且对于患者或者在有或没有参照基因的情况下特定mRNA转录物的单重、双重或多重扩增可能是关键的。如以上讨论的那样，极端PCR为一种能够在短至15秒或者更短时间内扩增DNA的技术。然而，当mRNA或病毒RNA的逆转录需要30分钟或者更长时间时，少于1分钟的PCR不是那么有用。更快速RT-PCR将是期望的，并且特别期望具有一步法RT-PCR方案，其中RT和PCR步骤两者发生在相同的反应混合物中。

在该实施例中，用常见参照基因ACTB实施快速一步法RT-PCR双重反应。将两种人转录物(AKAP10和ACTB)用AKAP10 (GCTTGGAAGATTGCTAAAATGATAGTCAGTG (SEQ ID NO:25)和TTGATCATACTGAGCCTGCTGCATAA (SEQ ID NO:26))和ACTB (TTCCTGGGCATGGAGTC (SEQ IDNO:28)和CAGGTCTTTGCGGATGC (SEQ ID NO:29))的引物以一步法进行逆转录和扩增。在10μl反应中包括0.5 μM每种引物、60 ng自人血液白细胞提取的总RNA、300单位SuperscriptII逆转录酶(ThermoFisher)和0.1 M二硫苏糖醇在快速PCR母液中(1X LCGreen Plus染料、0.2 μM每种dNTP、3 mM MgCl₂、50 mM Tris (pH 8.3)、25 ng/μl牛血清白蛋白、0.4 U的KlenTaq DNA聚合酶(AB Peptides)和64 ng的抗Taq抗体(eEnzyme)。将样品置于LightCycler毛细管(Roche)中，在45℃下温育5分钟以进行逆转录，并且然后在94-55℃之间(无需保持)循环40个循环，以在转盘式LightCycler上进行实时扩增(图16a)。然后将样品在LightCycler中通过于95℃下瞬间变性解链，冷却至60℃，并最终通过以0.2℃/秒加热至95℃进行荧光采集(图16b-16c)。79℃的峰为AKAP10扩增子和83℃的峰为ACTB。这些结果显示可使用较快速RT时间(比30分钟少得多的时间(例如5分钟))来扩增RNA，包括双重靶标。

实施例12

RT-PCR的一致性和质量取决于许多事物，包括RT酶的特定类型(60)。两种类型的RT酶通常用于RT-PCR，一种来自小鼠白血病病毒(Maloney鼠白血病病毒-MMLV)和一种来自鸟病毒(禽成髓细胞瘤病毒-AMV)，但是其他RT酶为本领域已知的，并且具有较低(或较高)RNase H活性和增加的温度稳定性的MMLV的工程化变体为商业可用的。Bustin (60)测试了几种逆转录酶的一致性和产率，并且确定了一种更好的酶为作为iScript (Bio-Rad)销售的MMLV。

本文使用的RT的一个“单位”为使用聚(rA)/寡聚(dT)₂₅作为模板/引物，在37℃下10分钟内将1 nmole dTTP掺入酸可沉淀材料中所需的酶量。用于确定MMLV单位活性的缓冲液为50 mM Tris (pH 8.3)、75 mM KCl、3 mM MgCl₂和10 mM DTT (二硫苏糖醇)。用于确定AMV单位活性的缓冲液为75 mM乙酸钾、50 mM Tris-HCl (pH 8.3)、8 mM乙酸镁和10 mMDTT。用于MMLV RT反应的单位数(10 U/µl)一般地为AMV RT反应(1U/µl)的10倍。这里使用的RT酶包括：1) 天然克隆MMLV (New England Biolabs)，2) Superscript II (具有低RNase H活性和增加的热稳定性的修饰的MMLV, ThermoFisher)，3) iScript (具有强RNase H活性的修饰的MMLV, Bio-Rad)，4) RocketScript (具有增加的RNase H活性和增加的热稳定性的修饰的MMLV, Bioneer)，和5) 天然克隆AMV (New England Biolabs)。对于大部分这些酶，制造商明确指明单位定义和酶浓度。例外情况是RocketScript (其中活性通过针对已知活性的酶进行滴定来确定)和iScript (其中制造商没有公开所使用的浓度)。然而，甚至在iScript的情况下，建议的程序(1 μl酶在RT反应体积20 μl中)与其他RT酶的程序相同，这表明iScript的浓度为200 U/μl储备液，在RT反应中稀释至10 U/μl，该浓度由其他制造商提供并建议。

推荐的iScript MMLV温育时间为30分钟。为了研究RT反应的时间过程，实施了两步法RT-PCR。用这种两步法，将RT在水浴中的微量离心管中单独实施不同时间段，并且然后在毛细管LightCycler中实施实时PCR。RT步骤在45℃下用实施例11中列出的ACTB反向引物实施不同时间(1分钟-30分钟)。将含有RNase抑制剂的2 μl iScript MMLV (推测最终浓度为10 U/μl)与包括随机六聚体、寡聚(dT)、稳定剂、dNTP和未另外指定的缓冲液的反应混合物合并。40 μl反应物包括256 ng来自白细胞的总RNA和0.25 μM的ACTB反向引物。在45℃下温育之后，通过加热至85℃保持5分钟停止反应，并将混合物用水稀释3倍。除了使用2 μl稀释的cDNA模板和仅使用ACTB引物以外，如实施例11中那样实施qPCR。使用相对于30分钟对照的Cq的每条曲线的定量循环(Cq)来计算ACTB cDNA的相对浓度，假定扩增效率为100%。结果呈现在图17中。大约60%的cDNA在前5分钟内形成，10分钟时为80%和20分钟时为100%。不同温育时间(0.5、1、2、4、8、16、30分钟)和引物浓度(0.125、0.25、0.5、1 μM)的另外研究显示，增加引物浓度补偿较少的温育时间。由于温度平衡缓慢，用微量离心管研究快于0.5分钟的时间是不可能的。

如以上讨论的那样，极端PCR将快速温度循环与高引物和聚合酶浓度组合起来，以使得能够进行2分钟或更短时间的PCR。退火时间可以减少，因为高引物浓度与引物浓度的增加成正比地更快速驱动反应。类似地，当酶量有限时，高酶浓度应成比例地加速延伸步骤。与RT类似表明较高引物和酶浓度也可有助于加速RT反应。然而，将RT步骤和PCR步骤两者与两种不同酶组合成一个反应是困难的。通常，据信逆转录酶与DNA聚合酶反应条件不相容。例如，KCl在RT反应中使用，但是在实施例11的快速PCR母液中不存在，因为KCl在50 mMKCl下抑制聚合酶活性达80% (61)。如以下显示的那样，相信在一步法RT-PCR反应中KCl浓度为0-10 mM KCl可能是合适的。通常在RT中使用比在PCR中使用的更高浓度的dNTP (每种0.5-1.0 mM (RT)与每种0.2 mM (PCR)相比)和Mg++ (3-15 mM (RT)与1.5-5 mM (PCR)相比)。这个问题的一种解决方法为使用一种具有逆转录酶和DNA聚合酶活性两者的酶，比如rTth，一种重组热稳定DNA聚合酶，其也可使用RNA作为模板(62)。然而，这种酶具有其限制性，并且由于各种原因，使用两种酶通常为优选的。当两种酶组合在一个反应中时，必须发现适用于两种酶的条件。用于极端PCR的条件(缓冲液、[Mg++]、盐、[dNTP]、pH、[引物]、[酶])可能不适用于RT，反之亦然。然而，本文呈现与RT和PCR两者相容的条件，并且实施例11的快速PCR母液(有时补充有Mg++和二硫苏糖醇)用于本文的许多进一步实施例中，而不是用随iScript销售的反应混合物。

实施例13

RNA具有比DNA更多的二级结构，并且强二级结构被认为抑制RT。增加温度为释放RNA中二级结构的一种方法，使得更易于逆转录。然而，据信通常使用的RT酶不耐热，因此对于可把样品加热至何种程度以展开二级结构而不使逆转录酶失活存在限制。预计较短反应时间通过限制暴露于任何RNase的时间和限制化学降解两者来保持更多产生的核酸用于PCR。

使用类似于图1c中显示的水浴/步进电机PCR仪器，在少于1分钟内使用8倍正常引物浓度实施一步法RT-PCR。5 μl一步法RT-PCR含有4 μM每种ACTB引物、25 ng总白细胞RNA、50 U iScript RT (最终浓度10 U/μl)(类似于实施例12，除了不包括随机六聚体或聚(dT))和2 μM KlenTaq (全部在实施例11的快速PCR母液中，除了抗Taq抗体)。将样品在设定为45、47.5、50或55℃的水浴310中各自温育15、20或24秒，并且然后使用水浴313和314在55℃-94℃之间循环。每个循环需要1.05秒，并且包括水浴313和314之间的两次转移(每次转移需要125毫秒)和在水浴313和314的每一个中两次静态保持400毫秒，共35个循环。具有15秒RT的样品RT和PCR总时间为53秒。如通过琼脂糖凝胶测量的那样，所有样品似乎同样地扩增(图18)。尽管iScript中存在的稳定剂没有公开，但是据信其包括DTT。

实施例14

海藻糖为一种已经用于热稳定和热激活RT酶的糖，并且可用作PCR的增强剂(63)。含有和不含0.6 M海藻糖的iScript MMLV的温度概况通过两步法RT-PCR测量。条件与实施例13中相同，除了RNA源为以5 ng/μl包括的得自多个组织的人参照总RNA样品(Stratagene)，并且在42-69℃的温度下逆转录温育20秒。RT在不同温度水浴中的毛细管中实施，通过在125毫秒内将毛细管移动至85℃水浴保持60秒而立即进行RT失活。然后将样品稀释并转移至毛细管LightCycler用于qPCR，如实施例12中描述的那样。无模板对照为阴性，并将样品与阳性对照进行比较，其中RT在42℃下运行30分钟。在RT步骤中从55-63℃，海藻糖具有保护作用，如通过qPCR测量的那样使产物量增加20-40% (图19a)。

在类似的实验中，iScript MMLV RT与RocketScript MMLV RT (Bioneer)进行比较。设置和分析相同，除了RocketScript RT以含有100 U RT (最终浓度10 U/μl)、10 mM二硫苏糖醇、0.25 mM每种dNTP和0.5 U RNase抑制剂的10 μl反应实施。在整个测试温度范围对两种酶获得的很类似的结果(图19b)，表明这些工程化MMLV突变体可为相同或类似的酶。两家制造商声称其MMLV突变体比天然酶更稳定并且具有RNase H活性。

实施例15

使用0.6 M海藻糖和56℃用于如实施例14中测定的逆转录，通过两步法RT-PCR研究了1-8 μM的引物浓度。逆转录在56℃下实施20或60秒，其他按照实施例14的程序进行。对于60秒RT，相对数量增加直至4 μM引物，然后在4-8 μM之间趋于平稳(图20)。RT 20秒后，相对数量持续增加直至8 μM引物，表明较短时间可通过较高浓度的RT引物补偿。

在使用相同0.6 M海藻糖的另一组实验中，在56℃下用6 μM反向引物进行RT温育20秒，iScript MMLV RT酶的量从10 U/μl (正常)变化为40 U/μl。Cq随着酶浓度增加而减少，表明在这些条件下，酶浓度较高导致cDNA产率较大。

在使用0.6 M海藻糖与较高浓度RT (40 U/µl)和引物(6 µM)两者的进一步实验中，将0.5、1、2、4、8和16秒的RT时间与42℃下30分钟进行比较。定量PCR揭示在56℃下4、8和16秒RT温育时间与30分钟、42℃对照的之间没有差异，表明在这些条件下4秒足以用于总RNA的RT-PCR。

实施例16

以上实验自总RNA扩增特定mRNA转录物。RT-PCR的另一种很常见应用为RNA病毒检测和定量。例如，HIV和HCV的病毒载量测定需求很大，呼吸道病毒比如呼吸道合胞病毒(RSV)的检测也是如此。

实施少于56秒的RSV RNA的一步法RT-PCR扩增。RSV RNA得自ATCC (目录#VR-3233SD)。RSV引物正向为：TGGGGCAAATATGTCACGAAG (SEQ ID NO:30)和反向为：CCATTTAAGCAATGACCTCGAATTTCA (SEQ ID NO:31)，生成的扩增子长度为63 bp。逆转录和PCR以5 μl实施，其中含有6 μM每种引物、(40 U/µl) iScript RT、2 μM KlenTaq、0.6 M海藻糖和5000、500、50或5个拷贝的新鲜稀释的RSV RNA在实施例11的快速PCR母液中(除了抗Taq抗体以外)。逆转录在56℃下实施20秒，随后如实施例13中描述的那样进行35个循环的PCR。不同初始模板拷贝数的PCR产物凝胶(一式三份)显示在图21中。在左侧泳道可见强烈引物和产物带，模板的初始拷贝数为5000和500。产物带在50个拷贝时略微减少，和在5个初始拷贝时强度明显较弱，证实灵敏度至少低至5个拷贝。使用这种说明性的一步法RT-PCR方案可检测单一拷贝。

实施例17

实施逆转录温育低至少于1秒的RSV RNA的一步法RT-PCR扩增。如实施例16中那样实施RT-PCR，RSV RNA的初始模板拷贝数为5000。将所有溶液在冰上混合以限制反应在56℃下开始之前的任何逆转录。在56℃下的RT时间从20秒变化低至少于1秒。标记为“10 ms”的最短时间段表明当毛细管为静态时在56℃水浴中的时间。包括进入和离开水浴的转换及10毫秒静态保持的时间可能不足以在56℃下暴露以使样品达到温度。令人惊讶地，所有样品均显示强特异性PCR产物，RT时间为20、10、5、2、1秒和“10 ms”，而NTC (无模板对照)保持阴性(图22)。对5秒RT步骤的样品实时监测显示在图23中。

为了进一步研究很短时间的RT，比较了5、1和0秒温育，其中“0秒”温育避开56℃水浴。也就是说，制备的样品通过极端PCR直接扩增而没有专门的RT温度温育。将所有反应组装在冰上，并且最后的短暂(20秒)离心在调节于2℃下的离心机中实施。一组样品立即通过极端PCR处理，另一组样品在室温下放置60秒以模拟在整个制备中保持低温时较少护理。结果显示阴性无模板和无RT对照在所有时间和条件下具有强带(图24)。从左到右，阴性对照为两条左侧泳道，接下来的3条泳道为在56℃下温育0、1和5秒的冷制备样品，和最后3条泳道为温育0、1和5秒的1分钟室温泳道。

实施例18

进一步检查海藻糖和蔗糖对RT的影响。使用实施例17的条件，将含有和不含0.6 M海藻糖的1、2、5和10秒RT温育用RSV RNA以每个反应5000个拷贝和45个循环的一步法PCR进行测试。结果显示在图25中。在图25中，海藻糖组在左侧，(从左到右)为无模板对照、空白、温育1、2、5和10秒，随后为相同顺序的无海藻糖组。尽管在端点取凝胶，但是似乎海藻糖增加最终产率。当将海藻糖与0.2、0.4和0.6 M蔗糖进行比较时，所有样品均充分扩增，解链分析表明0.4 M蔗糖产生最高产率(数据未显示)。蔗糖似乎与海藻糖一样好或者比海藻糖好，表明其他糖(包括葡萄糖和果糖)可能具有类似的影响。其他稳定剂也可使用。

实施例19

来自New England Biolabs的AMV RT为一种天然、克隆RT，通常在还原剂比如二硫苏糖醇(10-250 mM)、高Mg++浓度(8-13 mM)和高KCl (75 mM)存在下于42℃下运行。制造商的缓冲液(反应中最终浓度)为：50 mM Tris (pH8.3)、75 mM乙酸钾、8 mM乙酸镁和10 mMDTT。为了与玻璃毛细管相容，该混合物补充有BSA (反应中最终浓度为500 μg/ml)。将该缓冲液与最终反应中补充有10 mM DTT和10 mM Mg++ (总计13 mM Mg++)的实施例11的快速PCR母液进行比较。两种缓冲液之间的主要差异为快速PCR混合物中没有K+，而制造商的缓冲液包括75 mM K+。先前认为钾离子的存在对于RT反应是关键的(64)。实施两步法RT-PCR反应。向每种缓冲液中加入250个拷贝的RSV RNA/μL、2.5 U/μl AMV RT和15 μM反向RSV引物，并在42℃下实施RT 1秒、5秒、20秒、1分钟或10分钟。在RT之后，使逆转录酶在93℃下失活60秒，冷却至室温，并且以1:10稀释用于在毛细管LightCycler中进行的PCR。每个10 μlPCR包括在快速PCR母液中的0.5 μM RSV引物和2 μl的1:10 cDNA。实时PCR通过在94-55℃之间(无需保持)循环45个循环来实施。然后将样品通过在95℃下瞬间变性而在LightCycler中解链，冷却至60℃，并且最终通过以0.2℃加热至95℃进行荧光采集。

实时结果、解链曲线和凝胶分析揭示，所有反应均扩增Tm为79℃的单一产物。对于每种缓冲液可见在整个时间范围内(1秒、2秒、20秒、1分钟、20分钟)结果类似(数据未显示)。然而，与在补充的快速PCR母液中实施的扩增相比，商业缓冲液(包括75 mM K+)中的所有扩增平均延迟了4.6个循环。也就是说，不含K+的快速PCR溶液中的定量循环(Cq)比商业缓冲液中的Cq少4.6个循环，表明K+的严重PCR抑制作用，尽管其被声称在RT反应中是必要的。

然后在42℃下用AMV实施一步法RT-PCR以研究RT时间和Mg++浓度的影响。以3、6、10和13 mM包括Mg++，每种的RT时间为1、2、5和10秒。一步法反应包括实施例11的快速PCR母液(不含抗Taq抗体)、2.5 U/μl的AMV RT、250个拷贝/μl的RSV RNA、4 μM每种RSV引物和10mM DTT。循环条件如实施例13。结果显示在图26中。面板包括3 (左上)、6 (右上)、10 (左下)和13 (右下) mM MgCl₂。在每个面板内，RT时间从左到右为1、2、5和10秒。在3 mM MgCl₂下对AMV RT未观察到产物，在6和10 mM MgCl₂下观察到可变强度产物，对RT温育时间没有任何明显趋势，并且对13 mM MgCl₂在所有RT时间均观察到强带。与根据现有技术(暗示没有K+就没有扩增)的预计相反，甚至在完全不存在K+的情况下用13 mM MgCl₂发生了极好的扩增。因此，使用一步法RT-PCR方案可获得良好结果，其中反应混合物基本上不含钾。

实施例20

将来自NEB的天然MMLV与来自Bio-Rad的基因修饰的MMLV iScript进行比较。iScript的制造商声称其具有较大RNase H活性和较大的热稳定性。当使用iScript (10 U/µl)时，使用实施例11的含有RSV RNA的快速PCR母液和在56℃下于0.6 M海藻糖中进行5秒RT的初始研究显示出良好的特定解链曲线，但是用天然MMLV (2.5 U/µl)没有扩增。当每种酶增加至4倍时发现类似结果。最后，对于20秒RT步骤，将RT温度降低至37、42或47℃。结果与显示良好扩增的iScript相同，但是天然MMLV未显示扩增。反应不含任何DTT或K+。

用2种不同缓冲液实施类似于实施例19的两步法实验，其中一种基于制造商的缓冲液(50 mM Tris (pH 8.3), 3 mM MgCl₂, 75 mM KCl和10 mM DTT)，补充有BSA (500 µg/ml)和dNTP (每种500 μM)，和另一种基于实施例11的快速PCR母液(50 mM Tris (pH8.3), 3 mM MgCl₂, 200 µM每种dNTP和250 µg/ml BSA)，补充有10 μM DTT和75 mM KCl。代替AMV，每个反应中使用20 U/μl的MMLV以及6 μM反向RSV引物。每个反应还包括250个拷贝的RSV RNA/μL。DTT和KCl两者以相同浓度存在于两种缓冲液中，但是dNTP和BSA浓度略有差异，预计不会影响结果。RT在42℃下实施1秒、10秒、1分钟或10分钟。在RT之后，将逆转录酶在93℃下失活60秒，冷却至室温，并且以1:20稀释用于在毛细管LightCycler中进行PCR。每个10 μl PCR包括在实施例11的快速PCR母液中的0.5 μM RSV引物和2 μl的1:20 cDNA。如在实施例19中详述的两步法程序中那样实施实时PCR和解链。

来自两种缓冲液的所有时间点均揭示特定解链曲线，并以在彼此的3个循环内的Cq扩增。然而，与不包括KCl的实施例19中的样品相比(平均Cq = 20)，平均Cq (29.4)很滞后，表明K+的强烈RT-PCR抑制作用。不受理论的束缚，认为KCl为PCR期间抑制作用的原因。

为了证实KCl的抑制作用，在0、10、20、40和75 mM KCl下实施一步法RT-PCR，RT步骤在42℃下持续1、5或10秒。向快速PCR母液中加入250个拷贝/μl的RSV RNA、20 U/μlMMLV、4 μM每种RSV引物、10 mM DTT和2 μM的KlenTaq，连同可变浓度的KCl。如在实施例19的一步法方案中那样实施扩增。对于1 (左上)、5 (右上)和10 (左下)秒RT时间的琼脂糖凝胶显示在图27中，每个面板内增加KCl浓度。用0 mM KCl在1、5或10秒时发生强烈扩增。由与10和20 mM KCl反应生成的带比0 mM KCl弱，但确实随着RT温育时间的增加而增加。在40或75 mM KCl下未观察到扩增。

DTT为一些具有游离巯基的酶所需的强效巯基还原剂。用0、10或38 mM DTT和0或40 mM KCl实施类似于前述段落的一步法RT-PCR，在42℃下进行1、5或10秒RT温育。结果(图28)显示从左到右用不同DTT/KCl处理 (0 mM KCl/0 mM DTT、0 mM KCl/10 mM DTT、0 mMKCl/38 mM DTT、40 mM KCl/0 mM DTT、40 mM KCl/10 mM DTT和40 mM KCl/38 mM DTT)的1秒(左上)、5秒(右上)和10秒(左下)的面板。当DTT和KCl均不加入时，通常不发生扩增，尽管5秒面板确实显示弱带。DTT的激活效应在具有不同10 mM DTT带的所有面板清晰可见，带在38 mM下甚至更加明亮。每当KCl以40 mM存在时，甚至当存在DTT时也未见扩增。这些数据表明DTT激活和KCl抑制RT-PCR扩增。其他还原剂(说明性地β-巯基乙醇等)也可激活扩增。

实施例21

当PCR产物在极端PCR的45个循环之后通过凝胶或解链分析(图21、22、24和25)进行分析时，大部分定量信息丢失。即使凝胶带在逆转录(RT)一系列时间之后可能似乎相同，但是这可能是由于PCR组分的浓度有限，其可均衡样品之间的任何定量差异。对于定量结果，实时PCR通常比凝胶或解链分析好得多。从每个实时曲线导出的定量循环(Cq)与初始模板浓度的对数成反比。因此，Cq低表明初始模板量高，该量在逆转录中相当于通过逆转录反应产生的cDNA的量。

来自New England Biolabs的克隆的天然MMLV被滴定以检查使RT-PCR扩增最大化所必要的单位数量，如通过最低Cq值表明的那样。制造商的方案建议用于RT反应的MMLV为10单位/μL。然而，初始结果表明在极端一步法RT-PCR中较低量最佳，因此在45℃下，于不同RT温育时间(2.5、5、10、20、40和80秒)下检查了5、2.5、1.25、0.625和0.313单位/μL。

用得自ATCC的RSV RNA (目录#VR-26D)实施一步法RT-PCR反应。RSV引物为TGGGGCAAATATGTCACGAAG (SEQ ID NO:30)和CCATTTAAGCAATGACCTCGA (SEQ ID NO:31)。逆转录和PCR在玻璃毛细管中以5 μL体积用5 μM每种引物和极端PCR母液(1X LCGreen PlusDye, 0.2 µM每种dNTP, 50 mM Tris (pH 8.3), 1.65 µM KlenTaq DNA聚合酶和25 ng/µL牛血清白蛋白)与3.8 mM MgCl₂实施。每个阳性样品包括5 μL的6000个RSV模板拷贝。阴性样品不包括模板(无模板对照)。

所有溶液在冰上混合以在反应开始之前限制任何酶活性。用3水浴系统(图1c)控制样品温度，首先将样品转移至期望RT温度下的水浴中期望的时间，然后在设定为95℃和55℃的另外两个水浴之间交替，每个水浴中保持400毫秒。样品循环33次，每个循环进行荧光监测，需要约30秒完成PCR。

结果显示Cq (<2个循环)随着RT时间的增加而轻微减少(图29)。然而，在最短时间(2.5秒)时，高浓度MMLV强烈抑制(多达10个循环)总体反应。在2.5秒时，1.25 U/μL似乎最佳，减少至推荐浓度10 U/μL的1/8。为了减少RT-PCR的总体时间，2.5秒比约30秒的PCR时间少，仅占总体时间的<10%。优选的是RT时间少于极端RT-PCR总体时间的50%，更优选的是少于总体时间的20%，和最优选的是少于总体时间的10%。较短RT时间使在高温和高镁浓度下的RNA降解最小化。对于较长产物，RT和PCR时间均可成比例地增加。另外，逆转录酶的量可随着预期产物长度的增加而成比例地增加，但是在这里使用的小长度下，较低RT量最佳。据报道，逆转录酶抑制DNA聚合酶比如Taq聚合酶，这是在一步法RT-PCR反应中限制RT浓度的另一个原因。

实施例22

稀释以克隆天然形式存在的AMV (NEB)以确定如通过低Cq值确定的最佳浓度。制造商推荐的RT-PCR中的AMV浓度为1.25 U/μL。然而，初始实验表明最佳浓度更低。反应以AMV浓度为1.25、0.63、0.31、0.156、0.078和0.039 U/μL测试。

如实施例21中那样用RSV RNA实施一步法RT-PCR反应，除了使用AMV (在以上浓度下)和8 mM MgCl₂，并且RT反应在48℃下发生2秒。样品在每种浓度的AMV下一式三份运行。

AMV在0.31 U/μL的浓度下表现最好，是推荐的1.25 U/μL浓度的1/4(图30)，尽管可使用更大量，说明性地为0.5、0.8和1.0单位/μL，特别是对于较大扩增子。图31结合实施例21和22两者的结果，其中指明制造商推荐的浓度。

实施例23

在用于RT步骤的整个温度(37、42、45和48℃)和保持时间(2.5、5、10、20、40和80秒)范围分析使用MMLV的极端一步法RT-PCR。除了MgCl₂浓度为7.4 mM和使用1.25 U/μLMMLV以外，RT-PCR遵循实施例21。通常，Cq随着RT时间增加而减少，尽管并不总是如此(图32)。此外，对MMLV不能确定最佳温度。

选择2秒RT时间，使用Cq作为产生的cDNA量的量度，在整个温度范围(39、42、45、48、51、54和57℃)测试AMV。用0.31 U/μL的AMV，遵循实施例22的程序。一式三份测量显示出很多变化(图33)，使得难以鉴定最佳温度。最低平均Cq为45℃，这也是制造商推荐的使用AMV的RT温度。图34组合MMLV和AMV的数据。最佳温度不明显。确实，类似的RT活性出现在宽的温度范围内。

实施例24

由于镁减少反应时间的催化潜能，因此用MMLV和AMV两者研究MgCl₂浓度。如先前描述的那样用RSV实施一步法RT-PCR (实施例21和22)。所有样品用45℃ RT保持2秒(AMV)或者2和5秒(MMLV)处理，随后立即进行PCR扩增33个循环。

样品如在实施例22中那样在1X PCR缓冲液中包括RSV模板和0.31 U/μL的AMV。在3mM-20 mM之间以不同增量分析MgCl₂浓度。在11 mM下测量最低Cq值(图35)。含有少于11 mMMgCl₂的反应效率快速变差，而Cq仅在11-20 mM之间缓慢升高。

用1X PCR缓冲液(实施例21)和1.25单位/μL RT实施含有MMLV的一步法RT-PCR样品。在2 mM-15 mM之间滴定MgCl₂以确定最佳浓度。在这种情况下，研究了2和5秒RT时间两者。依RT时间而定(图36)，发现最低Cq在8-11 mM MgCl₂之间，尽管在6-12 mM之间MgCl₂为有效的。Cq从5秒至2秒RT时间增加约1个循环。两种酶在图37中以2秒RT时间比较。在所有Mg++浓度下，MMLV比AMV更具活性。

实施例25

在先前实施例中确定的AMV和MMLV反应条件下实施重新建立对一步法RT-PCR必要的最小临界RT保持时间。优化了AMV和MMLV的大多数RT-PCR反应，再次分析了RT保持时间对Cq的影响。实施两种逆转录酶反应，其中RT温度为45℃，并在95℃-55℃之间循环33次。

MMLV反应含有1.25 U/μL的酶、1X PCR缓冲液(实施例21)和7.4 mM MgCl₂。结果在图38中以对数X轴一式两份显示。在1-2秒之间Cq下降大，并且在2-40秒之间差异小于1个循环。大多数cDNA似乎在RT的前几秒内产生。

AMV反应含有0.31 U/μL酶、1X PCR缓冲液和11 mM MgCl₂。结果在图30中以对数X轴一式三份显示。同样地，大部分Cq下降出现在2秒内，表明在这些条件下，大多数cDNA似乎在RT的前几秒内产生。

来自MMLV和AMV的组合数据显示在图40中。尽管一些cDNA没有RT保持时间仍然产生，但是将保持时间增加至2秒显著促进cDNA合成，之后仅有轻微增加。同样，在大部分时间点，MMLV似乎在产生cDNA方面比AMV更有效。在2秒或更短时间内实施逆转录的能力显著减少RT反应时间，尤其可用于其中不必要加入试剂的一步法PCR，特别可用于诊断测试。

实施例26

由于特异性不佳，一步法RT-PCR在极端条件下使用增加的引物和聚合酶浓度的灵敏度可能受到限制。依靶标而定，可观察到无模板对照的表观扩增，无模板对照与低拷贝数阳性样品之间的Cq差异很小。此外，这种反应中产生的引物二聚体可在或接近特异性产物解链温度下解链，使得引物二聚体难以与期望的产物区分。为了减轻这些影响，考虑了热启动技术。热激活聚合酶、引物和dNTP为商业可用的，但是全部需要数分钟来激活，超过极端RT-PCR所需的时间，并且这种热启动技术可能会减少方法的大部分价值。针对聚合酶的抗体也是可用的，但是如在极端PCR中那样当聚合酶浓度增加至10-20倍时，需要的抗体量和成本均高。另一种选择是在混合期间将组分在仪器比如FilmArray (BioFireDiagnostics, LLC)内混合，该仪器保持溶液在高温下。高温减少或消除反应起始之前的引物结合，但是这需要许多应用可能并不需要的专门仪器。

当存在所有RT-PCR组分时，在准备期间于室温下可发生非特异性模板扩增或非模板扩增(引物二聚体)。因此，关键反应组分像聚合酶或dNTP一般地在准备期间尽可能晚地加入反应混合物中。在极端PCR中存在的高引物和聚合酶浓度更易于发生引物二聚体形成。然而，当仅有一种引物暴露于聚合酶时，不会发生引物二聚体，两种不同引物对引物二聚体形成是必要的(65)。当前的工作证实，在极端RT-PCR中引物二聚体的形成可通过将引物分成两个在RT之前立即混合的半反应物来减少。当引物被分成两个半反应物直至RT-PCR之前，无模板对照反应比一起准备引物时的Cq更高(特异性更好，并且因此灵敏度更好)。

引物二聚体还可通过保持冷的充分混合的反应物并限制混合之后RT-PCR之前的时间量来减少或防止。例如，已经发现，将样品在混合之后保持在冰上并在PCR之前于冷条件下离心样品增加了无模板对照的Cq。通常，更好的结果可通过使最终混合之后但在RT-PCR之前的时间和温度两者最小化来获得。另外，将温度从混合温度(说明性地0-25℃)快速升至RT温度(37-90℃)会降低引物二聚体形成。说明性地，在混合之后温度改变至RT温度可在少于1秒内实施，更具说明性地在少于0.5秒内和最具说明性地在少于200毫秒内。与其他研究形成对比，当前的工作显示，在RT时间短时，可接受的RT温度范围宽。

此外，当聚合酶比如KlenTaq和逆转录酶两者存在于相同反应管中时，可能发生PCR的抑制作用(66-68)。当前的工作显示，将DNA导向的聚合酶(例如KlenTaq)和RNA导向的聚合酶(逆转录酶)分成2个单独的半反应物也降低引物二聚体，如通过ΔCq (阳性对照与阴性对照扩增之间的Cq差异)增加证明的那样。另外的实验显示，如果存在dNTP和Mg++，则当含有逆转录酶的半反应物含有反向引物(即，引物可对存在的任何模板退火并延伸引物)时，结果更好。

总之，引物二聚体的控制通过将一步法RT-PCR制备物分成两个半反应物来获得。在一个实施方案中，第一个半反应物含有DNA导向的聚合酶(例如KlenTaq)、不对模板退火的引物(正向引物)和1X缓冲液(例如Tris、BSA和1X荧光染料，例如LCGreen plus)。第二个半反应物含有逆转录酶、对模板退火的引物(反向引物)、1X缓冲液、Mg++、dNTP和模板)。在混合之后，将溶液在RT反应之前保持尽可能地冷(说明性地<25℃，更具说明性地<5℃和甚至更具说明性地<2)尽可能短的时间(说明性地<60秒，更具说明性地<30秒和甚至更具说明性地<10秒)，并尽可能快速地升至RT温度(说明性地<1秒，更具说明性地<500毫秒和甚至更具说明性地<200毫秒)。

示例性的一步法RT-PCR包括分成第一冷冻半反应物和第二冷藏(但为液体)半反应物的组分。在运行一步法RT-PCR之前立即将两个半反应物部分合并，下文称为“冻结”技术。

冻结技术采用得自ATCC的RSV RNA (目录#VR-26D)证实。RSV引物正向为：TGGGGCAAATATGTCACGAAG (SEQ ID NO:30)和反向为：CCATTTAAGCAATGACCTCGA (SEQ IDNO:31)。两个半反应物均含有1X LCGreen Plus Dye、50 mM Tris (pH 8.3)和25 ng/µL牛血清白蛋白。在冰上工作时，待冷冻的半反应物另外含有0.2 mM每种dNTP、3.2 mM KlenTaq和10 μM正向引物。将2.5 μL的这种样品吸移至每个玻璃毛细管中并短暂离心(<5秒)，且在-20℃下冷冻最少20分钟。

尽管冷冻的反应物部分在-20℃冰箱中，但是冷藏部分在冰上制备。冷藏部分包括10 μM反向引物、12 mM MgCl₂、2.5单位/μL MMLV和2400个拷贝/μL的RSV。直到临加入冷冻毛细管之前，才将MMLV加入到冷藏溶液中。将2-3个冷冻反应物毛细管从冰箱中取出并立即置于冰水浴中。然后将2.5 μL冷藏溶液吸移加入到每个毛细管的顶部，在台式离心机中快速脉冲(<3秒)，并迅速放回到冰浴中。然后在50℃下用2秒RT保持时间和在95℃-55℃之间循环45次实施RT-PCR。

还用得自ATCC的失活Zika病毒RNA (目录#VR-1838DQ)实施了这种相同实验。Zika正向引物为CAGGTTGGAGTGGGAGTCAT (SEQ ID NO:32)和反向引物为TTTGTAACGTGCCACATGGT(SEQ ID NO:33)。每5 μL RT-PCR反应使用1250个Zika RNA拷贝。

来自RSV和Zika病毒实验两者的结果显示，与在冰上混合的那些相比，通过冻结技术制备的RT-PCR反应物的无模板对照的ΔCq显著增加(约10个循环，或灵敏度增加1000)(图41)。此外，无模板对照的解链曲线改变为较低温度并且变得易于与阳性样品区分。

实施一系列3个实验来确定将MgCl₂和dNTP置于冻结RT-PCR程序的冷冻或冷藏部分中的效果(表4-6)。通过在-20℃下将2.5 μL的一个半反应物在毛细管中冷冻来制备样品。然后将冷冻样品置于冰浴中，其中如实施例26中那样加入2.5 μL冷藏溶液。在所有实验中，将2种引物单独加入到不同溶液中，并单独加入KlenTaq和MMLV。将反向引物与RNA和MMLV组合，使得其能在混合2种溶液之前结合。这比将正向引物与MMLV和RNA组合得到更好的结果。

表4

表5

表6

在实验1 (表4)中，两种溶液同样地包括MgCl₂。在实验2 (表5)中，将所有MgCl₂置于冷藏半反应物中以查看Mg++与KlenTaq的分离是否会减少无模板对照扩增。最后，在实验3 (表6)中，将dNTP和MgCl₂两者置于冷藏溶液中。假设，如果逆转录酶是造成无模板对照扩增的原因，则这种扩增在dNTP和MgCl₂存在下可能会增加。或者，如果无模板对照扩增为由KlenTaq介导，则Mg++或dNTP不可用于KlenTaq的延伸，尽管阳性样品具有用于cDNA合成的完美条件。基于一步法RT-PCR反应的ΔCq值，实验3中概述的实验参数导致最佳条件(图42)。

实施例27

使用2秒RT，用冻结技术研究了RT温度对RT-PCR的影响。使用Zika引物实施实施例26的实验3中概述的程序，并在30-90℃的RT温度范围内分析阳性(1250个拷贝/5 μL RT-PCR)和无模板对照两者。Cq值在60℃温度范围内很恒定，ΔCq为4-8个循环(图43)。使用极端RT-PCR条件的用于MMLV的最佳温度为50-60℃。甚至使用冻结技术，仍然存在改善的空间。阳性与无模板对照之间的ΔCq较大会进一步改善灵敏度。

实施例28

研究了适配体作为在极端RT-PCR中减少无模板对照“引物-二聚体”扩增的手段。适配体过去已经用于抑制聚合反应，具体地讲为DNA导向的DNA聚合酶(69-70)和RNA导向的DNA聚合酶(71)两者。适配体来源于体外进化选择。以下列出本文研究的适配体的碱基序列(5’-3’)：

Taq适配体序列(70)：

6-10: CAAGACGGGCGGGTGTGGTAGGCGCCCGTG (SEQ ID NO:34)

4-1: ACTTGATGGCGGGTGTGGTAGGCGCCATCT (SEQ ID NO:35)

Stoffel (KlenTaq)适配体序列(69)：

Trnc.A-30: AAGACCAGACAATGTACAGTATTGGCCTGA (SEQ ID NO:36)

Trnc.2-30: GCCGGCCAATGTACAGTATTGGCCGGC (SEQ ID NO:37)

Tctw.A-30: CCGGACAATGTACAGTATTGGCCCGG (SEQ ID NO:38)

MuLV适配体序列(71)：

dm.1.1: UUACCACGCGCUCUUAACUGCUAGCGCCAUGGC (SEQ ID NO:39)

m.1.1: CUUACCACGCGCUCUUAACUGCUAGCGCCAUGGCCAAAACU (SEQ ID NO:40)。

以上DNA适配体中的每一种通过标准亚磷酰胺合成以3种形式合成：第一种在3’-末端未修饰，第二种用3’-磷酸修饰和第三种在3’-末端用C6-氨基末端修饰剂修饰(GlenResearch)。这些寡核苷酸中每一种的名称连同其模板、3’-封端剂和参考文献在表7中给出。加入3’-封端以防止从DNA适配体的可能延伸。尽管本文描述了用磷酸和C6氨基封端的适配体，但是还考虑另外的3’-封端剂，包括具有不同碳链长度的氨基修饰剂，说明性地具有2个碳(C2)、3个碳(C3)和多达12个碳(C12)接头的那些修饰剂。还考虑任何具有正电荷的3’-封端剂，并且认为其增加本文描述的适配体的结合和有效性，尽管可使用其他封端剂。寡核苷酸Tctw.A-30、Tctw.A-30 Phos和Tctw.A-30 Amino为本申请的新颖方面，因为其保持适配体Trnc.A-30的发夹环和发夹茎的不对称内部环，同时通过将一个茎碱基对从A ::T改变为G :: C和通过另外的G :: C碱基对增加茎长度来增加稳定性。另外，对保持其二级结构(发夹环和不对称内部环)同时增加茎稳定性的Trnc.A-30的其他修饰预计会产生有用的适配体，对于本文描述的应用含有或不含3’-氨基修饰剂。Trnc.A-30和Trnc.2-30的二级结构已经公开(69)。MMLV的RNA适配体不被封端，因为其应当不会通过DNA聚合酶延伸。

表7

名称	模板	3’-封端剂	参考文献
				6-10	DNA	无	70
6-10 Phos		磷酸
				6-10 Amino		C6-氨基
4-1	DNA	无	70
				4-1 Phos		磷酸
4-1 Amino		氨基
				Trnc.2-30	DNA	无	69
Trnc.2-30 Phos		磷酸
				Trnc.2-30 Amino		氨基
Tctw.A-30	DNA	无	新
				Tctw.A-30 Phos		磷酸
Tctw.A-30 Amino		氨基
				dm.1.1	RNA	无	71
m.1.1	RNA	无	71

DNA适配体首先用快速循环PCR测试。人基因组DNA靶标通过以下PUM1 (内含子2)引物定义：AGGTAGGTGAGGAGACTTAAG (SEQ ID NO:41)和TAACCAGCTGGTGGTGA (SEQ ID NO:42)。在10 μL反应中，在3 mM MgCl₂, 50 mM Tris (pH8.3), 200 μM每种dNTP, 500 μg/mLBSA, 1X LCGreen Plus, 0.064 μM KlenTaq1 DNA聚合酶以及可变量的适配体Trnc.2-30中存在50 ng DNA模板与0.5 μM每种引物。将样品在室温下混合而无需冷却或任何其他的引物二聚体预防手段。样品扩增如下进行：加热至95℃保持5秒用于基因组变性，随后进行45个循环的95℃ 0秒和55℃ 0秒，以确定毛细管LightCycler 1.5 (Roche)上的定量循环值(Cq)。然后以0.2℃/秒从60-95℃解链PCR产物，并进行连续荧光采集。

对不同Trnc.2-30浓度的Cq的影响显示在图44中。Delta Cq (ΔCq)用作灵敏度的量度，其中ΔCq越高，测定的灵敏度越好。在不存在适配体的情况下，ΔCq为约14个循环，在0.25 μM下升至26个循环。在较高浓度下，尽管阳性对照的Cq保持约恒定，但是阴性对照的Cq下降，ΔCq也减少。

使用以上确定的0.25 μM表观最佳适配体浓度，使用相同的LightCycler PUM1 PCR测定法确定表7中所有DNA适配体的ΔCq。阳性对照变化少于1.4个循环，Cq为约24-25个循环，而阴性对照变化广泛(数据未显示)。ΔCq值的结果显示在图45中。加入6-10和4-1适配体未提供比阴性(无适配体对照)好得多的结果。最佳适配体为在3’末端以C6氨基结束的适配体，最高ΔCq适配体为Tctw.A-30 Amino。这种适配体在其C6氨基封端及其序列方面在公开的文献中为独特的(69)。

使用以上对于15分钟LightCycler PCR发现为最佳的Tctw.A-30 Amino适配体，针对极端PCR优化了其浓度。因为在一些实施方案中引物浓度在极端RT-PCR中是在LightCycler实验中的10倍，所以适配体浓度可能需要增加。除了极端化学(5μM引物和1.6μM聚合酶)和极端扩增(在90℃-60℃之间大约1秒循环)以外，使用以上PUM1 (内含子2)扩增的条件。结果显示在图46中。随着DNA适配体浓度的增加，阳性对照反应的Cq缓慢升高，而阴性对照的Cq和ΔCq在0-1.25 μM之间快速升高，然后似乎平稳。在极端条件下，TctwA-30的最佳浓度似乎为约2 μM。因为某些DNA适配体部分地抑制一些逆转录酶，包括MMLV (72)，所以一种DNA适配体可用于抑制RT-PCR中的两种酶。或者，可在RT-PCR中使用两种适配体，一种对逆转录酶为特异性的和一种对DNA导向的聚合酶为特异性的。

因为特定RNA适配体可用于抑制MMLV，所以表7中列出的RNA适配体dm1.1和m.1.1用于抑制RT-PCR中的引物二聚体形成。首先，在没有任何DNA适配体的情况下研究了这些RNA适配体。条件遵循以上PUM1 (内含子2)扩增，在60℃下进行2秒RT。m.1.1的结果显示在图47中，显示了适配体浓度对Cq的影响。在3 μM适配体下，阴性对照和ΔCq两者均为最大。接下来，将适配体m.1.1与适配体dm1.1使用相同的系统进行比较，每种均在3 μM下。m.1.1的ΔCq (9.0)优于dm1.1的ΔCq (7.5)。因此，当RNA适配体在RT-PCR中单独使用(没有DNA适配体)时，可减少引物二聚体，并且适配体m.1.1为一个好的选择。

当RNA和DNA适配体两者在极端条件下单独优化时，根据所测试的组，RNA适配体的最佳选择为3 μM下的m.1.1，和DNA适配体的最佳选择为2 μM下的Tctw.A-30 Amino。在初步实验中，当两种适配体一起测试并与仅有一种适配体和根本没有适配体的对照比较时，当两种适配体均存在时ΔCq值最高。预计其中由RNA和DNA适配体生成的ΔCq为相加或协同的条件，在极端RT-PCR中极大地增加对引物二聚体形成的抗性。

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为了描述本发明所属领域的状态，在整个说明书中引用了一些专利、专利公开和非专利文献。这些文献和引文中的每一个如同全文显示那样通过参照结合于本文中。

尽管已经参照某些实施方案详细描述了本发明，但是在以下权利要求中描述和定义的本发明的范围和精神内存在变化和改良。

<110> University of Utah Research Foundation

Wittwer, Carl T

Quackenbush, John F

Houskeeper, Jessica A

<120> 极端逆转录PCR

<130> 1267.13WO

<150> 62/251,400

<151> 2015-11-05

<160> 42

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

cccattcaac gtctacatcg agtc 24

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

tccttctctt gccaggcat 19

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 突变

<222> (23)..(23)

<223> G或A残基

<400> 3

cccattcaac gtctacatcg agtccgatgc ctggcaagag aagga 45

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

ctacagtggg agtcacctgc 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

ggtactgagc tgtgaaagtc aggtt 25

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 突变

<222> (28)..(28)

<223> A或G残基

<400> 6

ctacagtggg agtcacctgc ttttgccaaa gggaacctga ctttcacagc tcagtacc 58

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

gggagtcacc tgcttttgcc 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

tactgagctg tgaaagtcag gttcc 25

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

gggagtcacc tgcttttgcc aaagggaacc tgactttcac agctcagta 49

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

ctctgtgctt tctgtatcct cagagtggca ttct 34

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

cgtctgctgg agtgtgccca atgctata 28

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 其他特征

<222> (1)..(41)

<223> 5'标准合成区域

<400> 12

acacacacac acacacacac acacacacac acacacaaaa attcagtggc attaaatacg 60

<210> 13

<211> 67

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 其他特征

<222> (1)..(50)

<223> 5'标准合成区域

<400> 13

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagaaaaa ccagagctaa 60

agggaag 67

<210> 14

<211> 66

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 其他特征

<222> (1)..(41)

<223> 5'标准合成区域

<400> 14

acacacacac acacacacac acacacacac acacacaaaa agctggtgtc tgctatagaa 60

ctgatt 66

<210> 15

<211> 72

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 其他特征

<222> (1)..(50)

<223> 5'标准合成区域

<400> 15

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagaaaaa gttgccagag 60

ctaaagggaa gg 72

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成通用引物

<400> 16

acacacacac acacacacac acacacacac acacacaaaa a 41

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成通用引物

<400> 17

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagaaaaa 50

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成通用引物

<400> 18

actcgcacga actcaccgca ctcc 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成通用引物

<400> 19

actcgcacga actcaccgca ctcc 24

<210> 20

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成模板

<400> 20

actcgcacga actcaccgca ctccggatgg attgtgaaga ggcccaagat actggtcata 60

ttatcctttg atctagctct cactcgcact ctcacgcaca 100

<210> 21

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成模板

<400> 21

actcgcacga actcaccgca ctcctcaatg ctgacaaatc gaaagaatag gaatagcgta 60

attactagag gactccaata tagtatatta ccctggtgac cgcctgtact gtaggaacac 120

taccgcggtt atattgacag cttagcaatc taccctgttg ggatctgttt aagtggctct 180

cactcgcact ctcacgcaca 200

<210> 22

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成模板

<400> 22

actcgcacga actcaccgca ctccccttcg aatataaagt acgacattac tagcaatgac 60

agttccagga tttaagaaag tagtgttcca catcaatgca tatccagtga aagcataacg 120

tcaaaaaaag cctggcaccg ttcgcgatct ggacttactt agatttgttg tagtcaagcc 180

ggctatcagc gatttatccc ggaaacacat actagtgagt tatttgtatg ttacctagaa 240

tagctgtcac gaatcactaa tacattcacc caccagctct cactcgcact ctcacgcaca 300

<210> 23

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成模板

<400> 23

actcgcacga actcaccgca ctcctgaata caagacgaca gtcctgatta tattttcatt 60

taattacgcc aatttaatta tgatgaatat taacggaatt aaatatgtat tgataagtac 120

taagtaatgg tttacccacg gcgatctata tgcaagggaa acattaacaa atttaaacat 180

ctgatgtgga caaaacttgt aatgtggtat agttaaaaat ataggtttca gggacacgta 240

agtatctatc ttgaatgttt aagtaggtcc tgtctaccat tctgaaattt agaaaatcgc 300

gttcatcggg ctgtcggcta cacctcagaa aaccatttcg tgttgcacag gaggaacttt 360

cgagggttcg tatgagctct cactcgcact ctcacgcaca 400

<210> 24

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成模板

<400> 24

actcgcacga actcaccgca ctccaccgct tgacgacgta gggtatttgg tatctgaatc 60

tactcattta cctacatact gaagattttg cgatcgtcta atatattgga ctaatgcccg 120

atttctgatc aattactcta ggcgatactt catcgctggc cttatttgga ttttgctcaa 180

gtgctaaact ctctgcgcgt caatactagt ctgacatcag tcaagacctg ctatctgaaa 240

actactagag agatatacct aacaacttta gtggataaat caggtctgga gattgtcata 300

taatgccact agggtcagaa ggctgtgtca aagttagtgg ttagtaggtc tccgctctgc 360

ggtactattc ttatattctc ttactatgca tcaaacaaaa tagaatgcat agacaaaccg 420

cctgccaagt ttacaagata acttgcgtat aggtttataa gggttcttct gtatcgctct 480

cactcgcact ctcacgcaca 500

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 智人

<400> 25

gcttggaaga ttgctaaaat gatagtcagt g 31

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人

<400> 26

ttgatcatac tgagcctgct gcataa 26

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 突变

<222> (34)..(34)

<223> A或G残基

<400> 27

gcttggaaga ttgctaaaat gatagtcagt gacattatgc agcaggctca gtatgatcaa 60

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人

<400> 28

ttcctgggca tggagtc 17

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人

<400> 29

caggtctttg cggatgc 17

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 30

tggggcaaat atgtcacgaa g 21

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 31

ccatttaagc aatgacctcg aatttca 27

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Zika病毒

<400> 32

caggttggag tgggagtcat 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Zika病毒

<400> 33

tttgtaacgt gccacatggt 20

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 34

caagacgggc gggtgtggta ggcgcccgtg 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 35

acttgatggc gggtgtggta ggcgccatct 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 36

aagaccagac aatgtacagt attggcctga 30

<210> 37

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 37

gccggccaat gtacagtatt ggccggc 27

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 38

ccggacaatg tacagtattg gcccgg 26

<210> 39

<211> 33

<212> RNA

<213> 合成序列

<400> 39

uuaccacgcg cucuuaacug cuagcgccau ggc 33

<210> 40

<211> 41

<212> RNA

<213> 合成序列

<400> 40

cuuaccacgc gcucuuaacu gcuagcgcca uggccaaaac u 41

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 41

aggtaggtga ggagacttaa g 21

<210> 42

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人

<400> 42

taaccagctg gtggtga 17

Claims

1.一种用于在扩增期间扩增生物样品中的靶标RNA的方法，所述方法包括以下步骤：

提供包含所述生物样品、逆转录酶、热稳定聚合酶和配置用于扩增所述生物样品中的所述靶标RNA的引物的反应混合物，其中所述逆转录酶以减少的浓度提供，所述热稳定聚合酶以至少0.5 μM的浓度提供，且引物各自以至少2 μM的浓度提供，其中所述逆转录酶的减少的浓度是低于制造商推荐的用于逆转录(RT)反应的所述逆转录酶的浓度；

通过温育不超过5分钟的逆转录时间将所述RNA逆转录成DNA，

将所述反应混合物快速升至37℃-90℃的逆转录温度，和

使用极端温度循环概况，通过在至少变性温度与延伸温度之间热循环所述生物样品通过多个扩增循环，经聚合酶链式反应扩增所述DNA，其中每个循环在每个循环少于20秒的循环时间内完成。

2.权利要求1所述的方法，其中所述逆转录时间不超过1分钟。

3.权利要求2所述的方法，其中所述逆转录时间不超过16秒。

4.权利要求2所述的方法，其中所述逆转录时间不超过8秒。

5.权利要求2所述的方法，其中所述逆转录时间不超过4秒。

6.权利要求2所述的方法，其中所述逆转录时间不超过2秒。

7.权利要求1-6中任何一项所述的方法，其中还向所述生物样品中加入糖。

8.权利要求7所述的方法，其中所述糖为至少0.2 M海藻糖。

9.权利要求1所述的方法，其中所述逆转录在54℃-62℃之间的温度下发生。

10.权利要求9所述的方法，其中所述逆转录步骤在56℃的温度下发生。

11.权利要求1所述的方法，其中所述引物各自以至少4 μM的浓度提供。

12.权利要求1所述的方法，其中所述引物各自以至少6 μM的浓度提供。

13.权利要求1所述的方法，其中所述扩增在与所述逆转录相同的反应混合物中发生。

14.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物具有不超过10 mM的KCl浓度。

15.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物不含钾。

16.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含还原剂。

17.权利要求1所述的方法，其中所述逆转录酶为以1.0-50 U/μl提供的MMLV。

18.权利要求1所述的方法，其中所述转录酶为以不超过4.0单位/μL的浓度提供的MMLV。

19.权利要求1所述的方法，其中所述逆转录酶为以0.1-10 U/μl提供的AMV。

20.权利要求1所述的方法，其中所述逆转录酶为以不超过0.8单位/μL的浓度提供的AMV。

21.权利要求1所述的方法，其中

所述扩增步骤具有等于所述循环时间乘以循环数目的扩增时间，

所述方法具有等于所述逆转录时间和所述扩增时间总和的总体时间，和

所述逆转录时间不超过所述总体时间的50%。

22.权利要求21所述的方法，其中所述逆转录时间不超过所述总体时间的20%。

23.权利要求21所述的方法，其中所述逆转录时间不超过所述总体时间的10%。

24.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含6-12 mM之间的MgCl₂。

25.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物的第一部分被冷冻提供和所述反应混合物的第二部分被冷藏提供，并且进一步包括在所述逆转录之前混合所述第一部分和第二部分。

26.权利要求25所述的方法，其中在第二部分中提供dNTP和MgCl₂。

27.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物的第一部分被提供第一引物和所述反应混合物的第二部分被提供第二引物，并且进一步包括在所述逆转录之前混合所述第一部分和第二部分。

28.权利要求25-27中任何一项所述的方法，其中所述第一部分或第二部分中的至少一个在混合之前离心。

29.权利要求28所述的方法，其中所述逆转录步骤在所述混合步骤完成的1秒内开始。

30.权利要求25-27中任何一项所述的方法，其中所述第一部分与所述第二部分中的一个包含所述逆转录酶，且所述第一部分与所述第二部分中的另一个包含所述热稳定聚合酶。

31.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含适配体。

32.权利要求31所述的方法，其中所述适配体以至少1 μM的浓度提供。

33.权利要求31所述的方法，其中所述适配体为RNA适配体。

34.权利要求31所述的方法，其中所述适配体为RNA适配体与DNA适配体的混合物。

35.权利要求31所述的方法，其中所述适配体用3’-封端剂修饰。

36.权利要求35所述的方法，其中所述3’-封端剂为C6-氨基末端修饰剂。

37.权利要求35所述的方法，其中所述3’-封端剂具有正电荷。

38.权利要求31所述的方法，其中所述适配体具有稳定的发夹环。

39.一种用于对RNA实施RT-PCR的试剂盒，所述试剂盒包含：

dNTP，

以减少的浓度提供的逆转录酶，其中所述逆转录酶的减少的浓度是低于制造商推荐的用于逆转录(RT)反应的所述逆转录酶的浓度，

以至少0.5 μM的浓度提供的聚合酶，和

配置用于扩增所述RNA的引物对，其中所述引物各自以至少2 μM的浓度提供。

40.权利要求39所述的试剂盒，其进一步包含糖。

41.权利要求40所述的试剂盒，其中所述糖选自海藻糖和蔗糖。

42.权利要求40所述的试剂盒，其中所述糖以0.6 M提供。

43.权利要求40所述的试剂盒，其中所述糖以0.2 M提供。

44.权利要求39所述的试剂盒，其进一步包含还原剂。

45.权利要求39所述的试剂盒，其中所述dNTP、所述逆转录酶、所述聚合酶和所述引物对以不含钾的混合物提供。

46.一种用于对RNA实施RT-PCR的反应混合物，所述反应混合物包含：

dNTP，

以至少0.5 μM的浓度提供的聚合酶，和

47.权利要求46所述的反应混合物，其中所述反应混合物具有不超过10 mM的KCl浓度。

48.权利要求47所述的反应混合物，其中所述反应混合物不含钾。